專利名稱：用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針及其制備方法，用于用 磁共振、光學(xué)等多模式無創(chuàng)性顯像整合素α νβ 3受體來評估肝纖維化。
背景技術(shù)：
迄今，肝活檢仍是評估肝纖維化的唯一 “金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，肝活檢是有創(chuàng)的，可引起 致命的并發(fā)癥，因此不能被患者普遍接受，這造成了很大一部分慢性肝病患者在診斷和治 療上的延誤；同時，在無明顯癥狀的患者中，很難重復(fù)進行肝活檢，這就無法準(zhǔn)確地隨訪慢 性肝病患者病情的變化；此外，樣本取樣誤差和病理觀察的不一致性都影響了肝活檢的準(zhǔn) 確性。因此，需要一種精確的無創(chuàng)傷性的方法來診斷和評估肝纖維化。目前，肝纖維化無 創(chuàng)傷性的評估方法有1纖維化血清標(biāo)記物。器官特異性差，易受炎癥和機體代謝的干擾， 標(biāo)準(zhǔn)化困難，組合指標(biāo)更多反映炎癥，對纖維化分期較困難；2生化指標(biāo)。需多項組合(如 Fibrotest)。由于肝臟極強的儲備功能，只在嚴重肝纖維化時改變明顯，并且生化指標(biāo)影響 因素多，解釋困難，不同病因、不同時期的肝纖維化評估的準(zhǔn)確性不同；3常規(guī)影像。目前常 規(guī)B超、CT、MRI難于反映肝纖維化早期改變，評估多限于肝硬化及并發(fā)癥；4發(fā)展中的影像 技術(shù)。近年推出超聲檢測低頻彈性波的瞬時彈性記錄儀(Fibroscan)和運用MRI彌散加權(quán) 成像(DWI)、31磷波譜成像(31MRS)及彈性成像變化等新技術(shù)，通過測量肝組織硬度和彈性來 評估肝臟纖維化程度，優(yōu)于其他的無創(chuàng)的方法，具有一定的應(yīng)用前景。然而，近來的研究發(fā) 現(xiàn)也存在一定的局限性，如腹壁脂肪的含量在很大程度上影響Fibroscan等對肝纖維化的 檢測準(zhǔn)確性，并且這些方法在對早期肝纖維化的診斷上也存在困難。目前診斷和評估肝纖維化的方法都未能較好反映慢性肝損傷修復(fù)過程中活化細 胞表型和數(shù)量變化等分子病理改變，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面存在不一致性， 尚難達到臨床對肝纖維化早期診斷和治療效果實時動態(tài)評估的要求。不能對肝纖維化做出 正確評估一直以來是制約基礎(chǔ)研究走向臨床的“瓶頸”，也是不能開發(fā)抗纖維化藥物與臨床 試驗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-asparagicacid，RGD)系列是整 合素結(jié)合配基的最常見識別位點。整合素α νβ3能識別ECM中特異構(gòu)象的RGD配體。人工 合成含RGD肽鏈高通量篩選發(fā)現(xiàn)，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸_ (右旋)酪氨酸_賴氨酸 (RGDyK)、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸_(右旋)苯丙氨酸_賴氨酸(RGDfK)等五肽分子 也能和整合素α νβ 3受體特異結(jié)合，對五肽中賴氨酸側(cè)鏈上活性氨基進行小分子修飾并不 會顯著影響受體與配基結(jié)合活性。在本發(fā)明的前期的研究中，發(fā)現(xiàn)活化HSCs中整合素ανβ3表達明顯上調(diào)，cRGDyK 多肽在肝纖維化的診斷中可以做為一種潛在的靶點。這部分結(jié)果已經(jīng)發(fā)表SCI文章 Biochemicalcharacterization of the binding of cyclic RGDyK to hepatic stellate cells.Xiao-weiHuang, Ji-Yao Wang, et al.Biochemical Pharmacology. 2010,80 136-143. (IF = 4. 8，2008)另外，本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)和膽總管結(jié)扎(bile ductligation,BDL)誘導(dǎo)的兩種大鼠肝纖維化模型中，整合素α νβ 3和α -平 滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，SMA)表達在程度和部位上密切相關(guān)，它和肝纖維 化的發(fā)展趨勢是一致的。并已經(jīng)進行了 SPECT和超聲顯像的初步體內(nèi)研究。目前，國外已有不少通過以RGD環(huán)肽標(biāo)記的對比劑對整合素α νβ 3受體表達進行 顯像的分子影像學(xué)研究。主要工作集中在腫瘤新生血管、血管損傷重塑、破骨細胞參與的骨 重建等方面。國外靶向于整合素α νβ3受體，對腫瘤相關(guān)血管新生進行的MRI磁共振分子 成像研究也已經(jīng)有一定基礎(chǔ)，相對比較成熟。而在肝纖維化中，目前未見相關(guān)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米探針及其制備方法，用于肝纖維化的診斷和評估。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探 針，其特征在于，包括載體，所述載體連接熒光基團和磁共振造影基團，并經(jīng)由橋連基團連 接能夠與肝纖維化/肝硬化中肝星狀細胞表面上的受體相結(jié)合的靶向化合物基團。所述的肝纖維化/肝硬化中肝星狀細胞表面上的受體是指至少一種在病理狀態(tài) 下上調(diào)的受體，如整合素受體。靶向化合物基團與肝星狀細胞多種整合素受體相結(jié)合的位 點為環(huán)肽中的RGD序列。所述靶向化合物基團可為氨基酸序列*GRZXD*，*表示成環(huán)位置， Z代表含有活性氨基側(cè)鏈的一個氨基酸或者足夠長度的氨基酸序列并且不影響與靶向受體 結(jié)合，X代表含有可以用來碘標(biāo)的至少一個氨基酸或者足夠長度的氨基酸序列并且不影響 與靶向受體結(jié)合。所述靶向化合物基團可優(yōu)選為環(huán)肽序列*GRKXD*，*表示成環(huán)位置，X代 表含有可以用來碘標(biāo)的至少一個氨基酸或者足夠長度的氨基酸序列并且不影響與靶向受 體結(jié)合。進一步地，所述靶向化合物基團可優(yōu)選為環(huán)肽序列*GRKyD*，*表示成環(huán)位置，y代 表右旋酪氨酸。更進一步地，所述靶向化合物基團為C(RGDyK)基團，y代表右旋酪氨酸，其 能與肝星狀細胞特異性結(jié)合，符合作為配體的要求。K含有活性氨基側(cè)鏈，是主動靶向納米 藥物的結(jié)合位點。所述載體可為樹枝狀大分子Dendrimer (Den)，優(yōu)選2_8代的聚乙二胺樹枝狀高分子。所述的熒光基團為羰花青類近紅外熒光染料基團以及非近紅外熒光染料基團中 的至少一種。所述的羰花青類近紅外熒光染料基團為IR783基團或Cy5. 5基團。所述的非 近紅外熒光染料基團為羅丹明基團。所述的熒光基團以酰胺鍵形式標(biāo)記到樹枝狀高分子 上。所述的磁共振造影基團為Tl加權(quán)磁共振造影基團，優(yōu)選釓配合物Gd-DOTA基團。所述的所述橋連基團為聚乙二醇基團，PEG兩端分別是N-羥基琥珀酰亞胺酯和馬 來酰亞胺。C(RGDyK)環(huán)肽與主動靶向納米藥物的連接方法，即活性氨基側(cè)鏈與N-羥基琥珀 酰亞胺酯-聚乙二醇_馬來酰亞胺的N-羥基琥珀酰亞胺酯在有機相中反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰 胺鍵。然后N-羥基琥珀酰亞胺酯-聚乙二醇_馬來酰亞胺通過馬來酰亞胺和樹枝狀大分 子Dendrimer上的伯胺基結(jié)合。本發(fā)明還提供了 c (RGDyK)的制備方法，具體步驟為第一步將0. 4 重量份的取代度為 0. 6mmol/g 的樹脂-Gly (Fmoc-Gly-2-Cl-Trt) 用二氯甲烷沖洗并溶脹，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌；
第二步用20vol %哌啶脫保護，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌；將 Fmoc-Arg (Pbf)-OH與1_羥基苯并三唑混合，用苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟 磷酸鹽和N，N-二異丙基乙胺溶解，其中，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-0H、1-羥基苯并三唑、苯并三氮 唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽以及N，N-二異丙基乙胺與樹脂-Gly的比例分別為 1. 2mmol-l. 3mmol 0. 4g,0. 15g-0. 2g 0. 4g，2. 4ml_2. 5ml 0. 4g，0. 4ml_0. 5ml 0. 4g ； 將所得溶液加入到第一步的樹脂中，恒溫振蕩器上反應(yīng)45分鐘，用N，N-二甲基甲酰胺洗 滌，進行茚三酮檢測確定是否反應(yīng)完全；第三步將Fmoc-Arg(Pbf)-OH 依次替換為 Fmoc-Lys (Boc)-0H、 Fmoc-D-Tyr (tBu) -OH和Fmoc-Asp (otBu) -OH,重復(fù)進行第二步，得到連接在樹脂上的整條 被保護線狀肽鏈 H-Asp (otBu) -D-Tyr (tBu) -Lys (Boc) -Arg (Pbf) -Gly (2-Cl-Trt) -OH ；用 20vol%哌啶脫保護，分別用N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷沖洗，用二氯甲烷和三氟乙酸 的混合液切割，切割液抽吸入裝有吡啶和甲醇的燒瓶中，最后用甲醇沖洗樹脂，沖洗液也抽 吸入燒瓶中，旋蒸去除二氯甲烷和甲醇，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用蒸餾水沉淀出絮 狀粗品，用砂芯漏斗過濾得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸餾水，超聲分散沉淀，冷 凍干燥得到粗品；第四步將第三步所得的粗品0. 19-0. 2重量份溶解于N，N_二甲基甲酰胺，加入二 氯甲烷，加入N，N- 二異丙基乙胺0. 019-0. 02重量份以及六氟磷酸苯并三唑-1-基_氧基三 吡咯烷基磷0. 06-0. 07重量份進行環(huán)化，常溫下攪拌3 4小時，旋蒸去除二氯甲烷，加蒸 餾水沉淀出多肽，用砂芯漏斗過濾得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸餾水，超聲分散 沉淀，冷凍干燥；用三氟乙酸和蒸餾水的混合物脫保護，常溫下磁力攪拌3 4小時，用冰乙 醚沉淀，砂芯漏斗過濾得沉淀，用蒸餾水溶解，制備型HPLC純化、冷凍干燥得到c (RGDyK)。本發(fā)明還提供了上述用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針的制備方法，其特 征在于，具體步驟為第一步將靶向化合物溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺，加入溶于N，N-二 甲基甲酰胺的馬來酰亞胺_橋連基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯，常溫攪拌反應(yīng)得到與橋連基 團相連的靶向化合物，加入溶于磷酸鹽緩沖液的載體，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量 IOOOODa截斷的離心式過濾器用純水進行超濾、純化，去除水溶性的小分子副產(chǎn)物，冷凍干 燥得到與靶向基團相連的載體；第二步將第一步中所得的與靶向基團相連的載體溶于4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩 沖液中，加入DOTA-N-羥基琥珀酰亞胺酯，邊加邊攪拌，整個過程中加入氫氧化鈉溶液使溶 液PH值控制在8. 4-8. 6，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器 超濾、純化，去除沒有結(jié)合的DOTA-N-羥基琥珀酰亞胺酯，冷凍干燥后溶于4-羥乙基哌嗪乙 磺酸緩沖液中，加入碳酸釓，60°C下攪拌過夜，離心沉淀除去多余的碳酸釓，用水稀釋，用分 子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化，冷凍干燥得到與靶向基團和磁共振造影基 團相連的載體；第三步將熒光基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，將第 二步得到的與靶向基團和磁共振造影基團相連的載體溶于4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液 中，滴加上述熒光基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量 IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化，得到與熒光基團、磁共振造影基團和靶向基團相連的載體，即為用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針。本發(fā)明中，熒光探針和DOTA(1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7，10-四乙酸)螯 合的Gd (磁共振顯像基團)被標(biāo)記在PAMAM-G5上，c (RGDyK)通過一種雙功能的PEG連接 在此高分子上，組成一個新型的納米探針。本發(fā)明的優(yōu)點如下1.近紅外熒光(Near-Infrared Fluorescence)探針近年來在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛 被應(yīng)用?；铙w組織對波長范圍在700 IOOOnm的近紅外光吸收較弱，因此近紅外熒光能夠 穿透較深的組織，從而得到靈敏度更高，且信噪比更好的圖像，但空間分辨率較差。2. MRI是一種無創(chuàng)醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)，它有著高空間分辨率，無電離輻射，無檢測角度 限制，易臨床轉(zhuǎn)化等特點，但靈敏度較低。MRI在臨床上廣泛應(yīng)用于軟組織，特別是腫瘤和 心血管類疾病的早期診斷和治療效果評估。它是一種具有將解剖學(xué)結(jié)構(gòu)和功能及分子信息 結(jié)合于一體的影像方法。相對于PET、SPECT等放射性示蹤技術(shù)，MRI具有更好的安全性，更 高的空間分辨率，并且可以進行動態(tài)多次掃描。MRI的對比劑可以顯著提高MRI的靈敏度。 磁共振對比劑包括Tl加權(quán)對比劑和T2加權(quán)對比劑等類型。它們能顯著增加軟組織間的對 比度，并能實現(xiàn)對腫瘤等病變組織的靶向特異性診斷。MRI的分子影像學(xué)成像是建立在傳 統(tǒng)MR成像技術(shù)基礎(chǔ)上，以MR圖像或波譜等形式在活體上對目標(biāo)分子進行無創(chuàng)的示蹤，定量 和實時觀測。此外，Gd-DOTA配合物還具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，不易于生理內(nèi)源性的Zn2+， Ca2+等離子發(fā)生交換并游離出毒性的Gd3+離子。因此本工作將以Gd-DOTA配合物作為磁共 振成像基團。3.樹枝狀大分子聚乙二胺(PAMAM)自從1985年被Tomalia和他的伙伴們介紹后 引起了廣泛的關(guān)注。它們最成功的地方是有一系列的大小尺寸，被稱為“代(generation) ”， 使得根據(jù)應(yīng)用需要精確細調(diào)分子大小成為可能。很多廣泛的研究也認為它們的很多內(nèi)在性 質(zhì)適合生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。樹枝狀大分子PAMAM做為一種新的藥物平臺可以攜帶多個螯合 的釓劑(攜帶位點的多少取決于PAMAM的代數(shù))，將組成一種具有較高分子馳豫率和較好 的影像增強效果的磁共振顯像劑。低代數(shù)的樹枝狀高分子為基礎(chǔ)的試劑，包括G2( 二代， 3nm)、G3(三代，5nm)和G4(四代，6nm)釓螯合劑，將很快被排泄，主要通過首次通過腎臟時 的排泄。雖然如此，由于減少了外滲，它們依然比Gd-DTPA(螯合上釓的二乙烯三胺五乙酸) 能更好地顯示血管結(jié)構(gòu)。中等代數(shù)的樹枝狀高分子為基礎(chǔ)的試劑，包括G5(五代，7nm)和 G6(六代，9nm)釓螯合劑，由于長血池儲留而較慢被腎臟排泄，但是這些試劑開始顯示出部 分肝膽管的排泄。而對于G7(七代，llnm)和G8(八代，13nm)而言，幾乎完全是通過肝膽系 統(tǒng)排泄，更高代數(shù)的則被肝脾等的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所捕獲。因此，本發(fā)明選擇G5做為探針的 載體，以延長血循環(huán)時間，更多地結(jié)合到纖維化的活化肝星狀細胞和新生血管上，并盡量減 少肝膽管排泄。4.本發(fā)明中，熒光探針和DOTA螯合的Gd(磁共振顯像基團)被標(biāo)記在G5樹枝狀高 分子上，c (RGDyK)通過一種雙功能的PEG連接在此高分子上。這種延伸的PEG鏈接不僅改 善了整個探針的水溶性，延長了納米探針循環(huán)時間，同時也盡可能減少了樹枝狀的聚合物 對結(jié)合的c (RGDyK)的結(jié)合受體能力的立體位阻。另外，納米探針上也標(biāo)記了 Rhodamine (羅 丹明)等熒光基團，這樣用熒光顯微鏡觀察離體切片時，用近紅外小動物成像儀等，本發(fā)明 能很容易追蹤此納米探針。


圖1為本發(fā)明的多模式靶向探針的合成路線圖2為不帶cRGDyK靶頭的對照納米探針的合成路線圖3 為 c (RGDyK)的 HPLC 圖4 為 c (RGDyK)的 ESI-MS 圖5為化合物1的1H NMR核磁圖6為化合物2的1H NMR核磁圖7為化合物6的1H NMR核磁圖8為化合物7的1H NMR核磁圖9為Den-RGD的流體動力學(xué)粒徑分布和zeta電位示意圖
圖10為Den-PEG的流體動力學(xué)粒徑分布和zeta電位示意圖
圖11為細胞毒性實驗曲線圖12為Tl加權(quán)磁共振信號圖13為MRI顯像圖14為模型小鼠肝冰凍切片熒光顯微鏡觀察圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。實施例1如圖1所示，為本發(fā)明的多模式靶向探針的合成路線圖，所述多模式靶向探針 (Den-RGD)的合成路線圖的合成步驟如下1、c (RGDyK)的合成本發(fā)明用Fmoc保護的固相多肽合成方法合成c (RGDyK) (MW = 619. 68Da)(1)稱取 0. 4g 樹脂-Gly (Fmoc-Gly-2-Cl-Trt,取代度 0. 6mmol/g,約 0. 25mmol)， 用二氯甲烷(DCM)沖洗并溶脹20分鐘，用DMF(N，N- 二甲基甲酰胺)洗滌數(shù)次。(2)連續(xù)用20%哌啶(DMF 哌啶=2ml 0. 5ml)脫保護2次，每次10 15分 鐘。DMF洗滌數(shù)次。(3)稱取所需氨基酸1.25mmol，并加入0. 18g的HOBt (1_羥基苯并三唑)，用 2. 45ml的HBTU (苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸鹽)和0. 44ml的DIEA (N， N- 二異丙基乙胺)溶解，加入樹脂中，常溫下在振蕩器上反應(yīng)45分鐘。(4)用DMF洗滌。挑取芝麻大小的樹脂進行NT (茚三酮)檢測確定是否反應(yīng)完全。 NT檢測液A液為8ml苯酚加2ml乙醇，B液為吡啶，C液為Ig茚三酮加IOml乙醇。NT檢 測方法往挑取的樹脂中加入A液10ul，B液20ul，C液10ul，120°C電爐上烤約1分鐘。若 樹脂變藍則反應(yīng)不完全，需要重新稱取此氨基酸進行反應(yīng)；若樹脂仍為黃色，則反應(yīng)完全。 重復(fù)(2)、(3)、(4)，依次反應(yīng)的氨基酸分別是Fmoc-Arg (Pbf)-OH (有保護基團的精氨酸)、 Fmoc-Lys (Boc) -OH (有保護基團的賴氨酸)、Fmoc-D-Tyr (tBu) -OH (有保護基團的酪氨酸)、 Fmoc-Asp (otBu) -OH (有保護基團的天冬氨酸)，得到整條被保護線狀肽鏈H-Asp (otBu) -D-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly(2-Cl-Trt)-OH。
(5)同上，用哌啶脫保護兩次，再分別用DMF和DCM沖洗。用50mlDCM( 二氯甲烷) 和0. 5mlTFA (三氟乙酸)的混合液分10次切割，每次攪拌約2分鐘，切割液抽吸入裝有Iml 吡啶和9ml甲醇的燒瓶中，最后用甲醇沖洗樹脂，沖洗液也抽吸入燒瓶中。旋蒸去除DCM和 甲醇，用2 3mlDMF溶解，再用適量(約50 100ml)蒸餾水沉淀出絮狀粗品。用砂芯漏 斗過濾得沉淀，適量乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入適量蒸餾水，超聲分散沉淀，凍干。得到產(chǎn) 物約 197. 5mg。(6).將粗品溶解于 20mlDMF 中，再加入 180mlDCM，在 19.4mg(0. 15mmol，1.5 倍) DIEA的催化下，用62. 5mg(0. 12mmol，1. 2倍)PYBOP (六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡 咯烷基磷)進行環(huán)化，常溫下磁力攪拌3 4小時。旋蒸去除DCM，加約500ml蒸餾水沉淀 出多肽。用砂芯漏斗過濾得沉淀，適量乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入適量蒸餾水，超聲分散沉 淀，凍干。得到產(chǎn)物約197mg。(7).用IOmlTFA加0. 5ml蒸餾水脫保護，常溫下磁力攪拌3 4小時，用冰乙醚沉 淀，砂芯漏斗過濾得沉淀，適量蒸餾水溶解，制備型HPLC (高效液相色譜儀)純化、凍干。產(chǎn) 物的純度通過分析型HPLC證實。ESI-MS (電噴霧質(zhì)譜)中有一個單一的620. 45峰，計算分 子量為619. 68。制備型HPLC純化方法制備柱SymmetryPrep C187 μ m 19X30(kim Column ；流 動相A :0. 1 % TFA的純水；流動相B 乙腈；洗脫程序0_60分鐘0% B-100 % B ；流速 10ml/min ；柱溫:25°C ；檢測:UV 214nm 禾口 280nm。分析型HPLC 方法色譜柱YMC HPLC COLUMN 150X4. 6mml. D.；流動相 A:0. TFA的乙腈；流動相B :0. TFA的純水；洗脫程序0_2分鐘100% B沖洗柱子平衡；2_17 分鐘 100% B-80% B ； 17-18 分鐘，80% B-10% B ； 18-23 分鐘，10% B 沖洗柱子；23-24 分鐘， 10% B-100% B ；24-30min，100% B 平衡柱子。流速 0. 7ml/min ；柱溫25°C;檢測=UV 214nm 和280nm。如圖3所示，為c (RGDyK)的HPLC圖。如圖4所示，為c (RGDyK)的ESI-MS圖。2、化合物1的合成5mg(8. 06X l(T6mol，13 倍)的 c (RGDyK)溶于 500ul 的 DMF 中，并加入 IOul 的 TEA(三乙胺)，迅速和溶于500ulDMF的12. 4mg(6. 2X l(T6mol，10倍，分子量為2kDa) Malemide-PEG2k-NHS (馬來酰亞胺-聚乙二醇(分子量2000Da) -N-羥基琥珀酰亞胺酯)混 合，常溫下磁力攪拌2h后，形成一邊是馬來酰亞胺，另一邊是c (RGDyK)的PEG衍生物。然 后上述混合液再迅速和溶于2ml IXPBS (磷酸鹽緩沖液，pH 7. 4)的17. 9mg(6. 2X 10_7mol， 分子量為28826Da)G5混合(G5的PBS溶液先調(diào)整pH至7. 4 8. 0)，常溫下磁力攪拌1小 時。用純水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器用純水進行超濾、純化，4000轉(zhuǎn)/ 分鐘，30分鐘X3次，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物。凍干產(chǎn)物。如圖5所示，為化合物1 的1H匪R核磁圖。產(chǎn)物中dendrimer和RGD的比值通過3. 3-2. 2ppm處的dendrimer質(zhì)子 積分和7. 2-6. 7ppm處的RGD側(cè)鏈苯環(huán)的質(zhì)子積分來計算，大約RGD/dendrimer約為5。3、化合物2的合成將化合物1溶于2ml 0. 5M HEPES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，pH 8. 3)溶液中。 79mg(7. 94X 10_5mOl，128倍.)D0TA_N_羥基琥珀酰亞胺酯白色粉末逐漸加入到上述溶液 中，邊加邊攪拌，并用PH計監(jiān)測溶液的pH值，整個過程中用5. OM NaOH(氫氧化鈉)溶液 使溶液PH值控制在8. 5左右。常溫下攪拌3小時后(或者過夜)，混合物用純水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化，以去除沒有結(jié)合的DOTA螯合劑。凍干產(chǎn) 物。如圖6所示，為化合物2的1H NMR核磁圖譜。DOTA標(biāo)記在dendrimer的數(shù)量可以通過 3. 3-2. 2ppm處的dendrimer及DOTA的質(zhì)子積分來定量，約為95個。4、化合物3的合成19. 6mg Gd2 (CO3) 3.(碳酸釓)(3. 97 X l(T5mol，64 倍.)力口入到溶于 2mL 0. IM HEPES(pH 8.3)溶液的化合物2中。此懸濁液在60°C下攪拌過夜。多余的Gd2 (CO3)3離心 沉淀(2000rpm，8分鐘)，然后上清液用純水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超 濾純化，最后獲得Den-RGD化合物。5、化合物4的合成0. 7mg(l. 24X 10_6mOl，2. 0倍.)的羅丹明_N_羥基琥珀酰亞胺酯和
1.8mg(l. 24 X 10_6mOl，2. 0倍)的Cy5. 5-NHS (青色素染料5. 5-N-羥基琥珀酰亞胺酯)分 別溶解在50 μ L無水的DMF中，然后緩慢逐滴加入1. OmL的化合物3的0. IM HEPES溶液 (pH 8.3)。常溫下攪拌1小時，熒光基團標(biāo)記的化合物4用純水稀釋，用分子量IOOOODa截 斷的離心式過濾器超濾、純化，4000轉(zhuǎn)/分鐘，30分鐘Χ3次。最后得到羅丹明、Cy5. 5和 DOTA-Gd螯合劑修飾的樹枝狀大分子4紫色溶液。每個G5分子上標(biāo)記了約92個DOTA螯合 劑。另外，平均有1.4個羅丹明和1.1個Cy5. 5標(biāo)記到一個化合物分子上。最后的產(chǎn)率約 為 92%。對比例1如圖2所示，為不帶cRGDyK靶頭的對照納米探針的合成路線圖，所述不帶cRGDyK 靶頭的對照納米探針(Den-PEG)的具體步驟為1、化合物5的合成0. 7mg(l. 24X 10_6mol，2. 0倍.)羅丹明_N_羥基琥珀酰亞胺酯溶于50 μ L無水DMF 中，并緩慢逐滴加入攪拌中的ImL 17. 9mg(6. 2Xl(T7mol)G5的0. IM HEPES溶液中，pH 8. 3。 常溫下攪拌Ih后，混合液用純水稀釋后轉(zhuǎn)移到分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、 純化，4000轉(zhuǎn)/分鐘，30分鐘X3次，以除去水溶性的小分子副產(chǎn)物。1. 8mg(l. 24X10_6mol，
2.0倍.)Cy5. 5-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶于50 μ L無水DMF中，同羅丹明-N-羥基琥珀酰亞 胺酯一樣加入到上述產(chǎn)物的ImLO. IM HEPES溶液中，pH 8. 3。常溫下攪拌Ih后，這個連接 有雙熒光基團的樹枝狀大分子被超濾純化得到化合物5的紫色溶液。平均有1. 5個羅丹明 和1. 1個Cy5. 5標(biāo)記到一個化合物5分子上。產(chǎn)物凍干。2、化合物6的合成化合物5溶解在2. OmL IX PBS (pH 7.4)中，加入溶于2. OmL PBS中的 12. 4mg(6. 2X 10_6mOl，10倍，分子量為2kDa)PEG2k-N-羥基琥珀酰亞胺酯。常溫下攪拌lh。 產(chǎn)物用純水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化，4000轉(zhuǎn)/分鐘，30分 鐘X3次，得到的化合物6也為紫色溶液。產(chǎn)物凍干。圖7為化合物6的1H NMR核磁圖。 產(chǎn)物中dendrimer和PEG的比值通過3. 3-2. 2ppm處的dendrimer質(zhì)子積分和3. 7ppm處的 PEG質(zhì)子積分來計算，大約PEG/dendrimer約為10。3、化合物7的合成化合物6 溶于 2mL 0. 5M HEPES 緩沖液中，pH 8. 3。79mg(7. 94 X l(T5mol，128 倍·) 白色粉末的DOTA-N-羥基琥珀酰亞胺酯逐漸加入以上溶液中。溶液的pH值由pH計監(jiān)測，并用5. OM NaOH溶液調(diào)節(jié)在8. 5左右?；旌弦涸诔叵聰嚢?小時或者過夜，混合產(chǎn)物用 純水稀釋，通過分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化。DOTA螯合劑連接到G5上 的數(shù)量大約是95個。產(chǎn)物凍干。如圖8所示，為化合物7的1H NMR核磁圖。DOTA標(biāo)記在 dendrimer的數(shù)量可以通過3. 3-2. 2ppm處的dendrimer及DOTA的質(zhì)子積分來定量，約為 95個。4、化合物8的合成19. 6mg Gd2 (CO3) 3· (3. 97 X l(T5mol，64equiv.)加入到溶于 2mL 0. IM HEPES (pH 8.3)溶液的化合物2中。此懸濁液在60°C下攪拌過夜。多余的Gd2(CO3)3離心沉淀 (2000rpm，8分鐘)，然后上清液用純水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾純 化，最后獲得Den-PEG化合物。最后的產(chǎn)率約為90%。實施例1的產(chǎn)物與對比例1的產(chǎn)物的各項性能對比如下1、納米探針粒徑分布和Zeta電位的測定如下納米探針和未修飾的G5樹枝狀大分子在水溶液中的粒徑通過動態(tài)光散射的方法 測定。溶于蒸餾水的2. Omg/ml的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液對設(shè)備進行校準(zhǔn)。樣品用孔徑為 0.45 μ m的濾膜純化后并用IX PBS稀釋到100g/mL。納米探針的粒徑和分布通過動態(tài)光散 射儀加以測定。在測定納米探針的表面電荷時，納米探針溶液用0.45μπι的濾頭過濾并稀 釋到IOmM的NaCl溶液中。Den-RGD和Den-PEG的平均直徑是11. Inm和8. 6nm,平均Zeta電位是+10. 4和 +11. 6mV。如圖9所示，為Den-RGD的流體動力學(xué)粒徑分布和zeta電位示意圖，如圖10所 示，為Den-PEG的流體動力學(xué)粒徑分布和zeta電位示意圖。2、用ICP-AES測定納米探針中的Gd3+含量如下納米探針中的GcT 含量用 Hitachi P_4010model ICP-AES (Inductively Coupled PlasmaAtomic Emission Spectroscopy，電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀)進行測定，射頻 能量為1100W，噴霧器氣流速度為0. 9L/min。準(zhǔn)備好用3%硝酸溶解的Gd3+濃度分別為1， 5，10，20，50，100,200ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)繪相應(yīng)的色譜峰來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以對應(yīng)Gd3+含量。 0. ImM的納米探針母液用3%的硝酸稀釋100倍。樣品的Gd3+含量通過對Gd3+標(biāo)準(zhǔn)曲線擬 合得到。實驗結(jié)果顯示，Gd3+-DOTA配合物在探針Den-RGD和Den-PEG中的含量均平均達95 個。3、體外細胞毒性實驗如下(1)細胞培養(yǎng)原代C57小鼠肝星狀細胞用最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基在35mm直徑培養(yǎng)皿中 單層培養(yǎng)，即用加有10%胎牛血清(FBS)、1%青、鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA)的高 糖DMEM培養(yǎng)基(Gibico，USA)，置于有充分濕氣的含5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞 長滿80%的面積時可以消化收集，以使細胞保持在指數(shù)增長狀態(tài)。(2)體外細胞毒性實驗MTT(3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5_ 二苯基四氮唑溴鹽) 細胞增殖實驗用來測定用納米探針處理后的細胞的活力。處于指數(shù)增長期的細胞單層 用0.25%胰酶消化收集，得到單細胞懸液。用血細胞計數(shù)器和普通光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BH-2)來計數(shù)細胞。優(yōu)化細胞數(shù)量以使得在整個MTT實驗中，細胞處于指數(shù)增長期。因此， 用適量細胞培養(yǎng)液重懸細胞，在96孔板的每個孔中加入含有約2X IO3個細胞的100 μ L 單細胞懸液。每個濃度準(zhǔn)備了 8個復(fù)孔。細胞貼壁24小時后，用納米探針來處理這些細胞。樣品溶液用MILLEX^HV的0. 22 μ m注射器式濾器過濾除菌，并且終濃度的梯度范圍在 0. 05-10 μ M0在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，細胞用PBS沖洗干凈，然后用MTT來 測定細胞的活力。用納米探針處理過的細胞的活力用未處理過的細胞的值來進行標(biāo)準(zhǔn)化。 如圖11所示，為細胞毒性實驗曲線圖；4、模型小鼠肝MRI成像實驗如下每只肝纖維化模型C57小鼠從尾靜脈注射0. 05mmol/kg[Gd3+]，總共0. 25mL體積 的納米探針PBS溶液，收集注射前、后肝部動態(tài)Tl加權(quán)像。觀察Tl加權(quán)的磁共振信號在注 射后0-120分鐘和24小時的增強情況。注射2min后，非特異性的增強使得兩種納米探針 的信號增強基本相同，但是隨著時間的推移，它們的差異越來越明顯。Den-RGD的Tl加權(quán)磁 共振信號的增強很顯著，肝/肌肉磁共振信號比的增強在24小時可以達到25士3.9%，而 Den-PEG只能達到12. 8士6.2%。如圖12所示，為Tl加權(quán)磁共振信號圖。并且Den-R⑶能 在注射后2h清楚地顯示彌漫的小血管，而Den-PEG則不能。圖13為MRI顯像圖。5、模型小鼠肝冰凍切片熒光顯微鏡觀察如下體內(nèi)成像研究后，小鼠被麻醉，用PBS進行心臟灌流，肝被小心地剝離出來，取材， 用OCT包埋后迅速放入液氮中裝有異戊烷的燒杯中速凍30s lmin。然后切成15 μ m厚的 冰凍切片。切片被封片并用多光譜熒光顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)注射Den-RGD后，在纖維隔板處 可以看到明顯的星芒狀熒光分布。而在注射Den-PEG后的組織切片中則不能觀察到這種現(xiàn) 象。Den-RGD主要沉積在增生的纖維組織處，這些增生的纖維組織將形成假小葉。如圖14 所示，為模型小鼠肝冰凍切片熒光顯微鏡觀察圖。
權(quán)利要求
一種用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，包括載體，所述載體連接熒光基團和磁共振造影基團，并經(jīng)由橋連基團連接能夠與肝纖維化/肝硬化中肝星狀細胞表面上的受體相結(jié)合的靶向化合物基團。
2.如權(quán)利要求1所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 的載體為2-8代的PAMAM樹枝狀高分子。
3.如權(quán)利要求1所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 的熒光基團為羰花青類近紅外熒光染料基團以及非近紅外熒光染料基團中的至少一種。
4.如權(quán)利要求3所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 的羰花青類近紅外熒光染料基團為IR783基團或Cy5. 5基團。
5.如權(quán)利要求3所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 的非近紅外熒光染料基團為羅丹明基團。
6.如權(quán)利要求1所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 的磁共振造影基團為釓配合物Gd-DOTA基團。
7.如權(quán)利要求1所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 靶向化合物基團為C(RGDyK)基團。
8.如權(quán)利要求7所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 c (RGDyK)的制備方法為第一步將0. 4重量份的取代度為0. 6mmol/g的樹脂-Gly用二氯甲烷沖洗并溶脹，用 N，N-二甲基甲酰胺洗滌；第二步用20vol%哌啶脫保護，用N，N- 二甲基甲酰胺洗滌；將Fmoc-Arg(Pbf)-OH與 1-羥基苯并三唑混合，用苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽和N，N- 二異丙基 乙胺溶解，其中，F(xiàn)moc-Arg (Pbf) -OH、1-羥基苯并三唑、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲 六氟磷酸鹽以及N，N-二異丙基乙胺與樹脂-Gly的比例分別為1.2mm0l-1.3mm0l 0. 4g, 0. 15g-0. 2g 0. 4g，2. 4ml-2. 5ml 0. 4g，0. 4ml_0. 5ml 0. 4g ；將所得溶液加入到第一步 的樹脂中，恒溫振蕩器上反應(yīng)45分鐘，用N，N-二甲基甲酰胺洗滌，進行茚三酮檢測確定是 否反應(yīng)完全；第三步將 Fmoc-Arg (Pbf) -OH 依次替換為 Fmoc-Lys (Boc) -OH,Fmoc-D-Tyr (tBu) -OH 和 Fmoc-Asp (otBu) -0H,重復(fù)進行第二步，得到連接在樹脂上的整條被保護線狀肽鏈H-Asp (ot Bu) -D-Tyr (tBu) -Lys (Boc) -Arg (Pbf) -Gly (2-Cl-Trt) -OH ；用 20vol % 哌啶脫保護，分別用 N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷沖洗，用二氯甲烷和三氟乙酸的混合液切割，切割液抽吸入 裝有吡啶和甲醇的燒瓶中，最后用甲醇沖洗樹脂，沖洗液也抽吸入燒瓶中，旋蒸去除二氯甲 烷和甲醇，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用蒸餾水沉淀出絮狀粗品，用砂芯漏斗過濾得沉 淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸餾水，超聲分散沉淀，冷凍干燥得到粗品；第四步將第三步所得的粗品0. 19-0. 2重量份溶解于N，N-二甲基甲酰胺，加入二氯甲 烷，加入N，N- 二異丙基乙胺0. 019-0. 02重量份以及六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡 咯烷基磷0. 06-0. 07重量份進行環(huán)化，常溫下攪拌3 4小時，旋蒸去除二氯甲烷，加蒸餾 水沉淀出多肽，用砂芯漏斗過濾得沉淀，用乙腈溶解，旋蒸去乙腈，加入蒸餾水，超聲分散沉 淀，冷凍干燥；用三氟乙酸和蒸餾水的混合物脫保護，常溫下磁力攪拌3 4小時，用冰乙醚 沉淀，砂芯漏斗過濾得沉淀，用蒸餾水溶解，制備型HPLC純化、冷凍干燥得到c (RGDyK)。
9.如權(quán)利要求1所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，所述 橋連基團為聚乙二醇基團。
10.權(quán)利要求1所述用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針的制備方法，其特征在 于，具體步驟為第一步將靶向化合物溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺，加入溶于N，N-二甲 基甲酰胺的馬來酰亞胺_橋連基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯，常溫攪拌反應(yīng)得到與橋連基 團相連的靶向化合物，加入溶于磷酸鹽緩沖液的載體，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量 IOOOODa截斷的離心式過濾器用純水進行超濾、純化，去除水溶性的小分子副產(chǎn)物，冷凍干 燥得到與靶向基團相連的載體；第二步將第一步中所得的與靶向基團相連的載體溶于4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液 中，加入DOTA-N-羥基琥珀酰亞胺酯，邊加邊攪拌，整個過程中加入氫氧化鈉溶液使溶液pH 值控制在8. 4-8. 6，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、 純化，去除沒有結(jié)合的DOTA-N-羥基琥珀酰亞胺酯，冷凍干燥后溶于4-羥乙基哌嗪乙磺酸 緩沖液中，加入碳酸釓，60°C下攪拌過夜，離心沉淀除去多余的碳酸釓，用水稀釋，用分子量 IOOOODa截斷的離心式過濾器超濾、純化，冷凍干燥得到與靶向基團和磁共振造影基團相連 的載體；第三步將熒光基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，將第二步得 到的與靶向基團和磁共振造影基團相連的載體溶于4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中，滴加 上述熒光基團-N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液，常溫攪拌反應(yīng)，用水稀釋，用分子量IOOOODa截 斷的離心式過濾器超濾、純化，得到與熒光基團、磁共振造影基團和靶向基團相連的載體， 即為用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針及其制備方法。所述的用于早期肝纖維化診斷的多模式靶向探針，其特征在于，包括載體，所述載體連接熒光基團和磁共振造影基團，并經(jīng)由橋連基團連接能夠與肝纖維化/肝硬化中肝星狀細胞表面上的受體相結(jié)合的靶向化合物基團。其制備方法為將能夠與肝纖維化/肝硬化中肝星狀細胞表面上的受體相結(jié)合的靶向化合物基團與橋連基團相連，依次在載體上連接靶向化合物基團、熒光集團以及磁共振造影基團。在利用本發(fā)明的靶向探針進行肝纖維化的診斷和評估時，具有較高靈敏度。
文檔編號A61K49/12GK101991867SQ20101051591
公開日2011年3月30日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者嚴蕙蕙, 李聰, 王吉耀 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;復(fù)旦大學(xué)