專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萊姆病螺旋體的檢測(cè)，具體地說(shuō)，涉及用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋體(Bolrelia burgdorferi)弓丨起的一種慢性自然疫源性疾病。伯氏疏螺旋體是ー種單細(xì)胞的革蘭氏陰性螺旋體。該病主要是通過(guò)節(jié)肢動(dòng)物蜱的叮咬在宿主動(dòng)物與宿主動(dòng)物及人之間傳播。萊姆病臨床表現(xiàn)初期多有典型皮膚損害--慢性游走性紅斑(ECM)，同時(shí)伴有頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲乏不適.局部淋巴結(jié)腫大等癥狀，后期表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等呈間歇性、交替性出現(xiàn)的各種損害。具有分布廣、病程長(zhǎng)、病死率較高等特點(diǎn)。如能早期診斷、早期治療?？扇?，否則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。因此開(kāi)發(fā)萊姆病螺旋體的早期快速檢測(cè)技木，對(duì)萊姆病早期診斷、早期治療具有重要的意義。目前萊姆病的主要診斷方法包括病原學(xué)檢測(cè)和特異性抗體檢測(cè)。病原學(xué)檢測(cè)包括直接鏡檢法、病原分離培養(yǎng)、多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光定量PCR(real-time PCR);常用的特異性抗體檢測(cè)包括間接免疫熒光抗體法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和蛋白免疫印跡法(WB)。直接鏡檢法需要操作者具備豐富的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，然而對(duì)于混合感染的情況，則無(wú)法檢測(cè)到，而且該法容易漏檢，與其他診斷方法相比，直接檢查的檢出率相對(duì)較低。病原分離培養(yǎng)法的分離率低，耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性差。IFA只能檢測(cè)到菌體表面的抗原，靈敏度和特異性都比較低，且IFA受實(shí)驗(yàn)因素影響大，易造成假陽(yáng)性或假陰性。ELISA主要對(duì)萊姆病特異抗體IgG進(jìn)行檢測(cè)，傳統(tǒng)ELISA檢測(cè)方法，存在非特異反應(yīng)，雖然靈敏度高，但缺乏特異性，易誤診。WB可以判斷和驗(yàn)證IFA和ELISA的真假陽(yáng)性，但由于萊姆病螺旋體有不同的致病基因型，而這幾種基因型在世界各地的分布又有所不同，因此各國(guó)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，制定出針對(duì)本國(guó)流行的基因型的WB陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)，而且WB的操作比較復(fù)雜，不利于推廣。PCR技術(shù)的不足之處在于(I)靶基因易被污染；(2)易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)増；(3)擴(kuò)增反應(yīng)易受多種因素的影響；(4)需要投入比較昂貴的精密儀器(如PCR儀、凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng))；耗時(shí)長(zhǎng)，需要2 3h的反應(yīng)時(shí)間和I 2h的電泳時(shí)間。這些均不利于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，給技術(shù)的基層推廣造成了極大障礙。2000年Notomi等開(kāi)發(fā)了一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),其特點(diǎn)是在等溫條件下即可高效、快速、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶基因序列。目前LAMP技術(shù)主要應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)，包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、寄生蟲(chóng)等，在臨床疾病診斷、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)及環(huán)境監(jiān)測(cè)方面應(yīng)用廣泛，另外，LAMP也應(yīng)用于動(dòng)物胚胎的性別鑒定、腫瘤的基因檢測(cè)及原位擴(kuò)增等。然而未見(jiàn)利用LAMP技術(shù)進(jìn)行萊姆病螺旋體檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種便于基層推廣使用的檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法。本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP引物及含有該引物的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的ー種用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；內(nèi)側(cè)反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。本發(fā)明還提供含有上述LAMP引物組的用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的試劑盒，其中所述試劑盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。前述試劑盒中還包括Bst DNA聚合酶和/或反應(yīng)緩沖液。更優(yōu)選地，前述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。本發(fā)明進(jìn)一歩提供用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，包括步驟1)提取樣品中的DNA ;2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用上述LAMP引物組，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；3)分析產(chǎn)物，即對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果判定樣品中是否含有萊姆病螺旋體。其中，LAMP反應(yīng)體系以25 μ I計(jì)為
模板DNA2μ1 20μΜ 引物FlP2μ20μΜ 引物BIP2μ! ΙΟμΜ引物F30.5μ1 ΙΟμΜ引物Β30·5μ1
8υ/μ1 Bst DNA 聚合酶Ιμ
2 X Reaction Mix12.5μ!ddH.O補(bǔ)足至 25μ1。LAMP反應(yīng)條件為59-66 °C (優(yōu)選63 °C ) 60分鐘，冰上終止反應(yīng)。用上述引物組對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，若電泳檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)梯狀DNA條帶，則該樣品含有萊姆病螺旋體，若沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，則該樣品中不含萊姆病螺旋體。本發(fā)明將LAMP引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于萊姆病螺旋體的快速檢測(cè)，可從疑似病人血清中準(zhǔn)確地檢測(cè)出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR更高，可對(duì)不同致病基因型的萊姆病螺旋體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時(shí)可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。


圖IA和圖IB為本發(fā)明LAMP引物組恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果；其中，圖IA中泳道1_5分別為萊姆病螺旋體B31、PD91、Fuji、FPU QX-S13，NC為陰性對(duì)照，圖IB泳道I為T(mén)O91，泳道2-12為8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、 布魯氏菌、大腸埃希菌共11種對(duì)照菌株。圖2為L(zhǎng)AMP引物組恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中，A1-A7分別代表重組質(zhì)粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、1.0Χ IO3Copies/ μ 1、1· OX IO2Copies/ μ 1、1· OX IO1Copies/ μ 1、1· OX IO0Copies/ μ I。圖3為普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中，M為IOObp Ladder, 1-7分別代表重組質(zhì)粒濃度為 I. OX IO6Copies/ μ 1、1· OX IO5Copies/ μ 1、1· OX IO4Copies/ μ I、
I.O X IO3Copies/ μ I、I. O X IO2Copies/ μ I、I. OX IO1Copies/ μ I、I. OX IO0Copies/ μ I, 8為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如SambiOOk等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技術(shù)規(guī)程,或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例I用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP弓I物組的合成使用B31、PD91、Fujji, FPU QX-S13共5種萊姆病螺旋體菌株進(jìn)行用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP引物的篩選。B31、Fuji購(gòu)自美國(guó)ATCC，PD91、FP1、QX-S13由中國(guó)疾控中心傳染病所分離培養(yǎng)保存。使用日本榮研l(wèi)oopamp DNA擴(kuò)增試劑盒(商品編號(hào)18001)，選取常用于 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的基因位點(diǎn)(fla、16SrDNA、rrf_rrl spacer、hbb、recA、ospA、ospC、groEL),用PrimerExplorer V4在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物并合成參數(shù)好的引物。用培養(yǎng)的B31、PD91、Fuji、FPl、QX-S13萊姆病螺旋體菌株篩選引物，相同條件下能使這5種菌株盡早達(dá)到陽(yáng)性且峰高的引物為最佳引物。本發(fā)明的最佳引物為根據(jù)fla基因設(shè)計(jì)的引物。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中找到PBi-58125 (萊姆病螺旋體Brrelia gar ini i基因型的國(guó)外參考菌株)的全基因組序列，GenBank登錄號(hào)為NC_006156，并利用fla基因的普通PCR引物(正向引物5’ -AACACACCAGCATCACTTTCAGG-3，，反向引物5’ -GATTWGCRTGCGCAATCATTGCC-3’ )在DNAstar中找出fla的基因序列，根據(jù)此序列利用PrimerExplorer V4在線軟件設(shè)計(jì)LAMP引物，微調(diào)參數(shù)，GC含量從30% -65%調(diào)整為40% -65% ;5’ 末端 dG 將-3 改為-4。最終確定用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其包括外側(cè)正向引物 F3 :5 ’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3 ’ ；外側(cè)反向引物B3 :5 ’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3 ’ ；以及內(nèi)側(cè)正向引物 FIP : 5 ’ -TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3 ’ ；內(nèi)側(cè)反向引物BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。弓丨物合成由上海生物工程有限公司完成。實(shí)施例2利用LAMP引物組檢測(cè)萊姆病螺旋體的特異性分析
I. I試劑和設(shè)備水浴鍋，LAMP試劑盒購(gòu)自日本榮研公司。I. 2樣本來(lái)源本實(shí)施例中采用的5種萊姆病螺旋體菌株、8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、布魯氏菌、大腸埃希菌(表I)保存于中國(guó)疾控中心傳染病所或中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。 表I用于LAMP檢測(cè)的樣本來(lái)源
編號(hào)_拉丁名_中文名_來(lái)源■
1B. burgdorferi sensu strict.。狹義伯氏螺旋體B31 ATCC 2B. garirrn伽氏疏螺旋體PD91中國(guó)
3B.garinii伽氏疏螺旋體FujiATCC
4B.afzelii阿弗西尼疏螺旋體FPI 中國(guó)
5B.valaisiana法雷斯疏螺旋體QX-S13 中國(guó)
6Rickettsia conorii斑點(diǎn)熱立克次體中國(guó)
7Rickettsia slovaca斑點(diǎn)熱立克次體中國(guó), η
8Rickettsia hone斑點(diǎn)熱立克次體中國(guó)
9Coxiella burnettii貝納柯克斯體中國(guó)
10Orientia tsutsu^amushi東方春蟲(chóng)病中國(guó)
11Bartonella Quintana巴爾通體中國(guó)
12Ehrlichiachaffeemis埃立克體中國(guó)
13Anaplasma DhagocytophUum無(wú)形體—國(guó)
14Leptospira spp鉤端螺旋體中國(guó)
15Brucellosis bacteria布魯氏菌中國(guó)
16Escherichia coli大腸埃希菌中國(guó)1.3 UNA 提取熱裂解法提取萊姆病螺旋體菌株DNA :將適量菌株接種BSKII培養(yǎng)基，33 °C培養(yǎng)7天，將培養(yǎng)好的菌株12000rpm離心30分鐘收集菌體，去上清；然后用PBS重懸洗滌，12000rpml離心30分鐘，PBS洗滌三遍，去上清；然后加適量ddH20重懸，100°C金屬浴煮10分鐘后3500rpm離心5分鐘，留取上清，4°C保存?zhèn)溆?。?duì)照菌株DNA采用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒(商品編號(hào)69506)提取。I. 4 LAMP 反應(yīng)
反應(yīng)體系(25μ I)
模板DNA2μ1
20μΜ 引物FIP2μ1
20μΜ 引物BIP2μ!
ΙΟμν{引物F30.5μ1
ΙΟμΜ引物Β30.5μ!
SU/μΙ Bst 酶ΙμΙ 2 x Reaction Mix12.5μ!
CidH2O補(bǔ)足至 25μ1。LAMP反應(yīng)條件為63°C，60分鐘，冰上終止反應(yīng)。I. 5 結(jié)果對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖IA和圖IB所示，圖IA泳道1-5為萊姆病螺旋體樣品，均能擴(kuò)增出梯狀條帶；而圖1B，泳道I為萊姆病螺旋體菌株P(guān)D91，能擴(kuò)增出梯狀條帶，泳道2-12為8種立克次體屬的菌株和鉤端螺旋體、布魯氏菌、大腸埃希菌，以及陰性對(duì)照(NC)均不產(chǎn)生條帶。該結(jié)果表明本發(fā)明引物組的特異性較好。
實(shí)施例3利用LAMP弓I物組檢測(cè)萊姆病螺旋體的靈敏度分析用LAMP外引物F3、B3作為引物PCR擴(kuò)增TO91的fla基因，采用OMEGA公司的凝膠 提取試劑盒(商品編號(hào)D2500-01)膠回收純化PCR產(chǎn)物。然后用Takara公司的PMD-18TVector試劑盒(商品編號(hào)D102A)將純化的DNA與PMD-18T Vector連接，16°C水浴連接4小吋，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，簡(jiǎn)稱(chēng)天根公司)中。然后將大腸桿菌接種至含氨節(jié)西林(0. lmg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，將長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別擴(kuò)大培養(yǎng)，然后采用天根公司的質(zhì)粒提取試劑盒(商品批號(hào)J9110)提取質(zhì)粒并進(jìn)行克隆鑒定和濃度測(cè)定。將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的濃度換算成質(zhì)?？截悢?shù)，采用的公式為
細(xì)樣品中檢測(cè)基因的拷貝數(shù)(οορ16φ1)=濃度(邶細(xì))樣加德羅常數(shù)Xが然后用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到I. OX IO6Copies/ μ 1-1. OX IO0Copies/ μ I,共7個(gè)濃度梯度。然后采用日本榮研公司的loopamp DNA擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)確定該LAMP方法的最低檢測(cè)下限，即敏感度。結(jié)果表明LAMP的敏感度可達(dá)到IO1c0Pies/μ I (圖2)，而普通PCR (引物為L(zhǎng)AMP外引物F3和B3)的敏感度為IO2Copies/ μ I (圖3)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作ー些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的LAMP引物組，其特征在于，其包括 外側(cè)正向引物 F3 :5’ -GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’ ； 外側(cè)反向引物 B3 :5’ -CACCAGCGTCACTTTCAG-3’ ；以及 內(nèi)側(cè)正向引物 FIP :5’ -TGCAAATCTAITCTCTGGCGAAGGITGAGCACCTTCTTGAACA-3’ ； 內(nèi)側(cè)反向引物 BIP :5’ -ACAGCAATCGCTTCATCTTGAITCTCAAGCTTCTTGGACC-3’。
2.含有權(quán)利要求I所述LAMP引物組的用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括BstDNA聚合酶和/或反應(yīng)緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
5.用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其特征在于，包括以下步驟 1)提取樣品中的DNA； 2)以步驟I)中提取的DNA為模板，使用權(quán)利要求I所述的LAMP引物組，進(jìn)行LAMP反應(yīng)； 3)分析LAMP產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，LAMP反應(yīng)體系以25yl計(jì)為模板DNA2^1 20|iiM 引物 FlP2)iii 20_ 引物BIP2pl I OmM 引物 F30.5^1 1OpM 引物 B30.5)iii 8U/4 Bst DNA聚合酶I叫 2X Reaction Mixi2.5f.ii ddH20補(bǔ)足至 25pl。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，LAMP反應(yīng)條件為59-66°C，90分鐘，冰上終止反應(yīng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，LAMP反應(yīng)條件為63°C，60分鐘，冰上終止反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)萊姆病螺旋體的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，其是采用引物FIP和BIP以及F3和B3(如Seq ID No.1-4所示)對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。本發(fā)明將LAMP引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于萊姆病螺旋體的快速檢測(cè)，可從疑似病人血清中準(zhǔn)確地檢測(cè)出萊姆病螺旋體。該方法的特異性和靈敏度均較常規(guī)PCR更高，可對(duì)不同致病基因型的萊姆病螺旋體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)萊姆病的早期診斷、早期治療等方面具有重要意義；同時(shí)可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102703587SQ20121015725
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者侯學(xué)霞, 張劉麗, 耿震, 郝琴 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所