專利名稱：微小rna用于調(diào)控cd86的基因表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及基因表達調(diào)控技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種微小RNA用于調(diào)控⑶86基因表達。
背景技術(shù)：
腫瘤一直嚴重威脅著人類的健康和生命，傳統(tǒng)的治療方法不盡如人意。免疫治療通過提高腫瘤的免疫原性，誘導機體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫反應，達到治療腫瘤的目的，是一種變被動為主動的生物治療方法。由T細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤免疫的主要形式，機體通過對腫瘤抗原的特異性識別，激活T細胞，產(chǎn)生相應的免疫殺傷作用。細胞的有效活化不僅需要T細胞與抗原肽-MHC復合物的特異性結(jié)合提供第I信號，還需要抗原提呈細胞(APC)表面的共刺激分子與其受體結(jié)合提供第2信號。最基本的 共刺激信號是由抗原遞呈細胞表達的⑶80 (B7-1)、⑶86 (B7-2)分子與T細胞上表達的相應受體提供。CD86只有與靜止型T細胞表面的CD28分子結(jié)合后，才能使T細胞活化，刺激T細胞的增殖和分化，誘導CTL反應，在機體抗腫瘤中起著關(guān)鍵作用(David MS, ClaireNM, Zheng Y. What’s the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology,2003，24 (6) :313-318)。如果缺乏這種共刺激信號，T細胞將失能，導致免疫無應答，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。分子以單體形式表達于APC表面。未受抗原刺激的APC中幾乎不表達⑶86分子，但經(jīng)活化后其表達顯著上調(diào)。激活的B細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和T細胞上均表達高水平⑶86。⑶86還可在靜止的單核細胞和B細胞上呈低水平表達。B細胞在激活后24 h內(nèi)，CD86分子表達至高峰，說明CD86可能在T細胞共刺激早期起關(guān)鍵作用，決定T細胞是激活還是無反應。樹突狀細胞是目前已知的機體內(nèi)功能最強的抗原提呈細胞，具有獨特的免疫學功能，能在體內(nèi)外直接激活靜息期T細胞，促進T輔助細胞和細胞毒性T細胞(CTL)的生成，在誘導抗腫瘤反應中起關(guān)鍵的調(diào)控作用(Jacques B, Ralph MS. Dendriticcells and the control of immunity. Nature, 1998, 392 (6673) : 245-252)。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及區(qū)域淋巴結(jié)內(nèi)樹突細胞上CD86的表達低于正常組織、癌周組織及炎性組織，正是由于腫瘤組織內(nèi)CD86的表達下降，使樹突細胞不能有效的誘導抗腫瘤免疫。因此，調(diào)控樹突細胞上CD86表達將成為一種新的抗腫瘤治療途徑，具有潛在應用價值(Le TT, Gardner J, Hoang-Le D. Immunostimulatory cancer chemotherapyusing local ingenoI-3-angelate and synergy with immunotherapies. Vaccine2009，27(23):3053-62)。是近年來發(fā)現(xiàn)于真核細胞中的一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3’ -UTR互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結(jié)合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究證實，miRNA在腫瘤組織中表達異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者治療反應密切相關(guān)；如hsa-miR-21在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，與結(jié)直腸癌 M分期及患者預后密切相關(guān)(SchetterAJj Leung SYj Sohn JJj et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008， 299(4):425-36)。這種在腫瘤組織中表達異常的miRNA有的已被證實具有顯著的抗腫瘤活性[Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. Cancer J2012，18(3) :275-84.，如miR-145和miR_33a能抑制HCT-116結(jié)直腸癌細胞移植瘤的生長Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR_33a isefficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224.。另夕卜，miR-122由于能調(diào)控丙型肝炎病毒RNA的豐度，其互補序列用于治療丙型肝炎病毒感染患者已經(jīng)進入 II 期臨床試驗Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S，et al. A randomized,double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of conceptstudy of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatmentnaBve patients with genotype I (gtl) chronic HCV infection. Hepatology.2011:1430A.，顯示出miRNA作為一種極其重要的基因表達調(diào)控因子和作用靶標，具有潛在的治療作用和實際應用價值。 雖然本領(lǐng)域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關(guān)性，但本領(lǐng)域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)且可作為發(fā)病、治療方案的選擇及預后的特定miRNA存在較大難度。目前，本領(lǐng)域中尚無miR-181b和⑶86基因相關(guān)性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種微小RNA用于調(diào)控CD86基因表達。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的一種微小RNA用于調(diào)控⑶86的基因表達，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5，-AACAUUCAUUGC腳CG⑶GG⑶-3'優(yōu)選地，所述微小RNA能與CD86基因3’ -UTR結(jié)合，抑制CD86基因表達。優(yōu)選地，所述微小RNA為miR_181b。優(yōu)選地，所述微小RNA通過化學合成得到。優(yōu)選地，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。本發(fā)明微小RNA的獲取來源可以是來自化學合成和存在該基因序列的細胞、組織，組織可以選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。在本文中，術(shù)語“樣本”指的是潛在可能含有微小miR_181b的離體循環(huán)血樣品，優(yōu)選是來自人的樣品。盡管用抽提出血總RNA的純化樣品也能夠在本發(fā)明中使用，但是，本發(fā)明的樣品優(yōu)選是未經(jīng)提純的、含有血總RNA的裂解液體樣品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉將固體的有核血細胞裂解或抽提、純化并保持其中miRNA成分不被降解的細胞分子生物學技術(shù)。本發(fā)明的樣品可以是經(jīng)過處理的樣品，如稀釋處理、血細胞裂解處理以及PCR擴增等，也可以是未經(jīng)處理的樣品。經(jīng)過處理的樣品可以進一步純化，以富集miRNA。在本文中，術(shù)語“miR-181b”指的是指的是包含序列“AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG⑶”或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來源的miR-181b，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語“miR-181b”中。本發(fā)明的術(shù)語中還包含上述天然存在的miR-181b序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經(jīng)過生物化學修飾，且仍然具有生物學活性的衍生RNA。本發(fā)明人采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定了 6例結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中miRNA的表達；統(tǒng)計分析結(jié)果證實，hsa-miR-181b在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織，結(jié)果如圖I所示。本發(fā)明人采用生物信息學軟件miRanda預測發(fā)現(xiàn),hsa_miR-181b可能與CD86基因3’-UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所示。隨后，本發(fā)明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-181b可與CD86基因3’ -UTR結(jié)合，從而抑制CD86分子表達，可通過調(diào)控CD86信號通路和/或miR-181b表達及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述
圖I結(jié)直腸癌組織中和正常組織中miR-181b表達量測定結(jié)果；
圖2 miRanda軟件預測結(jié)果；
圖3 CD86基因3’ -UTR的PCR擴增結(jié)果；
圖4 CD86/3’ -UTR/pGEM-T重組載體酶切驗證結(jié)果；圖5 CD86/3’ -UTR/pGEM-T重組載體測序驗證結(jié)果；
圖6 CD86/3’ -UTR/ pGL-3重組載體酶切驗證結(jié)果；
圖7 CD86/3’ -UTR/ pGL-3重組載體測序驗證結(jié)果；
圖8 hsa-miR-181b對CD86/3’ -UTR/pGL-3重組載體表達活性的抑制作用。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。一、試劑與材料 I、試劑
胎牛血清(Hyclone，美國)；完全培養(yǎng)基每升RPMI1640 (Hyclone，美國)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巰基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂質(zhì)體2000(Invitrogen,美國);青霉素、鏈霉素(上海生工生物技術(shù)有限公司);TRIzol (Invitrogen,美國);瓊脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英國);凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EtBr)(上海生工生物技術(shù)有限公司);膠回收DNA試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒(Axygen,美國);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、鹽酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)和無水乙醇等實驗所用試劑均為分析純或優(yōu)級純；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega,美國)。hsa_miR-181b及其實時突光定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Taq DNA聚合酶、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、油al限制性內(nèi)切酶(MBI，美國);T4 DNA連接酶(Takara，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 級)。pGEM-T> pGL-3> pRL-TK 載體(Promega,美國)。2、組織樣本
收集6例結(jié)直腸癌患者的新鮮手術(shù)組織樣本，包括癌組織和遠端正常腸組織(離癌邊沿5cm)。所有患者經(jīng)HE染色、病理診斷確認為結(jié)直腸癌；術(shù)前未接受化療或放療。3、細胞株
中國倉鼠卵巢細胞株CHO (ATCC，美國);大腸桿菌TPlO (Novagen，美國)。細胞株經(jīng)檢測，無支原體污染。4、儀器
CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機、常速離心機(Thermo,德國)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；微弱發(fā)光測量儀(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR儀(S1000，Bio-Rad，美國)；電泳儀(Bio-Rad,美國)；微量定量分光光度計(Alpha Innotech,美國)；凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius, SYNGENE,英國)。二、實驗方法 I、細胞培養(yǎng)
采用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L鏈霉素，培養(yǎng)條件為37° C、5% CO2、飽和濕度。CHO細胞株貼壁生長，傳代時用0. 25%胰酶消化。間隔2-3天更換新鮮培養(yǎng)基。2、實時熒光定量分析hsa-miR_181b表達量
采用Trizol試劑按照使用說明書從6對結(jié)直腸癌和正常組織樣本中提取總RNA。實時熒光定量PCR試劑盒測定RNA樣本中hsa-miR-181b的表達量；以U6 RNA為內(nèi)對照。取5μΜ RT引物工作液 μ ，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反應體系，加入2μ RNA樣品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上體系混勻后，瞬時離心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下試劑進行RT反應1XRT buffer,Iμ dNTP(10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反應程序42° C 60min，70° C IOmin0 RT反應結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，后續(xù)所有步驟都在冰上進行。接著進行qRT-PCR反應定量測定hsa-miR_181b表達量，20μ 反應體系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反應產(chǎn)物，Bulge-Loop miR_181b正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反應程序95° C預變性20sec ;接著進行40 個循環(huán)(95。C 變性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。3、miRNA作用靶位點的預測
采用生物信息學軟件miRanda (www. microRNA. org)預測可能與⑶86基因3’ -UTR結(jié)合的miRNA。4、構(gòu)建含⑶86基因3’ -UTR片段的熒光素酶表達載體
采用Trizol試劑按照使用說明書從MDA-MB-435細胞中提取總RNA，以Oligo (dT)為逆轉(zhuǎn)錄引物，用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。μ L PCR反應體系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X緩沖液，O. 2mmol/L (1見1^，0.4_01/1正向引物5’-66〇 TAG TCT AGA TAA GGA GTT CTC ATC CCT CTG-3’和反向引物5’-GGC TAG TCT AGA AAG CTT GTC TAG CAT GGC AG-3’(下劃線堿基為內(nèi)切酶Xbal識別序列)。熱循環(huán)條件為94° C預變性5min ;然后以94° C變性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸I. 5min，擴增35個循環(huán)；最后72° C延伸7min使反應完全。反應完成后，取反應產(chǎn)物3PL在I. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I X TAE電泳緩沖液，電壓200V，恒壓電泳5min)，凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜。擴增成功的產(chǎn)物采用Sanger’ s測序法測定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反應產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓100V，恒壓電泳lOmin)，然后采用膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度計測定其濃度。參考產(chǎn)品說明書，將純化的⑶86基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T載體；熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌TPlO感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選。挑取白斑搖菌，抽提質(zhì)粒；PCR擴增及酶切鑒定后再進行測序驗證。將測序正確的重組子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的大腸桿菌TPlO感受態(tài)細胞，進行大量擴增；試劑盒抽提法大量制備PGL-3和pRL-TK質(zhì)粒，電泳檢測質(zhì)粒的純度和含量。用限制性內(nèi)切酶對提取的PGL-3質(zhì)粒進行酶切，試劑盒直接回收大片段的酶切產(chǎn)物。參考產(chǎn)品說明書，將酶切回收純化后的⑶86基因3’-UTR片段按適當比例與pGL-3載體的油al酶切片段進行連接反應，16° C酶連過夜。取10 μ L連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化100 μ L大腸桿菌 TPlO感受態(tài)細胞。經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化子的平板上隨機挑取10個菌落，經(jīng)過含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)；經(jīng)PCR擴增、酶切和測序鑒定后，用試劑盒抽提質(zhì)粒備用。5、細胞轉(zhuǎn)染
首先，將培養(yǎng)于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中細胞株，按I X IO4個細胞/孔的量在24孔板中接種指數(shù)生長期的細胞，培養(yǎng)過夜，直到細胞80%匯片。然后，將一定量的hsa-miR_181b、CD86/3 ' _UTR/pGL3重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK稀釋至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基中，用移液槍混合均勻；然后將I μ L脂質(zhì)體2000懸液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基中，在室溫孵育5min ;最后將兩者混合在一起，充分混勻，靜置20min，使hsa-miR-181b、重組質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合。將只加脂質(zhì)體的孔作為陰性對照。最后，吸去接種到24孔板中的培養(yǎng)液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養(yǎng)基洗一次，在每個孔中加入100 μ L上述混合物，培養(yǎng)3h ;吸棄培養(yǎng)板中的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，向各孔加入100 μ L有血清無抗生素的Opti-MEMsI培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行檢測。6、雙熒光素酶報告系統(tǒng)基因活性測定
將轉(zhuǎn)染有PGL-3和pRL-TK的CHO細胞經(jīng)過24h培養(yǎng)后收集，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室溫搖動15 min0按照雙熒光素酶檢測試劑盒的操作說明書，取100 μ L突光素酶分析緩沖液II于I. 5ml離心管中，設定化學發(fā)光儀延遲2sec,發(fā)光儀測讀IOsec ;將全部細胞裂解液加入到離心管中，用移液槍輕輕抽吸2-3次混勻(不要旋渦振動)；將離心管放入化學發(fā)光儀中測讀螢火蟲熒光素酶發(fā)光值Fl ;將離心管移出發(fā)光儀，力口AlOOuL Stop&Glo試劑，快速旋渦混勻后，將離心管重放回發(fā)光儀中測讀海腎熒光素酶發(fā)光值F2。應用SPSS. 10統(tǒng)計軟件的卡方檢驗分析受試組與空白對照組的F1/F2比值差異，以判斷hsa-miR_181b的調(diào)控作用。三、結(jié)果
I.hsa-miR-181b在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織采用實時熒光定量PCR技術(shù)測定了 6例結(jié)直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達；統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-181b在結(jié)直腸癌組織中的表達顯著高于正常組織，結(jié)果如圖I所示。
與CD86 基因 3’ -UTR 結(jié)合
我們采用生物信息學軟件miRanda預測發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-181b可能與CD86基因3’ -UTR結(jié)合，結(jié)果如圖2所示。構(gòu)建CD86/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達載體
PCR擴增得到長度為949bp的⑶86基因3’_UTR序列(圖3)，切膠純化回收后，將片段插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。隨機挑克隆擴增后提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)過油a I酶切鑒定，證實酶切后得到的基因片段與預期大小937bp相符(圖4)。測序結(jié)果表明，插入pGEM-T載體的⑶86基因3’ -UTR片段序列正確，如圖5所示。抽提pGEM-T載體，酶切獲得⑶86基因3’ -UTR片段；將其插入pGL-3載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。酶切后得到的基因片段與預期大小937bp相符(圖6);測序結(jié)果證實插入序列正確(圖7)。2、hsa-miR_181b抑制重組熒光素酶表達活性
將200ng重組CD86/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達載體、20ng內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK與IOpmolhsa-miR-181b共同轉(zhuǎn)染CHO細胞后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測轉(zhuǎn)染培養(yǎng)后CHO細胞中熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，在CHO細胞中加入hsa-miR-181b后，熒光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)顯著低于不加hsa_miR-181b的細胞(圖8)。由此表明，hsa_miR-181b通過與⑶86基因3’ -UTR上靶序列結(jié)合，抑制了熒光素酶的表達。上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.微小RNA用于調(diào)控CD86的基因表達，所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ -AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能與CD86基因3’-UTR結(jié)合，抑制⑶86基因表達。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA為miR-181b。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通過化學合成得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微小RNA用于調(diào)控CD86的基因表達，所述微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體:5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3’，所述微小RNA能與CD86基因3’-UTR結(jié)合，抑制CD86基因表達。本發(fā)明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-181b可與CD86基因3’-UTR結(jié)合，從而抑制CD86分子表達，可通過調(diào)控CD86信號通路和/或miR-181b表達及功能以發(fā)揮抗腫瘤作用。
文檔編號C12N15/113GK102776196SQ20121025365
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日
發(fā)明者張學光, 朱健潔, 汪維鵬 申請人:蘇州大學