專利名稱：一種高繁殖能力豬圓環(huán)病毒2型毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用病毒分子遺傳學(xué)技術(shù)改造獲得的高繁殖能力的豬圓環(huán)病毒2型新毒株及其在制備滅活疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
根據(jù)豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列,可將其分為兩個(gè)基因型，即豬圓環(huán)病毒I型(PCVl)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。PCV2是近十年新出現(xiàn)的一種可引起豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirusvirus-associated disease,PCVAD)的病毒。PCV2對(duì)豬的致病性以免疫系統(tǒng)的損傷為特征，使感染豬處于嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)，臨床上主要表現(xiàn)為消瘦、淋巴結(jié)腫大等病變，與多種病原 混合感染還可導(dǎo)致多系統(tǒng)衰竭、呼吸困難、繁殖障礙等。豬圓環(huán)病毒屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。在電鏡下，PCV2是一種無囊膜的呈二十面體對(duì)稱的圓形小顆粒病毒，直徑17nm，具有單股環(huán)狀的DNA基因組。對(duì)氯仿、碘酒、酒精等有機(jī)溶劑不敏感，可在70°C穩(wěn)定存活15分鐘。但對(duì)苯酚、季胺類化合物、氫氧化鈉和氧化劑等試劑較敏感。目前已發(fā)現(xiàn)1768、1767個(gè)核苷酸組成的不同基因組大小的PCV2毒株，二者的核苷酸同源性在90%以上。PCV2基因組研究可將PCV2分為PCV2a、PCV2b和PCV2c三個(gè)基因亞型，三型之間基因組核苷酸和氨基酸同源性均在95%左右。PCV2基因組含有11個(gè)閱讀框，即ORFl 0RF11，各閱讀框大小相差懸殊。其中0RF1、0RF5、0RF7、0RF10 的 5’ -3’ 方向相同，0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 0RF11的5’ -3’方向相同，這些閱讀框表現(xiàn)為基因部分重疊，可充分利用圓環(huán)病毒有限的遺傳物質(zhì)。近來年，PCV成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，很多學(xué)者采用不同方式構(gòu)建了 PCVl及PCV2的感染性克隆，并將其拯救出的重組病毒應(yīng)用于相關(guān)研究中。授權(quán)公告號(hào)為CN101423836B的中國發(fā)明專利公開了一種豬圓環(huán)病毒I型感染性克隆及其所拯救的病毒和應(yīng)用，該發(fā)明將豬圓環(huán)病毒I型的2個(gè)基因組順式連接插入到PUC19載體中構(gòu)建獲得感染性分子克隆，并在該感染性克隆中插入Sal I酶切位點(diǎn)作為分子靶標(biāo)，所拯救出的重組病毒帶有分子靶標(biāo)，可用PCR結(jié)合RFLP將其與親本病毒相鑒別，并將該拯救病毒用于制備檢測(cè)豬圓環(huán)病毒I型抗體的試劑或藥物中。目前，PCV2感染引起的豬圓環(huán)病毒病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，病毒感染產(chǎn)生的免疫抑制能夠?qū)е卢F(xiàn)有疫苗免疫失敗，造成多種病原混感，并使疫病流行更加嚴(yán)重。采用疫苗免疫已成為控制PCV2相關(guān)疾病的關(guān)鍵，是減少經(jīng)濟(jì)損失的有效方法。PCV2體外培養(yǎng)時(shí)病毒滴度低，是疫苗價(jià)格高昂的根本原因，也是當(dāng)今疫苗研制的最大障礙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有高繁殖能力(高滴度)的豬圓環(huán)病毒2型新毒株，解決了現(xiàn)有PCV2毒株繁殖能力差，應(yīng)用于開發(fā)疫苗成本高的問題。一種豬圓環(huán)病毒2型毒株，命名為豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株，簡(jiǎn)寫為PCV2-ZJ/H株，該毒株于2012年7月17日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6391。所述豬圓環(huán)病毒2型毒株通過方法制得(I)以PCV2-HZ0201病毒的基因組DNA為模板，以FSAC和RSAC為引物擴(kuò)增PCV2全基因序列，然后凝膠純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，連接到質(zhì)粒pMD18-T，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒PMD-HZ0201。FSAC GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT
RSAC GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA(2)以構(gòu)建好的PMD-HZ0201質(zhì)粒為模板，利用核苷酸缺失特異性引物進(jìn)行Dpn I定點(diǎn)誘變擴(kuò)增，然后凝膠純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，連接到質(zhì)粒pMD18-T，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pMD-ZJ/H。(3)經(jīng)過序列測(cè)定正確的pMD-ZJ/H重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶Sac II酶切，用T4DNA連接酶環(huán)化，再將環(huán)化質(zhì)粒用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，收獲病毒粒子的細(xì)胞培養(yǎng)物。(4)然后通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)方法驗(yàn)證拯救的病毒PCV2ZJ/H。對(duì)拯救的病毒進(jìn)行傳代，用間接免疫熒光方法測(cè)定不同代次的病毒半數(shù)感染量(TCID5tl)，比較拯救病毒與親本病毒在PK-15細(xì)胞上的繁殖能力。經(jīng)過細(xì)胞傳代培養(yǎng)和IFA測(cè)定，拯救出的PCV2-ZJ/H病毒粒子在PK-15細(xì)胞中的病毒效價(jià)(TCID5tl)達(dá)到107 6/mL，比親本病毒(106 3/mL)的毒價(jià)高出10倍以上。本發(fā)明還提供了一種所述豬圓環(huán)病毒2型PCV2-ZJ/H毒株的基因，所述基因的堿基序列如SEQ ID NO. I所示，相對(duì)于野生型毒株，該毒株基因組核苷酸序列中的1376位點(diǎn)的核苷酸缺失。本發(fā)明又提供了一種包含所述基因的重組載體，所述載體的原始載體可以是PMD18-T。本發(fā)明還提供了所述豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株在制備滅活疫苗中的應(yīng)用，所述滅活疫苗主要用于預(yù)防動(dòng)物感染豬圓環(huán)2型病毒，所述動(dòng)物可以是豬。本發(fā)明提供了一種利用所述豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株制備滅活疫苗的方法，包括以豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株為毒種制備病毒液，病毒液經(jīng)滅活、稀釋后與佐劑混合，即制得滅活疫苗。所述病毒液的效價(jià)為大于107_°TCID5Q/mL。所述滅活采用試劑為P -丙內(nèi)酯，其在病毒液中終濃度一般為0. 05 I. 0%。所述免疫佐劑一般選用礦物油類佐劑、天然藥物類佐劑或鋁膠佐劑，所述礦物油累佐劑可以選用ISA206VG，佐劑與稀釋后的病毒液體積比一般為5 : 5 9 : I。本發(fā)明提供利用所述豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株制的備滅活疫苗。本發(fā)明通過核苷酸缺失、基因移碼技術(shù)和感染性克隆技術(shù)人工制造了一株具有高繁殖能力的豬圓環(huán)病毒2型新毒株，為推動(dòng)PCV2的疫苗開發(fā)提供了新的毒種資源。本發(fā)明病毒具有高繁殖能力，在PK-15細(xì)胞中的病毒效價(jià)(TCID5tl)達(dá)到107 6/mL，比親本病毒(IO63AiL)的毒價(jià)高出10倍以上，利用它制得的疫苗具有良好的免疫保護(hù)力。


圖I為突變體以及HZ0201正常基因的SacII酶切鑒定圖(M泳道DNAMarker ;泳道A-D :突變體克隆酶切；圖2為1376位點(diǎn)缺失體拯救后的PCV2/Cap蛋白單克隆抗體檢測(cè)；圖3為PCV2-ZJ/H株繁殖能力測(cè)定圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I核苷酸位點(diǎn)1376缺失突變株感染性克隆構(gòu)建與鑒定I. I病毒、細(xì)胞和質(zhì)粒PCV2-HZ0201 株(Genbank NO. AY188355)，大腸桿菌菌株 TG1、載體 pMD18_T、PCV 陰性PK-15細(xì)胞系、PCV2/Cap蛋白單克隆抗體、FITC羊抗鼠IgG，均為試驗(yàn)材料，無特異性要求。其中，PCV2/Cap蛋白單克隆抗體、FITC羊抗鼠IgG的制備可以參考文獻(xiàn)(ShangSB et al. Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcinecircovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2.MolecularImmunology. 2009. 46 :327-334)，其余為市售產(chǎn)品。I. 2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中提供的PCV2-HZ0201株序列，針對(duì)1376 1379bp設(shè)計(jì)連續(xù)的單核苷酸缺失。應(yīng)用Prime5. 0生物軟件，設(shè)計(jì)合成I對(duì)擴(kuò)增PCV2基因組全長(zhǎng)的引物FSAC和RSAC，表中劃線部分為SacII酶切位點(diǎn)；1對(duì)擴(kuò)增0RF2的引物F0RF2和R0RF2 ；4對(duì)構(gòu)成單核苷酸缺失的引物，F(xiàn)1376/R1376造成1376位點(diǎn)缺失，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為A ；F1377/R1377造成1377位點(diǎn)缺失，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為B ;F1378/R1378造成1378位點(diǎn)缺失，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為C ;F1379/R1379造成1379位點(diǎn)缺失，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為D。具體引物序列如表I所示，引物均由上海生工生物工程公司合成，用前溶解于滅菌超純水中至終濃度10 u mol/L, _20°C保存?zhèn)溆?。表I PCR擴(kuò)增所用引物
引物名稱引物序列(5' —3')
F1376GAATAACAGCACTGAGCCCACTCCCCT
R1376AGTGGGCTCAGTGCTGTTATTCT
F1377CTAGAATAACAGCACTGGGCCCACTCC
R1377AGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTA
F1378CTAGAATAACAGCACTGGACCCACTCR1378GAGTGGGTCCAGTGCTGTTATTCTA
F1379CTAGAATAACAGCACTGGAGCCACT
R1379GAGTGGCTCCAGTGCTGTTATTCTA
FSACGAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT
RSACGCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA
F0RF2GAGGATCCATGACGTATCCMGGAGG
R0RF2GCCCTCGAGTTMGGGTTAAGTGGGI. 3PCV2全基因組擴(kuò)增及純化 將PCV2-HZ0201株(105 75TCID50/mL)以I : 10懸浮接種到PK15細(xì)胞中，感染后72h收毒，將細(xì)胞放置_70°C冰箱反復(fù)凍融三次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，12，000r/min離心5min，取上清病毒液抽提病毒DNA。以上述抽提的PCV2-HZ0201株病毒DNA為模板，利用特異性引物FSAC和RSAC擴(kuò)增PCV2基因組全長(zhǎng)。PCR 反應(yīng)體系為2. 5 ii L IOXPCR buffer, FSAC 和 RSAC 引物各 0. 5 y L，0. 5 u LdNTP, 0. 12 u I Probest DNA polymerase,質(zhì)粒模板 < 200ng,去離子水補(bǔ)足至25 u L0充分混勻后，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5min，35個(gè)循環(huán)[94°C變性15s，55°C退火45s，72°C延伸 2min], 72°C總延伸 IOmin0得到的PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后凝膠純化回收試劑盒(AXYGENAP-GX-250)純化PCR產(chǎn)物，與載體pMD18-T連接構(gòu)建pMD_HZ0201質(zhì)粒模板。I. 4單核苷酸缺失突變體構(gòu)建以構(gòu)建好的pMD-HZ0201質(zhì)粒為模板，利用表I中的4對(duì)構(gòu)成單核苷酸缺失的引物分別進(jìn)行Dpn I定點(diǎn)誘變得到不同位點(diǎn)單核苷酸缺失基因序列。PCR 反應(yīng)體系2. L 10 X PCR buffer，上下游引物各 0. 5 y L，0. 5 y LdNTP，0. 12 u I Probest DNA polymerase 高保真酶，質(zhì)粒模板< 200ng, ddH20 補(bǔ)足至 25 u L。PCR 程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 5min，15 個(gè)循環(huán)；72°C總延伸lOmin。得到的PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將PCR產(chǎn)物(不同位點(diǎn)單核苷酸缺失基因序列)分別連接PMD18-T質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，得到不同單核苷酸缺失重組質(zhì)粒。I. 5單核苷酸缺失病毒拯救對(duì)抽提的單核苷酸缺失重組質(zhì)粒進(jìn)行SacII酶切，酶切鑒定結(jié)果如圖I所示，回收點(diǎn)缺失后的基因，回收的目的基因即為帶有SacII酶切位點(diǎn)末端的DNA，在滅菌的EP管內(nèi)加A T4連接酶連接環(huán)化病毒。連接體系為T4DNA連接酶Iii L，酶切回收的目的基因彡Iii g，連接Buffer IuL,混勻后，于16 °C連接過夜。連接產(chǎn)物用脂質(zhì)體2000(invitrogen)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞吸取培養(yǎng)液；用PBS清洗3次。每孔加入適量甲醇/丙酮(I I)覆蓋細(xì)胞表面，_20°C固定20min，棄去固定液，在通風(fēng)處晾干。加入5%的脫脂奶2mL，封閉40 60min。棄去脫脂奶，分別將抗PCV2/Cap蛋白單克隆抗體在脫脂奶內(nèi)稀釋到適當(dāng)比例,加入孔內(nèi)，孵育60min。棄去混合液，用PBS清洗3次，每次3min。將FITC羊抗鼠IgG在脫脂奶內(nèi)稀釋到適當(dāng)比例，加入孔內(nèi)，再次孵育60 90min。棄去混合液，用PBS清洗3次，每次3min。清洗完，每孔加入100 u L的防猝滅劑，放置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖2所示，1376 1379點(diǎn)缺失病毒轉(zhuǎn)染后的PO代傳代到Pl代后，1376位點(diǎn)缺失病毒能繼續(xù)傳代，且各代次均能檢測(cè)到熒光，說明病毒拯救成功。將基因組中1376位點(diǎn)缺失的病毒毒 株命名為豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus) 2型ZJ/H株，該毒株于2012年7月17日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為 CGMCC No. 6391。實(shí)施例2單位點(diǎn)核苷酸缺失毒株的體外復(fù)制能力2. I試驗(yàn)方法通過對(duì)原代和傳代病毒的間接免疫熒光(IFA)的檢測(cè)，得到拯救成功的突變病毒。將突變病毒PO代感染PK-15細(xì)胞，37°C培養(yǎng)72h后，放置_70°C，反復(fù)凍融三次，用濾器過濾除菌后收集病毒液。以I : 10懸浮接種PK-15細(xì)胞，進(jìn)行病毒的傳代培養(yǎng)。連續(xù)在PK-15細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)8代至毒價(jià)穩(wěn)定。2.2繁殖能力測(cè)定將拯救成功的？(^2^/11病毒以1 : 10感染PK-15細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此過程中，病毒的毒力逐漸增強(qiáng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)8代至毒價(jià)穩(wěn)定，對(duì)各病毒進(jìn)行復(fù)制能力測(cè)定。每一代均測(cè)所培養(yǎng)病毒的TCID5Q。分別取PCV2-ZJ/H的病毒液用MEM稀釋，從KT1至10_1(1，共10個(gè)梯度，將稀釋好的病毒液加入到96孔板中(每孔IOOii I)，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)重復(fù)孔；于5% CO2和37°C條件下培養(yǎng)72h ;用PBS洗三遍，固定液于_20°C固定20min ;5%的脫脂奶37°C封閉2h ;加入PCV2/Cap蛋白單克隆抗體；用PBST沖洗3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG，37°C作用Ih ；用PBST洗3次，熒光顯微鏡觀察是否產(chǎn)生綠色熒光；按Reed-Muench方法計(jì)算每代培養(yǎng)病毒的 TCID500結(jié)果如圖3所示。PCV2-ZJ/H株(1376位點(diǎn)缺失病毒)在傳代到第8代后病毒的TCID50 已達(dá)到 107 7!!^，野生毒株？(^2-1120201 的 TCID5tl 為 106 3/mL，拯救的 PCV2-ZJ/H 病毒比野生型毒株高10倍以上。實(shí)施例3本發(fā)明毒株制備的滅活疫苗對(duì)小鼠的保護(hù)力試驗(yàn)應(yīng)用清潔級(jí)Balb/C小鼠對(duì)PCV2-ZJ/H株的免疫原性進(jìn)行測(cè)定。3. I用本發(fā)明毒株制備滅活疫苗將效價(jià)大于107_°TCID5Q/ml的PCV2-ZJ/H株病毒液用終濃度為0.05% ￠-丙內(nèi)酯在4°C滅活48小時(shí)，37 °C水浴2小時(shí)，將滅活的毒液以MEM培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按3 I (v/v)比例，將毒液與ISA206VG佐劑(法國賽比克)混合、乳化，制備成水包油型PCV2-ZJ/H株滅活疫苗。3. 2試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)方案PCV2抗原及抗體檢測(cè)陰性的8周齡清潔級(jí)BALB/C小鼠隨機(jī)分組，每組10只。攻毒后觀察小鼠的食欲、健康狀況。于攻毒前斷尾采血和攻毒后剖殺采血，分離血清。免疫后第21天用PCV2-ZJ/H株攻擊，每只腹腔注射0. 2ml，攻毒21天時(shí)剖殺取脾組織，組織用于病毒分離。3. 3疫苗的小鼠免疫效力評(píng)價(jià)將小鼠組織稱重，按I : 20比例加入MEM無血清培養(yǎng)基、用組織研磨器25次/s震蕩研磨3min，研磨完畢凍融3次后，離心取上清，過濾除菌收集。PK15細(xì)胞單層用PBS沖洗，0. 05%的胰酶置37°C消化5 8分鐘，用MEM培養(yǎng)基配制成濃度為I X 106/ml的細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液按10 I的比例與小鼠組織研磨慮液混合后接種12孔細(xì)胞板，置37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)后，收獲細(xì)胞凍融3次。連續(xù)盲傳三代。盲傳I 3代的細(xì)胞培養(yǎng)單層，棄細(xì)胞上清，細(xì)胞單層用I : I冷丙酮-甲醇液于-20°C固定30分鐘。在37°C下，5%奶粉液中封閉；PBST清洗；PBST稀釋的PCV2/Cap蛋白單克隆抗體，37°c下孵育；PBST清洗Jpfitc標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育；pbst清洗；直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，不免疫攻毒小鼠脾臟的病毒分離率為80%;0. 2ml劑量組在免疫后21天攻毒的病毒分離陽性率為20%。實(shí)施例4本發(fā)明毒株制備的滅活疫苗對(duì)仔豬的保護(hù)力試驗(yàn)應(yīng)用PCV2抗體和抗原陰性的健康仔豬，對(duì)PCV2-ZJ/H株的免疫原性進(jìn)行了測(cè)定。4. I本發(fā)明毒株的滅活與乳化將效價(jià)為大于107_°TCID5Q/ml的PCV2-ZJ/H株病毒液用終濃度為0. 05% 3 _丙內(nèi)酯在4°C滅活48小時(shí)，37°C水浴2小時(shí)。將滅活的毒液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，按3 I (v/v)比例，將毒液與ISA206VG佐劑(法國賽比克)混合、乳化，制備成水包油型PCV2-ZJ/H株滅活疫苗。4. 2試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)方案選擇PCV2抗體和抗原陰性的14 18日齡健康仔豬12頭，隨機(jī)分為2組，每組5頭。第I肌肉注射PCV2-ZJ/H株滅活疫苗，2ml/頭；第2組不注射疫苗的空白對(duì)照組。免疫后第21天用PCV2-ZJ/H株攻擊，每頭豬滴鼻1ml、肌肉注射2ml。免疫后第7、14天采血。攻毒后第14天剖殺各組動(dòng)物，采集肺臟、脾臟、肺門淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、髂淋巴結(jié)，進(jìn)行PCV2病毒分離。4. 3疫苗的仔豬免疫效力評(píng)價(jià)將組織勻漿(I 3)用0. 22 iim濾膜過濾除菌，按I : 10比例接種新鮮消化的PK-15細(xì)胞，于37°C、5% C02條件下培養(yǎng)72h后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融三次后，接種下一代。連續(xù)盲傳1-3代的細(xì)胞單層，棄細(xì)胞上清。細(xì)胞單層用I : I冷丙酮-甲醇液于-20°C固定30分鐘。細(xì)胞單層用I : I冷丙酮-甲醇液于_20°C固定30分鐘。在37°C下，5%奶粉液中封閉；PBST清洗；PBST稀釋的PCV2/Cap蛋白單克隆抗體，37°C下孵育；PBST清洗；加FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育；PBST清洗；直接在倒置熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，疫苗免疫組病料在PK-15細(xì)胞傳代3次后，除了 I頭豬肺臟分離到PCV2病毒，其他組織均未分離到病毒，保護(hù)率為80%。未用疫苗免疫的空白對(duì)照組病料在PK-15細(xì)胞傳代2次，均能分離到病毒，病毒分離陽性率為100% (5/5)。不同組織的病毒分離結(jié)果顯示(表2)，攻毒后不同組織病毒分離陽性率有很大差異，以腹股溝淋巴結(jié)和肺臟病毒分離陽性率為最高，而髂淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)病毒分離陽性率最低。表2仔豬不同組織PCV2再分離結(jié)果
動(dòng)物髂淋腹股溝腸系膜下頌肺門肩前組力Il 脾臟肺臟__Mfi____巴結(jié)淋巴結(jié)淋巴結(jié)淋巴結(jié)淋巴結(jié)淋巴結(jié)
疫苗免疫組 5 0/5 1/5 0/5 0/5__0/50/5 0/50/5·
I'I I 5 4/5 5/5 3/5 5/53/55/5 5/53/5注*分子為病毒分離陽性動(dòng)物數(shù)量，分母為免疫動(dòng)物數(shù)量。
權(quán)利要求
1.ー種豬圓環(huán)病毒2型毒株，其特征在于，命名為豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株，保藏號(hào)為CGMCC No. 6391。
2.如權(quán)利要求I豬圓環(huán)病毒2型毒株的基因，其特征在于，所述基因的堿基序列如SEQID NO. I 所示。
3.ー種包含權(quán)利要求2所述基因的重組載體。
4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，原始載體為質(zhì)粒PMD18-T。
5.如權(quán)利要求I所述豬圓環(huán)病毒2型毒株在制備滅活疫苗中的應(yīng)用。
6.ー種利用如權(quán)利要求I所述豬圓環(huán)病毒2型毒株制備滅活疫苗的方法，包括 以豬圓環(huán)病毒2型ZJ/H株為毒種制備病毒液，病毒液經(jīng)滅活、稀釋后與佐劑混合，即制得滅活疫苗。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述滅活所采用試劑為￠-丙內(nèi)酷。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒液的效價(jià)大于107_°TCID5(l/mL。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述佐劑為ISA206VG。
10.如權(quán)利要求6 9任一所述方法制備的滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高繁殖能力豬圓環(huán)病毒2型毒株及其應(yīng)用，豬圓環(huán)病毒2型毒株，命名為PCV2-ZJ/H株，保藏號(hào)為CGMCC No.6391，基因序列如SEQ ID NO1所示，該毒株基因組核苷酸序列中的1376位點(diǎn)的核苷酸缺失。本發(fā)明病毒具有高繁殖能力，在PK-15細(xì)胞中的病毒效價(jià)(TCID50)達(dá)到107.6/mL，比親本病毒(106.3/mL)的毒價(jià)高出10倍以上，利用它制得的疫苗具有良好的免疫保護(hù)力。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102787100SQ20121031268
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者周繼勇, 金玉蘭 申請(qǐng)人:浙江同點(diǎn)生物科技有限公司