專利名稱：一株地中海假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株地中海假單胞菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界上存在著大面積鹽堿土地 和次生鹽潰化土壤。隨著人口、糧食、土地及能源矛盾的加劇，尤其隨著一些大型水利工程的修建，次生鹽潰化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，因此對(duì)鹽潰化土地的開(kāi)發(fā)和防治次生鹽潰化問(wèn)題十分迫切。土壤鹽堿化是人類面臨的生態(tài)危機(jī)之一。鹽脅迫不僅會(huì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，并且高濃度鹽脅迫會(huì)造成植物生物量降低甚至死亡。鹽堿脅迫幾乎會(huì)影響植物每個(gè)重要生理過(guò)程，鹽脅迫條件下，植物生長(zhǎng)受抑制，新陳代謝受到影響，光合作用中光合鏈被破壞，導(dǎo)致大量積累電子，致使植物細(xì)胞內(nèi)的線粒體、葉綠體和過(guò)氧化物體上產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源活性氧，活性氧使線粒體和葉綠體受到傷害，破壞體內(nèi)蛋白、核酸等生物大分子，誘發(fā)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，破壞細(xì)胞離子平衡，致使新陳代謝紊亂。其中堿脅迫在鹽脅迫的基礎(chǔ)上還增加了高PH，所以對(duì)植物的影響比鹽更嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致植物死亡。目前土壤修復(fù)的方法主要有物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法，采取物理、化學(xué)法去除法往往耗資巨大，而且會(huì)伴有二次污染的產(chǎn)生，不適于處理大面積的污染。微生物治理法需要特定的培養(yǎng)和技術(shù)條件，實(shí)施起來(lái)往往達(dá)不到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果。目前研究人員基本是通過(guò)品種間雜交等常規(guī)手段選育抗逆性品種，對(duì)現(xiàn)有植物物種進(jìn)行抗逆性篩選，利用現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)造新的抗逆性品種的途徑開(kāi)展抗逆性育種工作。通過(guò)對(duì)種子和幼苗進(jìn)行抗逆性鍛煉，合理施肥，化學(xué)調(diào)控及其他措施來(lái)改進(jìn)栽培措施提高植物抗逆性。而近些年來(lái)，通過(guò)接種有益微生物提高植物抗逆性的研究，越來(lái)越引起人們的關(guān)注。接種菌根真菌(mycorrhizalfungi)。菌根(mycorrhiza)是土壤中的一類真菌與高等植物的根系所建立的互惠共生體，參與菌根形成的真菌稱為菌根真菌。而某些真菌無(wú)法純培養(yǎng)，菌劑的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，耗費(fèi)大，接種技術(shù)實(shí)施困難，不能播種，只能大量移栽它的宿主植物，且有自然條件下接種效果不穩(wěn)定等因素，一定程度上制約了其大面積的實(shí)際推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一株地中海假單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的一株地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年6月26日，保藏號(hào)為CGMCCN0. 6292。本發(fā)明的一株地中海假單胞菌作為菌肥用于作物栽培上。本發(fā)明地中海假單胞菌(Pseudomonnas mediterranea)MJM_3為革蘭氏陰性菌，該菌株在ADF培養(yǎng)基上形成圓形、不透明、淡黃色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落(如圖I所示)。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》對(duì)分離出的菌株MJM-9進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、檸檬酸鹽作用生理生化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和鑒定。結(jié)果表明地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3為革蘭氏陰性菌，表現(xiàn)出接觸酶陽(yáng)性，淀粉水解陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，甲基紅、乙酰甲基甲醇、檸檬酸鹽作用實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性。本發(fā)明包含以下有益效果本發(fā)明的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3具有ACC脫氨酶活性，產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素IAA，合成嗜鐵素；可在鹽堿脅迫環(huán)境中有效地促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)以及提高植物在逆境條件下抗逆能力。其在作物栽培上的應(yīng)用，能夠增進(jìn)肥
效，提聞廣量。本發(fā)明的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3可以通過(guò)間接分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對(duì)植物產(chǎn)生不良影響，并通過(guò)產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。本發(fā)明的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3 含有的 I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脫氨酶的PGPR能水解植物體內(nèi)生物合成乙烯的直接前體ACC，產(chǎn)生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當(dāng)這種菌附著在種子表皮時(shí)，它能水解ACC，降低種子在逆境條件下大量產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)抑制劑和植物衰老劑-乙烯濃度，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)。


圖I為地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3在ADF培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)照片；圖2表不地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3在不同濃度色氨酸條件下IAA合成含量變化柱狀圖；圖3表不地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3嗜鐵素檢測(cè)平板效果照片；圖4表不地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3在鹽喊脅迫條件下對(duì)苜蓿促生效果照片；其中，CK為對(duì)照組苜蓿促生效果照片，MJM-3為地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3 苜猜促生效果照片；圖5表示地中海假單胞菌(Pseudomonas meditrranea) MJM-3在鹽堿脅迫條件下對(duì)小麥促生效果照片；其中，CK為對(duì)照組小麥促生效果照片；MJM-3為地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3 小麥促生效果照片。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的一株地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea) MJM-3,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年6月26日，保藏號(hào)為CGMCCNO. 6292。本實(shí)施方式地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3為革蘭氏陰性菌，該菌株在ADF培養(yǎng)基上形成圓形、不透明、淡黃色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落(如圖I所示)。
根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》對(duì)分離出的菌株MJM-9進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、檸檬酸鹽作用生理生化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和鑒定。結(jié)果表明地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3為革蘭氏陰性菌，表現(xiàn)出接觸酶陽(yáng)性，淀粉水解陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，甲基紅、乙酰甲基甲醇、檸檬酸鹽作用實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性。本實(shí)施方式的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3具有ACC脫氨酶活性，產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素IAA，合成嗜鐵素；可在鹽堿脅迫環(huán)境中有效地促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)以及提高植物在逆境條件下抗逆能力。其在作物栽培上的應(yīng)用，能夠增進(jìn)
肥效，提高產(chǎn)量。本實(shí)施方式的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3可以通過(guò) 間接分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對(duì)植物產(chǎn)生不良影響，并通過(guò)產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。本發(fā)明的地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea)MJM_3 含有的 I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脫氨酶的PGPR能水解植物體內(nèi)生物合成乙烯的直接前體ACC，產(chǎn)生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當(dāng)這種菌附著在種子表皮時(shí)，它能水解ACC，降低種子在逆境條件下大量產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)抑制劑和植物衰老劑-乙烯濃度，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式的一株地中海假單胞菌作為菌肥用于作物栽培上。本實(shí)施方式的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3具有ACC脫氨酶活性，產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素IAA，合成嗜鐵素；可在鹽堿脅迫環(huán)境中有效地促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)以及提高植物在逆境條件下抗逆能力。其在作物栽培上的應(yīng)用，能夠增進(jìn)肥效，提高產(chǎn)量。本實(shí)施方式的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea MJM-3可以通過(guò)間接分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對(duì)植物產(chǎn)生不良影響，并通過(guò)產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)。本發(fā)明的地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea)MJM_3 含有的 I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸(l-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脫氨酶的PGPR能水解植物體內(nèi)生物合成乙烯的直接前體ACC，產(chǎn)生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當(dāng)這種菌附著在種子表皮時(shí)，它能水解ACC，降低種子在逆境條件下大量產(chǎn)生的植物生長(zhǎng)抑制劑和植物衰老劑-乙烯濃度，促進(jìn)根的伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)。通過(guò)以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。試驗(yàn)I、菌株篩選本發(fā)明的一株地中海假單胞菌是通過(guò)以下步驟篩選得到的(I)取Ig種植苜蓿的黑龍江地域根際農(nóng)田土，放入50mL的PAF培養(yǎng)基中，在28°C溫度下振蕩培養(yǎng)24h ；(2)取ImL步驟(I)培養(yǎng)后的PAF培養(yǎng)液，放入50mL新的PAF培養(yǎng)基中，在28°C溫度下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24h ；(3)取ImL步驟(2)培養(yǎng)后的PAF培養(yǎng)液，放入50mL DF鹽培養(yǎng)液A中，在28°C溫度下振蕩培養(yǎng)24h ；(4)取ImL步驟(3)培養(yǎng)后的DF鹽培養(yǎng)液，放入50mLADF培養(yǎng)液中，在28°C溫度下振蕩培養(yǎng)48h ；(5)取ImL步驟(4)培養(yǎng)后的的培養(yǎng)液，涂布于ADF瓊脂培養(yǎng)基上，在28°C溫度下振蕩培養(yǎng)72h，取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行純化；(6)對(duì)步驟(5)純化后的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到ADF培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆?；其中，步驟(I)和(2)中所述的PAF培養(yǎng)基為由IOg的蛋白胨、IOg的酪蛋白水解物、I. 5g的MgSO4' I. 5g的K2HPO4和IOmL的甘油組成；步驟(3)中所述的DF鹽培養(yǎng)液為稱取4. Og的KH2PO4,6. Og的Na2HP04、0· 2g的MgSO4 · 7H20、0. Ig 的 FeSO4 · 7H20、2. Og 的葡萄糖、2. Og 的葡萄糖酸、2. Og 的檸檬酸、2. Og的(NH4)2SO4^O. Olmg 的 H3B03、0. 0112mg 的 MnS04、0. 1246mg 的 ZnSO4,0. 0782mg 的 CuSO4 和O. Olmg的MoO3 ;將上述DF鹽培養(yǎng)液成份加入蒸餾水中溶解后，調(diào)整pH值至7. 5，定容至 10OOmT,；步驟(4 )和(6 )中所述的ADF培養(yǎng)液為稱取4. Og的KH2PO4' 6. Og的Na2HPO4'O. 2g 的 MgSO4 · 7H20、0. Ig 的 FeSO4 · 7H20、2. Og 的葡萄糖、2. Og 的葡萄糖酸、2. Og 的檸檬酸、O. Olmg 的 Η3Β03、0· 0112mg 的 MnS04、0. 1246mg 的 ZnSO4,0. 0782mg 的 CuSO4 和 O. Olmg 的MoO3 ;向上述組分中加入蒸餾水溶解后，調(diào)整pH值至7. 5，定容至IOOOmL,高溫滅菌后加入I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸(ACC)，使其終濃度為3. 0mmol/Lo步驟(5)中的ADF瓊脂培養(yǎng)基為向IL的步驟(4)和(6)的ADF培養(yǎng)液加入15g瓊脂。試驗(yàn)2、菌株鑒定對(duì)篩選得到的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3進(jìn)行生理生化鑒定，和分子鑒定。2. I生理生化鑒定本發(fā)明地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3為革蘭氏陰性菌，該菌株在ADF培養(yǎng)基上形成圓形、不透明、淡黃色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落(如圖I所示)。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》對(duì)分離出的菌株MJM-9進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶、甲基紅、乙酰甲基甲醇、淀粉水解、吲哚、檸檬酸鹽作用生理生化實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)和鑒定。結(jié)果表明地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3為革蘭氏陰性菌，表現(xiàn)出接觸酶陽(yáng)性，淀粉水解陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陽(yáng)性，甲基紅、乙酰甲基甲醇、檸檬酸鹽作用實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為陰性。2. 2分子鑒定對(duì)上述試驗(yàn)篩選得到的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3進(jìn)行分子鑒定是按照以下步驟進(jìn)行的對(duì)上述得到的地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea)MJM-3純化菌株采用堿裂解法進(jìn)行ACC脫氨酶的苜蓿根際促生菌株的DNA提取，利用引物F8和R1541，以提取的DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后委托北京Invitrogen生命科技有限公司測(cè)序；其中，PCR擴(kuò)增引物序列如下F8 :5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ，F(xiàn)1541 :5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，
PCR 擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 90s，30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸IOmin。地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea) MJM-3 的 16S rDNA 長(zhǎng)度為 830bp(如序列表Seq ID No :1所示),其序列提交至GenBank,以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3的16S rDNA與突光假單胞菌屬(Pseudomonas mediterranea)的16S rDNA基因序列的保守區(qū)相似性達(dá)99%。綜合生理生化特征和菌落形態(tài)特征，確定地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3屬于突光假單胞菌屬(Pseudomonas mediterranea),已于2012年6月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)為CGMCC NO. 6292。上述PCR引物購(gòu)買自生工生物工程上海有限公司。試驗(yàn)3、地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3的ACC脫氨酶活性測(cè)定
3. I培養(yǎng)基配制TSB培養(yǎng)基為17g的胰蛋白胨、3g的大豆胨、5g的NaCl、2. 5g的葡萄糖、2. 5g的K2HPO4溶解到IOOOmL蒸餾水中，調(diào)整pH值至7. 5 ；ADF 培養(yǎng)基=KH2PO4 4. Og^Na2HPO4 6. 0g、MgS04 ·7Η20 0. 2g、FeS04 · 7Η20 O. lg、2. Og的葡萄糖、2· Og 的葡萄糖酸、2. Og 的朽1 檬酸、0. Olmg 的 H3B03、0. 0112mg 的 MnS04、0. 1246mg的ZnS04、0. 0782mg的CuSO4和0. Olmg的MoO3 ;向上述組分中加入蒸餾水溶解后，調(diào)整pH值至7. 5，定容至IOOOmL,高溫滅菌后加入1_氨基環(huán)丙烷_(kāi)1_羧酸(ACC)，使其終濃度為
3.Ommol /I,；DF 培養(yǎng)基為4. Og 的 KH2PO4,6. Og 的 Na2HP04、0. 2g 的 MgSO4 · 7Η20、0· Ig 的FeSO4 ·7Η20、2· Og 的葡萄糖、2. Og 的葡萄糖酸、2. Og 的朽1 檬酸、0. Olmg 的 H3B03、0. 0112mg 的MnS04、0. 1246mg的ZnSO4,0. 0782mg的CuSO4和0. Olmg的MoO3 ;向上述組分中加入蒸餾水溶解后，調(diào)整pH值至7. 5，定容至1000mL。3. 2酶活測(cè)定酶活測(cè)定的具體步驟如下(I)挑取經(jīng)純培養(yǎng)后的地中海假單胞菌(Pseudomonas meaditerranea) MJM-3單菌落于50mL TSB培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)12h ；(2)將步驟(I)培養(yǎng)后的地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為8000g的條件下離心lOmin，收集菌體，用50mL不含(NH4) 2S04的DF培養(yǎng)基洗滌菌體3次，然后將全部菌體按接種于ADF培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)48h誘導(dǎo)其產(chǎn)生ACC脫氨酶；(3)將步驟(2)培養(yǎng)后的菌液在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為SOOOg的條件下離心lOmin，收集菌體，將菌體細(xì)胞懸浮于ImL濃度為0. lmol/L、pH為7. 6的Tris-HCl溶液中，然后轉(zhuǎn)移至I. 5mL的離心管中，待用；(4)將步驟(3)中的離心管在轉(zhuǎn)速為1600g的條件下離心5min，去上清，收集菌體，將菌體重懸于600 μ L濃度為O. lmol/L、pH為8. 5的Tris-HCl溶液中，再加入30 μ L甲苯，漩渦震蕩30s，得菌液；然后取200 μ L菌液做酶活測(cè)定(剩余菌液做蛋白測(cè)定)；同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照在600 μ L濃度為0. lmol/L、pH為8. 5的Tris-HCl中加入30 μ L甲苯；(5)取步驟(4)得到的200 μ L的菌液，加入20 μ L濃度為O. 5mol/L的ACC溶液震蕩30s后，在溫度為30°C的條件下培養(yǎng)15min，然后加入ImL濃度為O. 56mol/L的HCl溶液混合均勻，在室溫(25°C)離心5min，收集上清液，待用；在室溫震蕩離心5min，收集上清，待用；(6)取ImL步驟(5)收集的上清與800 μ L濃度為O. 56mol/L的HCl溶液混合均勻，再加入300 UL 2,4- 二硝基苯肼混合，得混合溶液；將混合溶液在30°C溫度下培養(yǎng)30min后，向其中加入2mL濃度為2mol/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，然后以ImL濃度為0、0. 1,0. 3、O. 7、I和2 μ mol -Γ1的α - 丁酮酸為標(biāo)準(zhǔn)液，在吸光值為540nm處進(jìn)行酶活測(cè)定，測(cè)得ACC標(biāo)準(zhǔn)曲線，以y=3. 7396x-0. 0385為方程式，進(jìn)行ACC合成量的計(jì)算；(7)蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定；其中，ACC脫氨酶的活性以在測(cè)酶體系中每毫克蛋白每小時(shí)形成α-丁酮酸的量 表示，單位為ymola-KA· (mgPr · h)'酶活性測(cè)定均扣除樣品對(duì)照空白后計(jì)算，重復(fù)3次。結(jié)果顯不地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3具有較高的ACC脫氨酶活性，高達(dá) 29. 78 μ mol a -KA · (mgPr · h)—1。試驗(yàn)4、地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3的IAA合成含量測(cè)定(I)取地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3于DF培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)2d ；(2)取步驟(I)中地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3培養(yǎng)液ΙΟΟμ L分別轉(zhuǎn)入到含有不同濃度(0、50、100、200和500 μ gL-Trp πιΓ1)色氨酸(L-Trp)的DF培養(yǎng)基中，然后在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)2d ；(3)取步驟(2)中地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3培養(yǎng)液進(jìn)行OD6tltl值測(cè)定，然后將其余培養(yǎng)液在室溫、轉(zhuǎn)速為8000rpm的條件下離心lOmin，取500 μ L上清液加入2mL的Salkowsk試劑，室溫培養(yǎng)20min后，在535nm處測(cè)吸光值；同時(shí),用對(duì)不含地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea)MJM_3的DF培養(yǎng)基采用步驟(3)的方法進(jìn)行相同處理作為對(duì)照組；(4)以不同濃度(0. 01,0. 05,0. 25和O. 5mg .mL—1)的IAA溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，以對(duì)照組進(jìn)行調(diào)零，在535nm處測(cè)吸光值，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線，以y=0. 1729χ-0. 0098方程，進(jìn)行ACC合成量的計(jì)算；其中，DF培養(yǎng)基為稱取 4. Og 的 KH2PO4,6. Og 的 Na2HP04、0. 2g 的 MgSO4 ·7Η20、0· Ig的 FeSO4 ·7Η20、2· Og 的葡萄糖、2. Og 的葡萄糖酸、2. Og 的朽1 檬酸、2. Og 的(NH4)2SO4^O. Olmg的 Η3Β03、0· 0112mg 的 MnS04、0. 1246mg 的 ZnSO4,0. 0782mg 的 CuSO4 和 0. Olmg 的 MoO3 ;向上述組分中加入蒸餾水溶解后，調(diào)整pH值至7. 5，定容至1000mL。結(jié)果如圖2所不，由圖2可知，地中海假單胞菌(Pseudomonds mediterranea)MJM-3能產(chǎn)生吲哚乙酸，且合成吲哚乙酸量隨著L-Trp濃度的增加而增加，具體在濃度為 0、50、100、200、500μ g L-Trp · ml/1 中的吲哚乙酸量分別為 0. 55,7. 49,12. 07,26. 65、36. 24 μ g(mL · OD600)、
試驗(yàn)5、地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3菌株的嗜鐵素合成含量測(cè)定5. I嗜鐵素合成含量定性檢測(cè)參照Schwyn和Neilands的方法，將地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3 接于絡(luò)奧醇 CAS (chrome azurol S)平板培養(yǎng)基上，在溫度28°C的條件下培養(yǎng)48 72h，觀察菌落周圍的顏色變化，有橘黃色圈產(chǎn)生，則證明有嗜鐵素產(chǎn)生；其中，鉻奧醇CAS平板培養(yǎng)基制備方法如下CAS藍(lán)色染液溶液A :將0. 06g的CAS溶于50mL去離子水中，再加入IOmL濃度為Immol · L—1的FeCl3 溶液(含 IOmmol · Γ1 的 HCl)；溶液B :將O. 073g的十六燒基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide, HDTMA)溶于40mT,去離子水中；將溶液A沿著燒杯壁緩緩加入到溶液B中，輕輕晃動(dòng)混勻溶液A和溶液B，得到CAS藍(lán)色染液，備用；溶液a :將15g的KH2P04、25g的NaCl和50g的NH4Cl溶于500mL去離子水；溶液b :質(zhì)量百分含量為20%的葡萄糖溶液將20g葡萄糖溶于IOOmL去離子水；溶液c :將25g的NaOH溶于150mL去離子水；酸性酪蛋白水解物溶液將3g酸性酪蛋白水解物溶于27mL去離子水，然后采用
0.22 um的濾膜過(guò)濾滅菌；鉻奧醇CAS平板培養(yǎng)基的配制如下量取IOOmL溶液a與750mL去離子水混合，向其中加入32. 24g的PIPES (哌嗪-1，4- 二乙磺酸)；加入細(xì)菌培養(yǎng)專用瓊脂(購(gòu)買自百特生物公司)15g，然后在120°C溫度下，滅菌15min ;待溶液冷卻至50°C加入30mL酸性酪蛋白水解物溶液，IOmL的溶液b，再緩慢加入IOOmL的CAS藍(lán)色染液，充分混勻，倒平板，即得CAS平板培養(yǎng)基；其中，在加入PIPES (哌嗪-1，4- 二乙磺酸)時(shí)，由于PIPES (哌嗪-1，4- 二乙磺酸)在PH小于5以下不溶，應(yīng)調(diào)節(jié)溶液酸堿度在緩慢加入PIPES，并不斷攪拌，最終用溶液c將溶液調(diào)到pH=6. 8。5. 2嗜鐵素合成含量定量分析將上述“嗜鐵素合成含量定性檢測(cè)”中可產(chǎn)生橘黃色圈的單菌落接種于MKB培養(yǎng)基中，然后放入搖床中，在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為180r ^mirT1的條件下培養(yǎng)48h，然后將培養(yǎng)后的菌液在溫度為28°C、轉(zhuǎn)速為IOOOrpm的條件下離心lOmin，取上清液，以1:1的體積比向上清液中加入CAS檢測(cè)液，充分混勻，靜止Ih后，在630nm處測(cè)吸光值(A)，以去離子水與CAS檢測(cè)液等體積混合后，在630nm處測(cè)吸光值(Ar)為對(duì)照，A/Ar代表樣品中嗜鐵素的相對(duì)含量；該值越低，表明嗜鐵素含量越高；其中，MKB培養(yǎng)基為稱取5g的酸解酪蛋白，15mL的甘油，2. 5g的K2HPO4, 2. 5g的MgSO4 ·7Η20 ;將上述組分加入到蒸餾水中溶解，調(diào)節(jié)pH至7. 2，定容至IOOOmL,然后在121 °C溫度下，滅菌20min ；CAS檢測(cè)液的制備如下I、將 0. 182g CTAB 溶于 50mL 去離子水；2、將 0. 0054g FeCl · 6H20 溶于 2mL 濃度為 IOmM 的 HCl 水溶液；3、將0. 0605g鉻天青S溶于50mL去離子水；
4、將I. 5mL步驟2得到的溶液與7. 5mL步驟3得到的溶液混合，再與6mL步驟I得到的溶液混合，得到混合液；5、將 4. 307g 的 PIPES 用 2(T30mL 去離子水溶解，加入 6. 25mL 濃 HC1，調(diào) pH 為 5. 6 ;6、將全部步驟4得到的溶液和全部步驟5得到的溶液混合，并用去離子水定容至溶IOOmL,即得CAS檢測(cè)液。結(jié)果如圖3所示，菌落周圍有橘黃色圈產(chǎn)生，證明假單胞菌(Pseudomona sp.)MJM-9能夠合成嗜鐵素。樣品中嗜鐵素的相對(duì)含量A/Ar為I. 15，表明地中海假單胞菌(Pseudomonasmediterranea) MJM-3具有一定的合成嗜鐵素的能力。試驗(yàn)6、地中海假單胞菌(Pseudomonas mediterranea) MJM-3盆栽苜猜促生試驗(yàn) 6. I 土樣采集本發(fā)明所用土樣均取自黑龍江省大慶市采油廠附近鹽堿土。采集樣品時(shí)在每個(gè)區(qū)域內(nèi)設(shè)置5個(gè)樣方，每個(gè)樣方面積為I X Im2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后,裝入事先準(zhǔn)備好的干凈保鮮袋中，迅速將土樣帶回試驗(yàn)室，土壤經(jīng)碾碎，混勻，風(fēng)干后過(guò)篩保存。供試土壤的理化性質(zhì)見(jiàn)表I。表I供試土壤理化性質(zhì)
權(quán)利要求
1.一株地中海假單胞菌，其特征在于它為地中海假單胞菌(Pseudomonasmeditrranea) MJM-3,保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年6月26日，保藏號(hào)為CGMCCNO. 6292。
2.如權(quán)利要求I所述的一株地中海假單胞菌的應(yīng)用，其特征在于地中海假單胞菌作為菌肥用于作物栽培上。
全文摘要
一株地中海假單胞菌及其應(yīng)用，它涉及一株地中海假單胞菌及其應(yīng)用。它為一株地中海假單胞菌(Pseudomonds mediterranea)MJM-3，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年6月26日，保藏號(hào)為CGMCC NO.6292。一株地中海假單胞菌作為菌肥用于作物栽培上。用于作物栽培上。該菌株具有ACC脫氨酶活性，同時(shí)還能分泌植物生長(zhǎng)素IAA及嗜鐵素。因此能降低逆境條件下植物體內(nèi)乙烯濃度，促進(jìn)植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)植物鐵吸收，改善植物生長(zhǎng)狀況。該菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物的產(chǎn)量，增強(qiáng)抗逆能力。
文檔編號(hào)C12R1/38GK102827794SQ20121031237
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者郭長(zhǎng)虹, 馬嘉敏, 劉佳莉, 蔡洪生, 管鵬 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)