一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型的靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，靶向核酸分子片段通過與特異的捕獲探針雜交，而標(biāo)記有丙烯酰胺基團的探針分子被固定在丙稀酰胺膠中，從而將靶向核酸分子片段捕獲下來。該技術(shù)可用于微生物群落功能基因捕獲與高通量測序分析，人類基因組中疾病相關(guān)基因的釣取與高通量測序分析，環(huán)境病原微生物特征序列釣取與分析；另外，還可用于多種分子疾病與病原微生物診斷試劑盒的開發(fā)。本發(fā)明成本較低，并且丙烯酰胺分子膠連效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于磁珠與探針之前的連接效率，因此捕獲效率也大大提高。
【專利說明】一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種核酸分子的捕獲與富集技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]新一代高通量測序儀的出現(xiàn)大大降低了核酸測序成本，采用高通量測序儀，短短幾年內(nèi)測序了大量的核酸序列，多種生物的全基因組被測序，很多個人基因組也得到測序。人類全基因組測序是高通量測序儀重要的應(yīng)用。但是，多數(shù)研究與診斷目標(biāo)只需要測序大量樣本中的某一特定片段。例如，對于人類基因組來說，外顯子是蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，而外顯子只占全基因組的大約1%。大部分情況下，特別是對于疾病相關(guān)外顯子突變的篩選，只測外顯子區(qū)域就足夠了。另外，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，微生物群落的宏基因組功能基因的分析與多種人類重大疾病、環(huán)境污染、大氣溫室效應(yīng)等密切相關(guān)，而宏基因組是一個非常龐大的數(shù)據(jù)，人類腸道微生物群落宏基因組是人類基因組的100倍，不同人、同一個人不同的生理時期都具有不同的微生物群落組成，但在這些龐大的微生物群落中，起到關(guān)鍵作用的往往只有部分功能基因，對于一個微生物群落，只需要對少量的功能基因進行測序就可以達(dá)到分析的目的。
[0003]大量分子進行靶向平行分析，需要發(fā)展核酸捕獲技術(shù)，目前已有報導(dǎo)和市場化捕獲產(chǎn)品主要有兩種，第一種是基于高通量雜交分析芯片的捕獲與富集。這種方法首先是成本較高。高通量雜交芯片本身是一個非常昂貴的技術(shù)，某些芯片雜交分析成本高于目前的高通量測序分析成本，如果以這種昂貴的芯片進行富集與捕獲目標(biāo)分子，然后再進行測序分析，成本較高；采用高通量芯片進行捕獲與富集目標(biāo)分子的第二個弊端是捕獲效率較低，芯片與捕獲片段雜交的方式是固相雜交，固相分子雜交的雜交效率較低。目前市場上第二種捕獲方法是基于液相分子雜交與磁珠分尚方法，該方法首先進行一步液相雜交，然后將探針上標(biāo)記的一個基團與磁珠 上的一個特異基團共價連接，將捕獲分子與磁珠連接在一起，磁珠通過磁場的作用，將捕獲片段與非特異片段分離出來。該方法與第一種方法相比，捕獲效率與成本都得以降低。但是，由于該方法需要一步共價連接，連接效率直接影響著捕獲與富集產(chǎn)率，另外，由于探針標(biāo)記價格較高，所以捕獲成本仍然較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)。
[0005]本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:
提供一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，包括以下操作步驟:
1)將待捕獲核酸分子片段化，切膠回收200bp-500bp的核酸分子片段，連接通用接頭，形成靶向核酸分子片段；
2)將步驟I)的靶向核酸分子片段與捕獲探針及雜交液混合，完成雜交反應(yīng)，所述捕獲探針修飾有丙烯酰胺化學(xué)基團；3)向步驟2)形成的混合溶液中加入丙烯酰胺貯存液、過硫酸銨和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并將所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺膠成型裝置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺膠，并在所述丙烯酰胺膠成型裝置的兩端充入導(dǎo)電膠體；
4)將經(jīng)步驟3)之后的丙烯酰胺膠置于電泳槽的TBE電泳液中，電泳去除其中的非特異片段；
5)將經(jīng)步驟4)反應(yīng)之后的丙烯酰胺膠置于變性電泳溶液中，變性電泳將靶向核酸分子片段與捕獲探針分離，并且所述靶向核酸分子片段隨電流集聚在一段導(dǎo)電膠體中；
6)收集步驟5)中導(dǎo)電膠體中的靶向核酸分子片段，進行高通量測序分析。
[0006]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述待捕獲核酸分子是單雙鏈線形或單雙鏈環(huán)形的DNA 或 RNA。
[0007]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述捕獲探針是單鏈DNA、RNA、PNA或LNA。
[0008]在本發(fā)明一個較佳實施例中,所述捕獲探針5’端、3’端或任意堿基上修飾任意個數(shù)的丙烯酰胺化學(xué)基團。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟3)中所述丙烯酰胺貯存液中丙烯酰胺與N, N ;-亞甲雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為19:1或29:1。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述丙烯酰胺膠成型裝置為非導(dǎo)電材料制成，包括塑料軟管、玻璃溝槽或玻璃管。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述丙烯酰胺溶液質(zhì)量體積比濃度為2%_6%。
`[0012]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述丙烯酰胺膠成型裝置的兩端充置的導(dǎo)電膠體為任意導(dǎo)電的、對核酸分子有過濾或吸附作用的材料。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述導(dǎo)電膠體為瓊脂糖膠。
[0014]在本發(fā)明一個較佳實施例中，步驟5)中的所述變性電泳溶液為堿性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca (OH) 2溶液。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，采用大量捕獲探針與靶向核酸分子片段結(jié)合，并將捕獲探針固定在丙烯酰胺膠上，通過跑膠去除其中的非特異片段，靶向核酸分子片段又可以通過變性電泳方法將其收集起來，使得靶向核酸分子片段得以富集，然后進入下一步的測序分析。微生物群落宏基因組龐大，本發(fā)明針可對感興趣的基因或片段進行富集，并進一步的分析。
[0016](2)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，采用的雜交體系為溶液內(nèi)雜交，然后將雜交分子固定，以提高捕獲探針與靶向核酸分子片段的雜交效率。以往的研究報導(dǎo)，核酸分子捕獲多采用固液相分子雜交技術(shù)，也就是將探針分子固定在固相載體上，然后將被捕獲分子與探針雜交，被雜交捕獲的分子留下來進一步檢驗分析，沒有被雜交上去的分子被沖洗去除。相對于固液相分子雜交技術(shù)，液相分子雜交大大提高了分子之間的碰撞機會，提高分子之間的雜交效率，進一步提高了核酸分子的檢測靈敏度，也提高了病原微生物的檢測靈敏度。
[0017](3)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，采用丙烯酰胺膠固定捕獲探針與祀向核酸分子片段的雜交體，膠體對核酸分子的固定量較大，因此捕獲效率聞。膠體內(nèi)的探針固定量可達(dá)8μΜ，我們多用的PCR弓丨物濃度為0.4 μΜ，膠體有這么高的固定容量，多數(shù)探針及雜交體都被固定下來，因此具有較高的固定效率。目前，唯一采用溶液雜交的捕獲技術(shù)，是采用磁珠固定探針與雜交體。磁珠連接親合素，探針上連接生物素，這種親和素與生物素的連接效率雖高，但磁珠上的親合素(固相載體)與探針上的生物素(液相)之間的連接效率最高也只有30%的效率，多數(shù)雜交體無法因為連接不到磁珠上，而無法捕獲下來。
[0018](4)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，可采用原位固相單分子擴增的方法來擴大待檢測核酸分子的拷貝數(shù)，以提高了核酸分子捕獲量。當(dāng)宏基因組中靶向核酸分子片段較少時，本發(fā)明可以采用原位擴增的方法增加目標(biāo)片段數(shù)量。核酸分子擴增效率與被擴增分子與引物分子之間的碰撞機會呈正相關(guān)，理論上，PCR擴增反應(yīng)可以將溶液中的單個分子擴增出來，但實際實驗操作過程中發(fā)現(xiàn)，PCR檢測的靈敏度是大于10000個分子。本發(fā)明在進行單分子擴增之前，首先通過電泳或沉淀等技術(shù)將非目標(biāo)片段去除，剩余的片段只有引物和目標(biāo)分子，這樣大大增加了目標(biāo)分子與引物之前的碰撞機會，也大大提高了目標(biāo)分子的擴增效率。
[0019](5)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，采用原位固相單分子擴增方法增加目標(biāo)核酸分子捕獲量，減少了核酸分子擴增的偏性，更宜于高通量測序定量分析目標(biāo)片段的含量。常規(guī)的通用引物PCR擴增，由于模板分子序列及高級結(jié)構(gòu)的不同，如GC含量低的片斷較容易被擴增，因此在大量片斷擴增過程中，最終的反應(yīng)液中小片斷和GC含量低的片斷較多，而大片斷與GC含量高的片斷較少。擴增效率高的核酸模板分子會越來越多，而擴增效率低人模板分子增長速度會越來越小，最終采用基因芯片雜交技術(shù)檢測時，低擴增效率的分子幾乎檢測不到。本發(fā)明采用原位單分子擴增，在某一個擴增區(qū)域內(nèi)，只有一個模板分子，這個模板在擴增過程中不受其他模板分子的影響，因此，每個模板分子的擴增效率差別較小，在采用核酸分子芯片雜交檢測時，能夠真實的反應(yīng)原液中核酸分子模板數(shù)量，也就是微生物數(shù)量。
[0020](6)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，采用通用引物擴增，以提高擴增效率。多數(shù)報導(dǎo)采用多重PCR或多次PCR的方法來檢測多種微生物，多重PCR技術(shù)擴增的偏性較大，有些分子 較容易擴增，而有些分子基本擴增不出來；即使這樣，同時能擴增出來的核酸模板分子的數(shù)量也非常有限。多次PCR方法較為煩瑣，因此限制了核酸分子檢測的種類。本發(fā)明采用通用引物擴增，也就是將待擴增模板分子兩端接上接頭，不同模板分子具有相同的接頭，然后以接頭序列作為引物序列進行PCR擴增，這樣就提高了各種模板分子的擴增效率。
[0021](7)本發(fā)明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)中靶向核酸分子片段富集成本相對較低。本發(fā)明采用丙烯酰胺膠聚合的方法將探針固定在丙烯酰胺膠內(nèi)，探針修飾一個丙烯酰胺分子，相比較其他固定方法及探針的修飾基團，成本相對便宜。不需要昂貴的抗體或者其他蛋白物質(zhì)，使用的探針可一次合成，多次使用。加上本發(fā)明固定效率較高，相比較其他核酸分子的富集方法，成本較低。
[0022](8)本發(fā)明一種新型祀向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，大大降低樣本分析成本。多數(shù)宏基因組樣本基因組信息寵大，而我們感興趣的目標(biāo)片段往往只占宏基因組的很少比例(小于萬分之一)，多數(shù)信息對于我們分析宏基因組與疾病或其他性狀意議較小。然而目前的測序成本仍然較高，采用本發(fā)明可以將目標(biāo)片段捕獲出來進行測序分析，大大降低分析成本。由于宏基因組信息量大，目標(biāo)片段含量相對較小，所以對于捕獲技術(shù)要求較高。本發(fā)明基于膠固定技術(shù)固定效率高等特點，實現(xiàn)了宏基因組目標(biāo)片段的捕獲與富集。本發(fā)明不僅降低了 DNA的測序成本，同時還降低了樣本的人工分析費用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明的工作原理圖；
其中a:打碎成200-500bp的非靶向核酸分子片段； b:打碎成200-500bp的靶向核酸分子片段； c:連接有接頭的非祀向核酸分子片段； d:連接有接頭的靶向核酸分子片段； e =Linker-PCR擴增后的PCR產(chǎn)物； f:標(biāo)記有化學(xué)基團的探針； g:探針和靶向核酸分子片段的雜交體；
h:固定連接有探針和靶向核酸分子片段雜交體以及非靶向核酸分子片段的膠體；1:去除了非靶向核酸分子片段之后的固定連接有探針和靶向核酸分子片段雜交體的膠體；
j:核酸分子序列分析儀。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細(xì)闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
[0025]參閱圖1，其中步驟I為靶向核酸分子片段和非靶向核酸分子片段連接通用接頭，步驟2為Linker-PCR，步驟`3為探針與靶向核酸分子片段在雜交液中雜交，步驟4為通過探針上的化學(xué)基團將靶向核酸分子片段與探針的雜交體連接固定在固相膠體中，步驟5為采用電泳等技術(shù)將非靶向核酸分子片段去除，步驟6為捕獲靶向核酸分子片段并進入下一步的高通量測序分析。
[0026]實施例1采用聚丙烯酰胺膠捕獲技術(shù)與高通量測序儀靶向分析腸道微生物宏基因組中多種功能基因分布:
(I)探針的設(shè)計與制備
腸道微生物功能基因DNA序列片段選擇:采用Mega或Clustal W等軟件，進行生物信息學(xué)比較，完成2萬個功能基因核酸序列的選擇。
[0027]探針的設(shè)計:采用primerf.0等軟件，針對微生物特異片段設(shè)計探針。
[0028]探針的合成與標(biāo)記:探針采用DNA合成儀進行合成，所有探針合成后，進行5’端標(biāo)
記一個丙烯酰胺基團。
[0029](2)腸道微生物群落宏基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
腸道微生物群落宏基因組DNA提取:采集200mg新鮮大便，PBS懸浮大便中的腸道微生物，然后離心收集微生物，進一步采用溶菌酶等試劑提取微生物群落中的宏基因組DNA。
[0030]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0031]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請?zhí)朇N200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產(chǎn)生一個TA粘性末端，然后與一個通用連接子(Iinkerl:5’ -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2:5’ -CGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用連接子。連接產(chǎn)物經(jīng)QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化后待用。
[0032](3 ) Linker-PCR 擴增
為了盡量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環(huán)數(shù)為20-26個。反應(yīng)體系為100 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預(yù)變性4分鐘，然后95 °C變性I分鐘，70 V復(fù)性2分30秒，72 °C延伸30秒，最后，72°C再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0033](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交并固定于聚丙烯酰胺凝膠
將制備的帶有通用引物的PCR產(chǎn)物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然后快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺單體(29:1，w/w丙烯酰胺:雙丙烯酰胺)終濃度為2% (w/v)，過硫酸銨(APS)為1% (w/v)，TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注于透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固后,將的另一端灌注上2%的瓊脂糖溶液，丙烯酰胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0034](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標(biāo)片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流 只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0035]目標(biāo)片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置于兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據(jù)DNA指示劑，切下目標(biāo)片段瓊脂糖膠，提取目標(biāo)片段，凍存?zhèn)溆谩?br> [0036](6 )通用弓丨物PCR擴增
反應(yīng)體系為50 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，2U 的 Taq DNA 聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCRSystem上進行如下PCR擴增:95°C預(yù)變性4分鐘，然后95°C變性I分鐘，70°C復(fù)性2分30秒，72 °C延伸30秒，最后，72 °C再延伸10分鐘，PCR循環(huán)數(shù)為35，PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0037](7)高通量測序儀測序分析目標(biāo)片段
將上述目標(biāo)片段分別進行高通量測序儀測序分析，并進行生物信息學(xué)分析。
[0038]實施例2采用聚丙烯酰胺凝膠捕獲與高通量測序儀進行人類基因組中癌癥相關(guān)基因外顯子突變的靶向分析:
(I)探針的設(shè)計與制備
癌癥相關(guān)基因外顯子核酸序列選擇:采用Mega或Clustal W等軟件，進行生物信息學(xué)比較，完成1000個功能基因核酸序列的選擇。
[0039]探針的設(shè)計:采用primerf.0等軟件，針對微生物特異片段設(shè)計探針。
[0040]探針的合成與標(biāo)記:探針采用DNA合成儀進行合成，所有探針合成后，進行5’端標(biāo)
記一個丙烯酰胺基團。[0041](2)腸道微生物群落宏基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
人類基因組DNA提取:采集2ml靜脈血，采用紅細(xì)胞裂解和蛋白酶K消化，酚-氯仿方法抽提人類基因組DNA。
[0042]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0043]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請?zhí)朇N200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產(chǎn)生一個TA粘性末端，然后與一個通用連接子(Iinkerl: 5’ -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2: 5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用的連接子。連接產(chǎn)物經(jīng)QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化后待用。
[0044](3) Linker-PCR 擴增
為了盡量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環(huán)數(shù)為20-26個。反應(yīng)體系為100 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預(yù)變性4分鐘，然后95 °C變性I分鐘，70 V復(fù)性2分30秒，72 °C延伸30秒，最后，72°C再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0045](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交并固定于聚丙烯酰胺膠
將制備的帶有通用引物的PCR產(chǎn)物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然后快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺單體(19:1，w/w丙烯酰胺:雙丙烯酰胺)終濃度為6% (w/v)，過硫酸銨(APS)為1% (w/v) , TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注于透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固后,將的另一端灌注上2%的瓊脂糖溶液，丙烯酰胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0046](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標(biāo)片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0047]目標(biāo)片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置于兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據(jù)DNA指示劑，切下目標(biāo)片段瓊脂糖膠，提取目標(biāo)片段，凍存?zhèn)溆谩?br> [0048](6 )通用弓丨物PCR擴增
反應(yīng)體系為50 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，2U 的 Taq DNA 聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCRSystem上進行如下PCR擴增:95°C預(yù)變性4分鐘，然后95°C變性I分鐘，70°C復(fù)性2分30秒，72°C延伸30秒，最后，72°C再延伸10分鐘。PCR循環(huán)數(shù)為35。PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0049](7)高通量測序儀測序分析目標(biāo)片段
將上述目標(biāo)片段分別進行高通量測序儀測序分析，并進行生物信息學(xué)分析。
[0050]實施例3采用聚丙烯酰 胺凝膠捕獲與高通量測序儀靶向進行食品中微量病原微生物種類分析:(I)探針的設(shè)計與制備
菌種特異DNA序列片段選擇:采用Mega或Clustal W等軟件，進行生物信息學(xué)比較，完成100種以上食品病原微生物特異基因的選擇。
[0051]探針的設(shè)計:采用primer5.0等軟件,針對微生物特異片段設(shè)計探針。
[0052]探針的合成與標(biāo)記:探針采用DNA合成儀進行合成，同時在5’端標(biāo)記一個丙烯酰
胺基團。
[0053](2)病原微生物基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
病原微生物基因組DNA提取:采集冷卻肉及經(jīng)屠宰加工后的鴨肉系列產(chǎn)品，用無菌棉拭子進行六面50cm2取樣，然后將棉拭子上的微生物用PBS沖洗下來，HOOOrpm離心10分鐘，分離微生物。采用試劑盒或本研究室優(yōu)化后的微生物DNA抽提方法，進行微生物全基因組DNA抽提。
[0054]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當(dāng)?shù)某暡▋x，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0055]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請?zhí)朇N200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然后分別采用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產(chǎn)生一個TA粘性末端，然后與一個通用連接子(Iinkerl: 5’ -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’ linker2: 5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用的連接子。連接產(chǎn)物經(jīng)QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化后待用。
`[0056](3 )通用弓丨物PCR擴增
為了盡量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環(huán)數(shù)為20-26個。反應(yīng)體系為100 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預(yù)變性4分鐘，然后95 °C變性I分鐘，70 V復(fù)性2分30秒，72 °C延伸30秒，最后，72°C再延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0057](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交并固定于聚丙烯酰胺凝膠
將制備的帶有通用引物的PCR產(chǎn)物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然后快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯酰胺溶液混合，其中，丙烯酰胺單體(29:1，w/w丙烯酰胺:雙丙烯酰胺)終濃度為2% (w/v)，過硫酸銨(APS))為1% (w/v) , TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注于透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固后,將的另一端灌注上2%的瓊脂糖溶液，丙烯酰胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0058](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標(biāo)片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0059]目標(biāo)片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置于兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據(jù)DNA指示劑，切下目標(biāo)片段瓊脂糖凝膠，提取目標(biāo)片段，凍存?zhèn)溆谩?br> [0060](6 )通用弓丨物PCR擴增反應(yīng)體系為50 μ 1，其中含有IX反應(yīng)緩沖液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物(其中一條引物5’端修飾一個熒光分子)，2U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200μΜ的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上進行如下PCR擴增:95°C預(yù)變性4分鐘，然后95 °C變性I分鐘，70 V復(fù)性2分30秒，72 °C延伸30秒，最后，72 °C再延伸10分鐘。PCR循環(huán)數(shù)為35。PCR產(chǎn)物純化后備用。
[0061](7)基因芯片法進行病原微生物鑒定
基因芯片的制備:①探針制備:針對待檢測分析基因，設(shè)計基因芯片探針，探針的5’端修飾一個氨基化學(xué)基團。②醛基玻片制備:選擇大小合適的低熒光背景的全反射玻片，沖洗表面。將沖洗過的玻片置于盛有去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌后的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最后用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘干備用；洗漆干凈的載玻片置于含有10% Alfa AesarC3-methacryloxypropyltrimethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡I小時，用丙酮和去離子蒸懼水徹底清洗各兩次，氮氣吹干，烘干備用。③探針固定于醛基玻片:將氨基修飾的探針點樣于玻片，然后進行氨基醛基的縮合反應(yīng)，共價鍵將探針連接在玻片上。
[0062]基因芯片法進行病原微生物鑒定:將上述PCR產(chǎn)物與芯片雜交反應(yīng)，雜交后的玻片進行掃描儀掃描檢測熒光信號，分析病原微生物種類。
[0063]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)`明的專利保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，包括以下操作步驟: 1)將待捕獲核酸分子片段化，切膠回收200bp-500bp的核酸分子片段，連接通用接頭，形成靶向核酸分子片段； 2)將步驟I)的靶向核酸分子片段與捕獲探針及雜交液混合，完成雜交反應(yīng)，所述捕獲探針修飾有丙烯酰胺化學(xué)基團； 3)向步驟2)形成的混合溶液中加入丙烯酰胺貯存液、過硫酸銨和TEMED，形成丙烯酰胺溶液，并將所述丙烯酰胺溶液置于丙烯酰胺膠成型裝置的一端，待完全凝固后形成丙烯酰胺膠，并在所述丙烯酰胺膠成型裝置的兩端充入導(dǎo)電膠體； 4)將經(jīng)步驟3)之后的丙烯酰胺膠置于電泳槽的TBE電泳液中，電泳去除其中的非特異片段； 5)將經(jīng)步驟4)反應(yīng)之后的丙烯酰胺膠置于變性電泳溶液中，變性電泳將靶向核酸分子片段與捕獲探針分離，并且所述靶向核酸分子片段隨電流集聚在一段導(dǎo)電膠體中； 6)收集步驟5)中導(dǎo)電膠體中的靶向核酸分子片段，進行高通量測序分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述待捕獲核酸分子是單雙鏈線形或單雙鏈環(huán)形的DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述捕獲探針是單鏈DNA、RNA、PNA或LNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的新 型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述捕獲探針5’端、3’端或任意堿基上修飾任意個數(shù)的丙烯酰胺化學(xué)基團。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，步驟3)中所述丙烯酰胺貯存液中丙烯酰胺與N，N '-亞甲雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為19:1或29:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述丙烯酰胺膠成型裝置為非導(dǎo)電材料制成，包括塑料軟管、玻璃溝槽或玻璃管。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述丙烯酰胺溶液質(zhì)量體積比濃度為2%-6%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述丙烯酰胺膠成型裝置的兩端充置的導(dǎo)電膠體為任意導(dǎo)電的、對核酸分子有過濾或吸附作用的材料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，所述導(dǎo)電膠體為瓊脂糖膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術(shù)，其特征在于，步驟5)中的所述變性電泳溶液為堿性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca (OH) 2溶液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602658SQ201310480567
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】周東蕊, 張紅琳, 章愛娣, 肖鵬峰, 白志茂, 陸祖宏 申請人:東南大學(xué)