專利名稱：靶向基因dna分子探針的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及將基于計(jì)算機(jī)的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)結(jié)合起來(lái)以制備靶向基因DNA分子探針的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組測(cè)序工程于1990年正式啟動(dòng)，經(jīng)過(guò)多個(gè)國(guó)家的數(shù)百名科學(xué)家和工程技術(shù)人員的共同努力，于2001年發(fā)表了初稿，并于2006年最后完成，歷時(shí)十六年，耗資上百億美元。這一工程的完工，將第一個(gè)也是最重要的一個(gè)哺乳動(dòng)物，即我們?nèi)祟愖约旱恼麄€(gè)基因組的圖譜展現(xiàn)在我們眼前，其中包括所有22對(duì)常染色體(1-22)和兩個(gè)性染色體(X，Y)
的DNA序列，共計(jì)大約32億核苷酸堿基。同時(shí)揭示人類蛋白質(zhì)編碼的基因大約有二萬(wàn)至二萬(wàn)五千個(gè)，其核苷酸序列的總長(zhǎng)度僅占整個(gè)基因組長(zhǎng)度的1.9%。這些基因不均等地分散分布在基因組的各個(gè)角落，參見(jiàn)圖I。此外，占基因組絕大部分的堿基是一些有序或無(wú)序的重復(fù)序列，有些重復(fù)序列具有明顯的規(guī)律，比如，5-8個(gè)堿基循環(huán)出現(xiàn)構(gòu)成到100-200個(gè)堿基的集團(tuán)，然后這個(gè)集團(tuán)又在不同的基因組中出現(xiàn)，由于此類DNA堿基可以在任意(無(wú)規(guī)律)基因組DNA中出現(xiàn)，如圖2，因此，如果所制作的進(jìn)行雜交的DNA分子探針中含有此類重復(fù)序列，則信號(hào)會(huì)在所有染色體基因或細(xì)胞中出現(xiàn)，所得結(jié)果就被混淆，這類雜交信號(hào)即被稱為干擾信號(hào)或背景信號(hào)。因此，如何去除這些重復(fù)片段，成為一個(gè)問(wèn)題。隨著人類基因組測(cè)序工程的完成以及后基因組時(shí)代的到來(lái)，生物醫(yī)學(xué)的科學(xué)研究和技術(shù)發(fā)展進(jìn)入了一個(gè)前所未有的新時(shí)期，這對(duì)醫(yī)療保健的發(fā)展和進(jìn)步提供了空前的機(jī)遇，對(duì)生物醫(yī)學(xué)高科技的研究和應(yīng)用也提出了巨大的挑戰(zhàn)。生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究也不再是一個(gè)獨(dú)立的概念，而是時(shí)時(shí)刻刻都與醫(yī)療保健相關(guān)聯(lián)。如何將基礎(chǔ)研究的成果用于臨床？如何開(kāi)展具有明確醫(yī)藥用途的科學(xué)研究即基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化性的研究(transitionalresearch) 是目前每一位生物醫(yī)學(xué)研究人員都在考慮的問(wèn)題。由于基因的異常與多種疾病都相關(guān)，例如腫瘤，心血管疾病，遺傳病，中樞神經(jīng)退行性疾病，視網(wǎng)膜黃斑變性，血液病，代謝營(yíng)養(yǎng)性疾病，自體免疫性疾病，內(nèi)分泌性疾病如糖尿病，等等。另外，對(duì)于傳染性疾病，如病毒，細(xì)菌感染，也要研究其基因結(jié)構(gòu)，表達(dá)方式及蛋白產(chǎn)物，才能深刻地理解疾病的發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，才能進(jìn)行更好的治療，又如愛(ài)滋病(人類免疫缺陷病毒，Human immunodeficient virus, HIV),乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV),結(jié)核病(tuberculosis, TB)等等。在疾病的診斷上，用基因及其產(chǎn)物進(jìn)行診斷，包括腫瘤(人類基因)和感染性疾病(微生物基因)，已顯現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。其結(jié)果更加準(zhǔn)確，迅速，安全，可靠?；蛟\斷亦稱分子診斷，是由人類基因組序列工程與其它致病性病源微生物和病源體的基因序列弄清楚以后所衍生出來(lái)的診斷領(lǐng)域，其歷史雖然不長(zhǎng)，已顯示出強(qiáng)大的生命力。其發(fā)展速度非?？?，其范圍也囊括幾乎所有醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前臨床上已在使用的，以感染性疾病，腫瘤及心血管疾病最多。其中腫瘤病理學(xué)的“分子診斷”是一個(gè)重要的分支。根治腫瘤仍然是一世界性難題，但針對(duì)致癌基因的“靶向治療”是目前最有效的腫瘤治療戰(zhàn)略之一。配合靶向治療的“伴侶診斷”是目前國(guó)際上最新的腫瘤分子診斷方法。它通過(guò)對(duì)疾病分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)靶向治療中病人的篩選及預(yù)后的觀察起關(guān)鍵性作用。在過(guò)去的60年里，有關(guān)DNA的技術(shù)層出不窮，使得對(duì)DNA的檢測(cè)成為可能，比如于1969年發(fā)明的熒光原位雜交(FISH)技術(shù)(Gall and Pardue，PNAS 1969)，1972年發(fā)明的分子克隆技術(shù)(Cohen, Chang and Hsu, PNAS 1972)以及 1985年發(fā)明的PCR技術(shù)(Saiki RK etal, Science 1985; Jeffreys, Wilson and Thein, Nature 1985)等等。此外，伴隨人類基因組測(cè)序工程的進(jìn)展，為了能夠充分的分析，研究，分享和應(yīng)用DNA序列的成果，計(jì)算機(jī)軟件及基因網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)得到了很好的開(kāi)發(fā)。比如，1990年發(fā)明的基礎(chǔ)局部搜索DNA同源序列的工具-比較基因組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)BLAST (Altschul SF et al, J. Mol. Biol. 1990)和2002年開(kāi)始運(yùn)行的UCSC基因組瀏覽器(Kent WJ and Colleagues, Genome Res. 2002)，都是很好的研究應(yīng)用工具。這使得任何研究人員都能夠再次利用并開(kāi)發(fā)和發(fā)展DNA序列，并將其用到實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中。本發(fā)明的靶向基因DNA分子探針的制備方法就是在分析，比較和應(yīng)用以上這些技術(shù)的基礎(chǔ)上誕生的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供將基于計(jì)算機(jī)的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)結(jié)合起來(lái)來(lái)制作具有特異性序列的DNA分子探針的方法，制備出的DNA分子探針能夠與整個(gè)靶向基因的所有特異性DNA序列進(jìn)行DNA-DNA雜交，起到準(zhǔn)確探測(cè)、識(shí)別疾病基因和正常基因的作用。DNA分子探針的制備方法包括兩大程序
_6] 第一程序利用基于計(jì)算機(jī)的生物信息學(xué)手段來(lái)獲得靶向基因的特異性DNA序列，并設(shè)計(jì)出相應(yīng)PCR引物第一程序包括以下步驟(I)在公共基因庫(kù)上搜索到靶向基因的基因組位置，然后識(shí)別出該靶向基因的編碼序列和非編碼序列(即外顯子和內(nèi)含子的區(qū)域)，剔除掉其中的非特異性重復(fù)序列，獲得覆蓋整個(gè)靶向基因的特異性DNA序列，該特異性DNA序列為不連續(xù)的多個(gè)DNA片段；位于外顯子的編碼序列一般都是特異性序列，即該基因所特有的(在少數(shù)情況下，有些基因的外顯子編碼序列也會(huì)與其同一家族的其它基因序列有非常大的同源性，應(yīng)有所注意，在設(shè)計(jì)探針時(shí)因避免使用)。位于內(nèi)含子的非編碼序列又分成特異性序列和非特異性序列，前者是該基因所特有的，在制作探針時(shí)應(yīng)當(dāng)保留，后者一般由有序或無(wú)序的重復(fù)DNA序列構(gòu)成，在制作DNA探針時(shí)應(yīng)當(dāng)去除。下面列出的一些重復(fù)序列，在基因組的許多基因內(nèi)含子的區(qū)域中都存在，應(yīng)當(dāng)避免用在探針里。重復(fù)序列I : tgaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct重復(fù)序列2 aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac重復(fù)序列3 catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc重復(fù)序列4 ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt重復(fù)序列5 cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtgaagtggtagatatattaattagtttgatttgatcactccgctatgtgtataaatgtcaaaacaaacattg重復(fù)序列6 ·
taggaaagtgattggcttttgtatgttaacgttgtatcctgctcacttgctataactgcttattagttccaggagcttttttattgtttcttttggattttctaagagacaattacattatcagtgaacaaacacgatttatttcttccc重復(fù)序列7 ctttgttcctgattttagctataggtttttgtagctgttctttattaagttgaggatatccttctctattcttagtttgctgagaatttttatcatgaat重復(fù)序列8 aggtaattctggcttcacaaaattaattatggagtcttccctctacttctagtttctggaagagattgtagagaatggatgtaatttctttcttaaatgt重復(fù)序列9 ttctttcatttctgatattcataatttgtgtattctctctttgtttcttagcctggtgagaggcttataaattttattgattttttgaagaatcactttttggttttgctgattttcttgctgggattataggcgtgagccaccacactc重復(fù)序列10 :aaaaagtccaggcattagctaggactgtgcctgtagtcccagctactcaggaggctgagatgagaagatcaccggagcctagaaatttgaggctgcagtgggctgtgatcatgtcacttcactcctgcctagaagacagttagaccctgcctctaaaataaacaagcaaataaataaaaagaaaggaagaaaagaagagcaagggcagcaaatagaaaatagtaataaatatggtagctattaatccaactatgtcaataattaccttaaatgttagtggtctaaatatactgcaatgga在確定并去除了非特異性重復(fù)序列后，將靶向基因的特異性DNA序列包括編碼和非編碼的特異性DNA序列下載下來(lái)，此時(shí)這部分的DNA序列由于去除了其中的非特異性片段，則成為不連續(xù)的許多大小不同的DNA片段，有些基因可能包含一百多個(gè)特異性DNA片段，如人類PTEN基因即含有126個(gè)長(zhǎng)度在150bp-4666bp的DNA特異性片段。(2)在得到靶向基因的特異性序列片段之后，再利用網(wǎng)上提供的公共引物設(shè)計(jì)工具或利用其它非網(wǎng)上的計(jì)算機(jī)軟件，給靶向基因的特異性DNA序列中每一個(gè)DNA片段設(shè)計(jì)出成對(duì)PCR引物，引物長(zhǎng)度為18-25個(gè)堿基，至此完成了第一程序的工作。在第一程序中，在確定好特定靶基因的前提下，用基因數(shù)據(jù)庫(kù)(genebank)中的工具(實(shí)際上是網(wǎng)絡(luò)中的軟件，也即生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)方法)來(lái)發(fā)現(xiàn)并確定該特定基因的DNA序列，比如在哪一個(gè)染色體上，整個(gè)基因在該染色體上的跨度范圍和大小，其中有沒(méi)有非特異性重復(fù)序列，有多少，在其上游和下游有沒(méi)有其他基因存在，離其有多遠(yuǎn)等等，然后將該基因及其兩邊一定范圍內(nèi)的DNA序列下載下來(lái)，在下載的同時(shí)，識(shí)別該基因序列中所含的非特異性重復(fù)序列(repetitive sequence),因?yàn)檫@些序列可在其他染色體的多個(gè)部位存在，是造成非特異性雜交信號(hào)的主要原因，因此，必須踢除它們。由于重復(fù)序列甚至在同一個(gè)基因序列中多處存在，必須一一剔出，結(jié)果使我們最終得到的特異性DNA序列成為多個(gè)小的DNA片段。目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有人用這種方法來(lái)獲得某個(gè)靶基因的、不含任何非特異性重復(fù)序列的，非常純的，能覆蓋整個(gè)靶基因的基因組DNA序列，這屬于本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)。第二程序是在第一程序的設(shè)計(jì)和指導(dǎo)下，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)的手段將DNA分子探針實(shí)際地制造出來(lái)第二程序包括以下步驟
(I)以正常組織的基因組DNA為模板，利用第一程序的步驟(2)中設(shè)計(jì)出的PCR引物，用PCR方法擴(kuò)增出第一程序的步驟(I)中確定的靶向基因的特異性DNA序列，擴(kuò)增出的特異性DNA序列含有靶向基因的所有特異信息；(2)利用擴(kuò)增出的特異性DNA序列制造特異性的DNA分子探針，該DNA分子探針能夠與整個(gè)靶向基因的所有特異性DNA序列進(jìn)行DNA-DNA雜交。第一步確定序列并剔出重復(fù)序列，1-2天，設(shè)計(jì)引物，1-2天；第二步PCR擴(kuò)增目的基因1-2天，其實(shí)這時(shí)的步驟(I)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物已經(jīng)能夠直接用來(lái)標(biāo)記探針和進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)了。但為了建立穩(wěn)定的探針來(lái)源，使其永久地，不斷地提供探針，將步驟(I)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物克隆，即將步驟(I)中擴(kuò)增出的特異性DNA序列中每一個(gè)DNA片段均克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體上，克隆的質(zhì)粒用作永久、穩(wěn)定地特異性DNA序列來(lái)源，用PCR方法多次連續(xù)擴(kuò)增所有質(zhì)粒中克隆的DNA片段，其中每次擴(kuò)增后的產(chǎn)物均進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行下次擴(kuò)增，連續(xù)三次，最后一次擴(kuò)增的產(chǎn)物即為未標(biāo)記的DNA分子探針。裝在質(zhì)粒載體中的DNA比PCR產(chǎn)物DNA要穩(wěn)定得多，將永遠(yuǎn)不會(huì)降解或丟失?？寺∵@一步大約需1-2周時(shí)間，再加上第一程序中確定序列并剔出重復(fù)序列需要1-2天，設(shè)計(jì)引物需要1-2天，以及第二程序中PCR擴(kuò)增目的基因需要1-2天，這樣總共只需不到3周的時(shí)間就可以建立某個(gè)靶基因的DNA探針的永久貨源。而且，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增可以大規(guī)模進(jìn)行，比PCR方法的產(chǎn)量和穩(wěn)定性都要好，而且成本要低得多。本發(fā)明特異性強(qiáng)、周期短、效率高、成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)探針、促進(jìn)試劑盒的產(chǎn)業(yè)化、用于各種疾病分子病理診斷。在將DNA片段克隆到質(zhì)粒中后，經(jīng)小量擴(kuò)增提取質(zhì)粒中插入的DNA片段，進(jìn)行鑒定，保證正確后，擴(kuò)增大量提取質(zhì)粒DNA?？寺〉馁|(zhì)粒將會(huì)提供永久的DNA來(lái)源。待所有DNA片段都獲得克隆之后，每個(gè)克隆的質(zhì)粒按插入片段的大小分別取出一小份混合到一起，在該質(zhì)粒的插入片段的兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物，或用質(zhì)粒載體所特有的引物，比如M13引物或T7和SP6引物，用PCR的方法同時(shí)擴(kuò)增所有的插入片段，其產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物的大小范圍與最初確認(rèn)的DNA片段的大小范圍應(yīng)當(dāng)一致，或者對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序保證所克隆片段的正確。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)I :1000稀釋后，再次用PCR擴(kuò)增，總共三次，以達(dá)到穩(wěn)定的產(chǎn)物。最后一次PCR的產(chǎn)物就作為未標(biāo)記的探針。此次PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后，用TE緩沖液(IOmM, pH 8. 5)按每批所需要的量分裝后，儲(chǔ)藏到_20°C冰箱。在第二程序中，將第一程序獲得的靶向基因的特異性基因組DNA序列(genomicDNA sequence of targeted gene,已不含有非特異性重復(fù)序列，或僅含有微量成分,小于0.1%)，純度達(dá)99. 9%，用分子生物學(xué)的分子克隆的方法，將每一個(gè)上面純的DNA序列都克隆了，所得結(jié)果，我們將獲得與眾不同的，已經(jīng)過(guò)處理過(guò)的，包含靶向基因所有特異信息的DNA片段。用這一 DNA (含多個(gè)小的DNA片段)來(lái)制作特異性很高的DNA探針(其特征是雖然由多個(gè)小的DNA片段組成，但合起來(lái)覆蓋整個(gè)靶基因)，用于疾病如腫瘤病理分子診斷，即在病理組織細(xì)胞切片和細(xì)胞涂片上的原位雜交方法的診斷包括熒光原位雜交和非熒光的顯色原位雜交。該DNA探針不同于其他種類的探針，不是RNA探針(RNA-RNA雜交)，也不是cDNA探針(cDNA-RNA,或cDNA-DNA雜交)，也不是僅僅與基因組DNA中的靶基因的某個(gè)特定編碼序列的雜交，而是與整個(gè)靶基因的所有特異性DNA序列的DNA-DNA雜交，包括編碼序列和非編碼的特異序列。本發(fā)明用克隆的辦法加上測(cè)序，保證了所做的探針的序列準(zhǔn)確無(wú)誤，并且通過(guò)質(zhì)粒的擴(kuò)增，可得到大量且穩(wěn)定的DNA探針來(lái)源，一旦做好以后，將給標(biāo)記探針永久提供DNA模板，且保持序列不會(huì)改變，而且本發(fā)明在第一程序的步驟(I)中就將非特異性重復(fù)序列剔出了，因此不需要反復(fù)抽提和FISH的測(cè)試(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)1、2、3)，本專利方法周期短，成本低，適合于大規(guī)模生產(chǎn)探針。


附圖I顯示了基因組中基因分散在不同的區(qū)域中，基因和基因之間有大片的非基因區(qū)段，圖示人類Y染色體0-59Mbp區(qū)段中散布著19個(gè)基因，每個(gè)基因之間有較大的空間。附圖2為本發(fā)明所列的重復(fù)序列I (200bp)作為問(wèn)訊DNA序列到基因數(shù)據(jù)庫(kù)去掃描后，所得結(jié)果顯示，在人類基因組中有為數(shù)眾多染色體在不同程度上都與這一重復(fù)序列有同源性(74%-100%)，其部位與長(zhǎng)短大多沒(méi)有規(guī)律，這是引起DNA-DNA雜交的主要背景來(lái)源。附圖3為DNA靶向分子探針技術(shù)的總體路線圖。附圖4為pCR 2. 1-T0P0 質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn)DNA序列圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。具體實(shí)施例人類PTEN DNA探針的制作人類 PTEN (Phosphatase and Tensin homo log deleted from chromosome ten)基因是一個(gè)腫瘤抑制基因，是繼P53之后第二個(gè)在腫瘤中最常發(fā)生突變的基因。該基因在正常胚胎發(fā)育和保持染色體的穩(wěn)定性方面起非常重要的作用。該基因在許多疾病的病理發(fā)生上起非常重要的作用，例如糖尿病(diabetes)，呆小癥(autism),以及幾乎所有腫瘤均有關(guān)，已明確的腫瘤有神經(jīng)膠質(zhì)瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，肺癌，前列腺癌，子宮內(nèi)膜癌，神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和黑色素細(xì)胞瘤等等。參見(jiàn)圖3，整個(gè)制備方法包括兩大程序，具體實(shí)施如下一、特異性DNA序列的獲取，引物設(shè)計(jì)我們研制的PTEN基因探針，位于第10染色體長(zhǎng)臂第23條區(qū)帶(10q23)覆蓋包括整個(gè)PTEN基因組位點(diǎn)在內(nèi)的大約320kb的基因組區(qū)段，經(jīng)過(guò)反復(fù)整合及篩選，去除非特異性DNA序列，最后選擇大小不等的多片段基因序列(從150bp到4666bp)，總的片段數(shù)目達(dá)到126個(gè)，其凈長(zhǎng)度為112kb。下表顯示了 PTEN基因片段的組成
權(quán)利要求
1.一種靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于包括第一程序，其利用基于計(jì)算機(jī)的生物信息學(xué)手段來(lái)獲得靶向基因的特異性DNA序列，并設(shè)計(jì)出相應(yīng)PCR引物； 第二程序，其根據(jù)第一程序的設(shè)計(jì)應(yīng)用分子生物學(xué)手段來(lái)制造DNA分子探針；所述第一程序包括以下步驟 (1)在公共基因庫(kù)上搜索到靶向基因的基因組位置，然后識(shí)別出該靶向基因的編碼序列和非編碼序列，剔除掉其中的非特異性重復(fù)序列，獲得覆蓋整個(gè)靶向基因的特異性DNA序列，該特異性DNA序列為不連續(xù)的多個(gè)DNA片段； (2)給靶向基因的特異性DNA序列中每一個(gè)DNA片段設(shè)計(jì)出成對(duì)PCR引物，引物長(zhǎng)度為18-25個(gè)堿基； 所述第二程序包括以下步驟 (1)以正常組織的基因組DNA為模板，利用第一程序的步驟(2)中設(shè)計(jì)出的PCR引物，用PCR方法擴(kuò)增出第一程序的步驟(I)中確定的靶向基因的特異性DNA序列，擴(kuò)增出的特異性DNA序列含有靶向基因的所有特異信息； (2)利用擴(kuò)增出的特異性DNA序列制造特異性的DNA分子探針，該DNA分子探針能夠與整個(gè)靶向基因的所有特異性DNA序列進(jìn)行DNA-DNA雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于在第二程序的步驟(2)中，將步驟(I)中擴(kuò)增出的特異性DNA序列中每一個(gè)DNA片段均克隆到一個(gè)質(zhì)粒載體上，克隆的質(zhì)粒用作永久、穩(wěn)定地特異性DNA序列來(lái)源，用PCR方法多次連續(xù)擴(kuò)增所有質(zhì)粒中克隆的DNA片段，其中每次擴(kuò)增后的產(chǎn)物均進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行下次擴(kuò)增，連續(xù)三次，最后一次擴(kuò)增的產(chǎn)物即為未標(biāo)記的DNA分子探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于在用PCR方法第一次擴(kuò)增所有質(zhì)粒中克隆的DNA片段時(shí)，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物的大小范圍與第一程序的步驟(I)中確定的對(duì)應(yīng)DNA片段的大小范圍應(yīng)當(dāng)一致，或者對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序保證所克隆片段的正確。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于設(shè)計(jì)靶向基因?yàn)槿祟惸[瘤抑制基因-PTEN基因，通過(guò)第一程序的步驟(I)獲得的特異性DNA序列為126個(gè)長(zhǎng)度在150bp-4666bp的特異性DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于 PTEN基因的特異性DNA序列中一個(gè)DNA片段的序列為CATGAGGTGGTATTCATTTATTCATATAGTTAGAACAAAAAATATTTAAAATATTGAGGTAGAAACAAATTAGTCTCTTTTTAATTAAAAGCCAGATTACTTGTTAGAGTAACATTTTCCCAAATGAGGTAAAATTGTTGCGACTGTTAAACTTAAGGAAATTTTGATCTAGGTGTGGTATATACCTTCTTGTGGGGTGCTAATGAAAACAGGGATGGCAAAAATATTTTGTTTGTGAGTGTATGCATTTATGCTTTTTGACAACCTAAGAAACACTCTTACATCTGAGTATCTTTCATGGACTAGCTGTAGGAAATCTATATAAAATAGCTTAGTATACTGAAAGTATGACATAGTTTTACATATCTAGATTGTGGTTGTGATTATATATAATACTATAAAATATGCTAACGTGCTGCTTAATAATACTATTTGGATTTTTTTTAATACTGAAAAGGTCACACAGATTGTGATTATTGTGTAGTGTCCAAGAACTAAGGCCTACCATCTGTTACTCAAATGTATGAAAAAGTTAAGATAATTTAGTGATATAAGTGGTTTTGACACCACTGTTTTTGGAATAATCTAATTATGATTTTTATAAAGACTAATATCAAATTTTAAACGTTTGCAAAAATGAAACCTAATAGTTATACTGTTATTTATATTTTTCTATTACAATACAGATACTGGCTGAGAACTAAAGATTGTGTAATAAACGCCTGGCCTTCAGTCATTTGGTTTTTTTTTTCCCTCGATTGTTTGGATAGTTAACTGGACATCATGTTTTAACTTGAGAAATTAAGTTATACAAGATTTTGATATTTTAAACTAGTTTTCCTAACTGGTTGAGATATATAAGAATTTAGTATTACAGGACTCAATCAGGGAACTGATTTAATAAGAATTTCTTAAAAATTTGTTTAAATATTTTTCAAGTTCTTTTCTTCATCTTCTACAACTTAATTCTTGTCTGTATGCAAATGAGCTTCCCCATTTAAAATTTTGCTGTTGCATTTTAGGCCACTATAGAAGTTGTTTCTTTAATTTTCACTCACAAGAATTTGGTCTTACCAAATTGTGTAAATCTTTAAAATTGTGTATTTGGCTTAATATTATAGAATCTGATTGATTTAATCTACCTTGTTTCATTTAGTATGTTGACATTTTCTTGAGAAATTTGTTATGCCAAATGATTAACATAATAATATTTTAAGTTTAGATATGATTTTGAATTTACATTTTCAAATGCAACTTTGTGTCTGTGGCC 由此設(shè)計(jì)出兩對(duì)PCR引物，其中一對(duì)引物的序列如下正向引物5’ -AAACGCCTGGCCTTCAGTCA-3’逆向引物5’ -GGCCACAGACACAAAGTTGCAT-3’ 另外一對(duì)引物的序列如下正向引物5’ -GGGTGCTAATGAAAACAGGGATGGC-3’逆向引物5’ -CCAAATGACTGAAGGCCAGGCG-3’， PTEN基因的特異性DNA序列中另外一個(gè)DNA片段的序列為GCTAGTAGTTTTTAAAGTAATCCTTTTTCCTTTAATTATGTAGTTGTTGAACTGTTGGGAGTTACTTTTCTCTTACTATTTTGTTATTTAATGTATTCTTTGACCTTATGCTTTTTTATTCTAAAGCTGCTTTTATTATAGTCAGATATGATGAAGTTAAATGTACAATGTAAAATTGCAAATTTCCAACGAGCTATACAAACTTAAATATTTCTAAGTAAAGAAAATAGGGCTGACTCTAAGGTTCTTTGATCCATGTGTTGCATTCTTTTCTAGGCCCTAAATTTGCTATGCCAGCCTGTTGAATTAAAGTGCTTTATTTATCTAAATTAGAAACTTGTATTAAAGTGAAGTTTTAGAAAAAAAGAAACAAAATCGGAATGGAGTTTTAGGTTAGCCCAGAGATGGGAAGATGCCAAGAAGGTAGCTTTAGTGGATTCTGAATTTTTTGGTTTTGTTTTGTTTTTAGGGCAGGCAAATGTAATTACAAAAGGGTTCTAGGAATAGATTGCTGTGATTTTTTTTCTGTTTGCATGATTTTACAGTTTGCTTTGCCTCTCACTTTTGAATGCAGAATAAAATGTCAAGGCCTTATTTTTTTTTAAATTCTTAAGAAATTTAAGATTTGACTGTTAATTCCTTTTGAAATATGGGATATTTTGAGATACCAATTATTTAAGACAAATAGGACTCATTGTTACAATTCAGTTGAATAAGGCTTATGATGTTTATTTCAGTATATGAATGAAAACTATGTGCTTATTGTACTTAAGAAAATTTCTTTTATTAAAAACATGACTAAAGAGAATTTTAAAAATCACCCACTGTCCTACTTCTCTAAAACTTAATGTTTTCATATTAGCTTCCAGTTTTGTTCATATGCATATACTTTAAAACCTAGTTCATGGTGAACTTAAGAGGGTGTTCTTTTTAAAAAACAATTTCCATTGCACTTTGTCGTTGCCTTAATTAAATGGTGAAATCATCAGAAATATTTATTTTCCTATACTTATACATTTATTAAGCTTGTTTCCATTTTTTTATTTTGTGATTTTTTAAGTGGATTTAAGATAACCTAAACATTAGAGAGGATTTTCATGGTTTTGATTCATGAAATCATAATGTTATACAAACCTAACTGAAGTGTTAGAGCCTTGAAGATTTTTCCCCCGAATTACATATAGTAACTCTACTTGTATTTAATACTGAAAGCATATTTTACTTATTTAAGTGAGACAAAGTAAAATTTAGCTGAATACTTTAGATCTATCATTTCCTTTTCCTGTTGTAAGAACATTACATTGTGTTGAAATTAAAGTGGATATAGAAGGTAATTAGAATAAACTGCCACATCATTTTTATAGTAAAGTGGTAATAACACTATTGCTTTCTGTTTTTTTAATCAGAAGGAGTATGGGCTTATAATGATGTTACTGTTCCCTGAAGCATATTTTGAATGATACGGTTTATATTTGCACAGTTGCCCAGGTAATCATTGTGATATTAATTGATCAATTTGCTATTTATTTGCGTTTTAAATCAGTACTAGTATTTGTGCTTAAAAATTTTGCATATGTTTTATCAGATTTAATTTTTAAGTGTCAGATACTAAAACAAATAACCTTAAC由此設(shè)計(jì)出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -AGCCCAGAGATGGGAAGATGCCA-3’逆向引物5’ -AGGCAACGACAAAGTGCAATGGA-3’， PTEN基因的特異性DNA序列中第三個(gè)DNA片段的序列為ACGAGAAACATCTTGCCAATTTTCAGATTAATCTGTGAGGAAAGTAGATTGGTTTACTAGACTCAGTTTGTAGACTTTGGTGAGAACTGAATTGGAGGCTATGAAAAAAATACCTTTTGGGCCTTTCTGAATAGACATATATACATAAATTATATCTCTTACATTAAGTGAGGCACATATGTAGGTGAGATTTTTACCTGAATATTAAAAGTTTAAAAGTCGTTACCTATTCTGTTTACTTAATAGTATTTAAAGGGTGTGAGAGGTGTTATGTGTTTCTGTCCCTTGTTTTTATTCCTATCCCTCCCATCTAACTGTTGGTACTCTTATCTTCCCAGGTATTAAACTTGTATGTTTTAAAAGCTTATTTACTTGTTGAAATGGTTAACTTAATTAGTTTTTTCTTTGAAGTTTCAGCCTAAATATTTTCTGTTTTTTTATATGTCCTTTAAATATGAAAATTCTACAGCTAATCATAATTAGTAATTGTACTTTTTCCCCTATTACAATAACTGGTTTCAT AATAAAATGGTATCCCTTCAATAACAAGCATTTATAGTAGTTTATTAAAACTAAGGGTGTTATCTATTCAAACCAAGCAATGCAGACTTACTGTTGACTCTG 由此設(shè)計(jì)出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -TGGTGAGAACTGAATTGGAGGCT-3’逆向引物5’ -ACACATAACACCTCTCACACCCT-3’， PTEN基因的特異性DNA序列中第四個(gè)DNA片段的序列為TAAATTTTGATTGTTATTAGCAACTATAAAAGTTTTGCAGTTGGCTTATTGGAAAAAGAAAACCTCCTTGCCGGAGACGGAGACGCATTTGTATTAGAACTTTGTTTTCTGAGTACCTTACCTATAGTAGGTTTCAAATATTGGTGAATTAGTTGATGGTTAGGTCTGCATAATTACTGCGTATGGAAATTCTGGAACCCTATTTTTTCAAAATGCAGCTAATGTTGAGAGAATATGCACTAAATATTACTAGATCTTTGTTTTTCAAGATGCTGATATCCCTTAACATCTTCTGCACTTTACCTGTTTGAATATCTTTTTTGCTGTAAAAATTAGTGGCCTTATGTCTTTCTGCATAATTATAGAGTAGCCAAAACCTGTTTTAGGTTAATCACCTCTGGCAAAATAAATGATAAAAGCATAGCTTTTGTAAGCAGAATGATATTACAGAAGTTAACTTATAAATCTAAGTGTATTAAAGACACTTAGGAAATTTATGATAATGCTGGGTCAGCATTACAGTTTTAACTTTTTACAGTTTTTCATATGCTTTTTTTGTGATTTTGCTGTAGAAAATTAACAGTTGGCATTTGGCTTAGTTCAAGTATAATGCTGTTGACAAGTATATCTGACACGTCATTGAACTAATAATATTTTTGAAAGCTGATAGGTAAGTTATATCTATTTTGTTTCATTCGTCATTAGTGATCGGTCTTAGATGTTTTTAGCGAGAGCAAAACTGTAGAGGAA由此設(shè)計(jì)出的PCR引物的序列如下正向引物5’ -AACCTCCTTGCCGGAGACGG-3’逆向引物5’ -TCCTCTACAGTTTTGCTCTCGCT-3’， PTEN基因的特異性DNA序列中第五個(gè)DNA片段的序列為GACAAATTGTTCTTAAATAATGAACAGTTGGCACTTTTTCAACTGGAAAATTCAAGGAACTGCTCTTTCTGCTTTCTGCTCAATATGAATCTTCAATTTAGAAATGAGAGTCCATCATTAACAATTCAACATAGCTTATTAATAGGAAAAAAAAACCTAGTAACAAATGTAAAATCTTTGATTAAATGAGAAAGTCATAGAAGTTCATCAGATTTGTATTTAAAGCATGATTTCATTAGAAAAGTTGATAATAAGGATTTAACTGTGACATAATTGGAAAATACTTGTTTAAACTTAAAATTTTGAAAAGAAATGTAAATGTGATGTAACTTATGAATCAGTGGTTGAGTTTCTTTTTTGCTCACAAGAACCCTAACTGTGTGTTACTTGAAAGCACTGATGGAAATCAGGGAAAAAGCTCCAGAAGTTCCTACGAAATAAAATTAAATGATAAAGTCCTGGTATCTGCTAACTTGCCTTCCATTCCTGTTATCTTTTCTTCTTAGTCTGACTTCATTAATTCTTTCACCCTGGCTACTGGTTTAGCTCAGTGTTTTATGAGCCAGGCAGCTTCAGACTTTGCTTTTGATGCTCTTTGTTCATTACCTCTAAAGCTGTATTATCACTTTCATTTTATCATTAATGTTTCATGTATATGTTATAGTTTCATATTGTTACTGCAACTTTTACTTAGCTATAATTTAAAAAATATCTGTGATCTGTGGAAATAATTATTCTATGGCAGAAAAGTAGTTATTGCATTTTACTTTATAAGTTGTTTAAGGATAAGCATACCTATATATTAAGCACTACAAAGAAACTTTTACAATGGCTTTATTTTTAGCAAACCATCATAGTTAAAATAAGATTTAGTGTACATGTCAGGAACACAGTCTTATGAAATAAGGTTTAGGGAGCTATTTTTAGTTACTATATCCTACTTGAAAATTGTAGTTAAATTTCTAGCATATACCCTATTAATTTAGATGCAAGTACAGATTTGAGATAAGGTAGATACATTATTTGGATGTCAACTCGGAAGTTGTTCAAGAAAAGATATTTTGTTATTTAGATGTAACTTGGAACATATTTCTAGTGTTTCAAGTCATGATTGTATGCCTAGAACAGGCAATAAAAATTTACTTAGCTGGTAAAACAGCCACATTATTTCAAATATAGTTTAGTTATATTATGGATTAAATTGATTTTTGTGGACAGACTTTAGAACTTAATTGCTATTAATTACATTTTTTCTTTGGGACGGTATTTGTTCTTTGGTGAGAAAGGATTCTTGTAACACCTAAATCAAGACTGTCCAAACAT 由此設(shè)計(jì)出的PCR引物的序列如下 正向引物5’ -GGAACTGCTCTTTCTGCTTTCTGCT-3’ 逆向引物5’-GCAAAGTCTGAAGCTGCCTGGCT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于 在所述第一程序的步驟(I)中，剔除掉的非特異性重復(fù)序列能夠?yàn)閠gaatttcccagcctccagaactatgggaaataaatttctgttgtttacaagtaaatcattttatgttattttgttacagaagcccaaaaagatgaagacatacaccagatcactccattctcttcttgcttgcatggtttctgaggatacgttggatgtaattctaatattctctataggtattttctttatggctcct或aagctccagtatacctaaacaagtgcaaatttgtttaagtacagttatttgtggtagcattagtcattgttttcaatagcaagaagaaaaaggaaacaac 或catcaaaaatcggttaccataaaatcctaatagttgaagagatgtaatttcaattatttggtaaacctgaccttcattgtcaaagc 或ttttcctgtgtctctgcaaccacaggcccctctcctttctcttaataaagataccagtcattgagtttgaaaattgctaagagagtctgttgtaaatctt 或cttagcacaaaaaaaaatgacagatatgtgaagtggtagatatattaattagtttgatttgatcactccgctatgtgtataaatgtcaaaacaaacattg 或taggaaagtgattggcttttgtatgttaacgttgtatcctgctcacttgctataactgcttattagttccaggagcttttttattgtttcttttggattttctaagagacaattacattatcagtgaacaaacacgatttatttcttccc 或ctttgttcctgattttagctataggtttttgtagctgttctttattaagttgaggatatccttctctattcttagtttgctgagaatttttatcatgaat 或aggtaattctggcttcacaaaattaattatggagtcttccctctacttctagtttctggaagagattgtagagaatggatgtaatttctttcttaaatgt或ttctttcatttctgatattcataatttgtgtattctctctttgtttcttagcctggtgagaggcttataaattttattgattttttgaagaatcactttttggttttgctgattttcttgctgggattataggcgtgagccaccacactc或aaaaagtccaggcattagctaggactgtgcctgtagtcccagctactcaggaggctgagatgagaagatcaccggagcctagaaatttgaggctgcagtgggctgtgatcatgtcacttcactcctgcctagaagacagttagaccctgcctctaaaataaacaagcaaataaataaaaagaaaggaagaaaagaagagcaagggcagcaaatagaaaatagtaataaatatggtagctattaatccaactatgtcaataattaccttaaatgttagtggtctaaatatactgcaatggB ο
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的靶向基因DNA分子探針的制備方法，其特征在于所述靶向基因?yàn)槿祟?、非人類?dòng)物、植物或微生物的疾病基因或正?；?，疾病的種類包括腫瘤或癌癥、心腦血管疾病、內(nèi)分泌及代謝性疾病、免疫淋巴系統(tǒng)疾病、遺傳性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、組織器官及個(gè)體發(fā)育性疾病、泌尿和生殖系統(tǒng)疾病、骨關(guān)節(jié)肌肉運(yùn)動(dòng)系 統(tǒng)疾病、老年性疾病、呼吸和消化系統(tǒng)疾病、皮膚病、眼耳鼻舌身的感覺(jué)器官或感受器的疾病以及各個(gè)種類的傳染性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了靶向基因DNA分子探針的制備方法，其將網(wǎng)路生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，通過(guò)使用網(wǎng)路的或計(jì)算機(jī)的生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)工具，來(lái)確定人類基因組中疾病基因序列或正常基因序列，剔除其中的非特異的重復(fù)DNA片斷，保留獨(dú)特的和特異的疾病基因序列或者基因組特有的正?；蛐蛄小Ｕ麄€(gè)DNA探針制作過(guò)程包括兩大程序第一程序是將基因的DNA序列確定并排除非特異性重復(fù)片段，第二程序是在第一程序的設(shè)計(jì)和指導(dǎo)下，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)的手段將此DNA探針實(shí)際地制造出來(lái)。本發(fā)明制造的探針可用于在福爾馬林固定、石蠟包埋的組織和細(xì)胞切片以及細(xì)胞涂片的臨床病理標(biāo)本上進(jìn)行以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的原位雜交反應(yīng)包括熒光原位雜交和非熒光的顯色原位雜交，用于各級(jí)各類疾病基因的檢測(cè)和診斷，還可用于正常人類基因和非人類基因的測(cè)定。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102952794SQ201210324630
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月5日
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