專利名稱：一種植物促生菌及其菌劑與其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物促生菌劑，具體地說是一種植物促生菌及其菌劑、及其制備 方法和應(yīng)用，屬于生物肥料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氮和磷作為植物必需的礦質(zhì)元素，是植物活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、磷脂、酶、植物激 素等多種結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)的重要組成成分，在植物能量代謝、有機(jī)物合成與代謝、物質(zhì)運(yùn) 轉(zhuǎn)、基因表達(dá)與調(diào)控及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中起重要作用。氮素和磷素的缺乏、將使植物的 生長發(fā)育受抑，引起作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。長期大量施用化肥不但提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本， 而且造成了土壤中某些元素的選擇性積累和土壤理化性質(zhì)的惡化，對(duì)環(huán)境造成污染。因此 以微生物肥料替代或部分替代化肥是維持農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。存在于植物根際的土 壤細(xì)菌可以通過根際固氮、產(chǎn)生生長素、溶解土壤中大量存的難溶性磷供植物吸收來促進(jìn) 作物的生長，達(dá)到促生促產(chǎn)的目的。
由于同時(shí)具有多種高效促生作用的菌種較難獲得、因此目前投入生產(chǎn)的溶磷固氮 植物促生菌劑多為多菌種混合菌劑，存在菌種間拮抗，菌劑內(nèi)營養(yǎng)需求和代謝不平衡等問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種以集溶磷、固氮和產(chǎn)生長素 多種促生能力為一體的固氮溶磷菌，制備成固氮溶磷菌劑，具有促生性能全面，肥效高、造 價(jià)低廉的特點(diǎn)，適用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的區(qū)域，有良好的發(fā)展前景。
本發(fā)明的技術(shù)方案為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其微生物保藏 單位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院，保藏日期2010年8月31日，保藏號(hào)為=CGMCC No. 4128 ；所述肺炎克雷伯氏菌 的形態(tài)學(xué)特征為直桿菌，直徑0. 5 0. 8 μ m，長3. 2 5. 0 μ m，單個(gè)分布、有莢膜，革蘭氏 染色陰性，不運(yùn)動(dòng)、生長在YMA培養(yǎng)基上產(chǎn)生圓形半透明菌落并分泌大量多糖，有固氮、溶 解無機(jī)磷的作用，可以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇為唯一碳源。
肺炎克雷伯氏菌(Z/e/wieWa / ^腫，微生物保藏號(hào)為CGMCC No. 4128， 在作為植物促生菌劑中的應(yīng)用。
—種植物促生菌劑的制備方法，于按照下列步驟進(jìn)行(1)肺炎克雷伯氏菌{Klebsiellapneumoniae) RSN19接種于YMA固體培養(yǎng)基中，在 26°C 28°C 活化 18 24h ；(2)活化后的ZZd1SiWhpneumoniae RSN19接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，溫 度為25。C ，培養(yǎng)至每毫升發(fā)酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌數(shù)為4 6 10ι。個(gè).(3)將上述步驟(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的發(fā)酵菌液、無菌液體培養(yǎng)基和濃度為10%的pH 7.0無菌磷酸緩沖液按照體積比為4 8 2 4 1的比例混合；以 無菌鋁箔袋或無菌聚丙烯袋封裝，制成單菌種液體菌劑；
(4)將述步驟(3)中制備的液體菌劑與無菌泥炭粉按照體積比為1 4 8的比例混 合，制成固體微生物菌劑。所述促生菌劑的液體培養(yǎng)基組成為，按照重量分?jǐn)?shù)比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2 份的酵母粉，5 10份的葡萄糖，0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000 份的水組成，其中液體培養(yǎng)基的PH值為6. 4 7. 4。所述步驟(3)中發(fā)酵菌液、無菌液體培養(yǎng)基和無菌磷酸緩沖液按照體積比為 6:3:1的比例混合。所述步驟(4)中液體菌劑與無菌泥炭粉體積比為1 6。跟據(jù)上述制備方法制備而成的一種植物促生菌劑，在固氮溶磷中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了一種以集溶磷、固氮和產(chǎn)生長素多種促生能力為一體 的固氮溶磷菌，制備成固氮溶磷菌劑，具有促生性能全面，肥效高、造價(jià)低廉的特點(diǎn)，適用于 氮磷缺乏，土壤瘠薄的區(qū)域，制備工藝簡便，固氮溶磷肥效高，有良好的發(fā)展前景。本發(fā)明菌劑為具備固氮、溶無機(jī)磷和產(chǎn)生長素能力的單菌種植物促生菌劑，能夠 充分利用土壤中含量最為豐富的難溶性無機(jī)磷酸鹽，在具備多種促生能力的同時(shí)解決了多 菌種菌劑中存在的菌種間拮抗和營養(yǎng)需求不一致的問題；菌種單一，制備工藝簡便，對(duì)生產(chǎn) 和封裝設(shè)備的要求較低；對(duì)苜蓿、燕麥、紅豆草幼苗的促生作用顯著，較同等肥效的多菌種 菌劑產(chǎn)品造價(jià)低廉，易于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的分離、鑒定和純化RSN19菌株以無氮 固體培養(yǎng)基和PKO溶無機(jī)磷培養(yǎng)基自表面滅菌的紅豆草、Onbrychis viciaefoliacv.)根 瘤中分離，純化后的菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定符合腸桿菌科的一般定義。菌株純培養(yǎng)物于2010 年經(jīng)中國科學(xué)院微生物鑒定保藏中心鑒定為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) (2010微檢字第084號(hào))；該菌株對(duì)80mg/L卡那霉素和200mg/L氨芐青霉素有耐受性。 RSN19菌株固氮酶活性達(dá)6695 士 174 nmol C2H2 d_l，4d的溶磷量(磷酸鈣)為15. 29 士 0.46!^/1，6(1的生長素產(chǎn)量為8.38 mg/L。在無氮，僅提供磷酸鈣條件下的沙培試驗(yàn)中， 施用RSW9菌液60d后的苜蓿幼苗比不施菌液的空白對(duì)照植株生物量增加119%，株高增加 53%，葉片數(shù)增加95%，用于浸種，能顯著加快胚根的伸長。在氮磷缺乏的條件下對(duì)植物有很 明顯的促生作用。實(shí)施例2
一種植物促生菌劑的制備方法，于按照下列步驟進(jìn)行
(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) RSN19接種于YMA (酵母甘露醇-瓊 脂)固體培養(yǎng)基中，在26°C 28°C活化18 24h ；
(2)活化后的Z/i^sidhpneumoniae RSN19接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，溫度為25°C 29°C，培養(yǎng)至每毫升發(fā)酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌數(shù)為4 6 10ι。個(gè).
(3)將上述步驟(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的發(fā)酵菌液、無菌液體培養(yǎng)基 和濃度為10%的pH 7.0無菌磷酸緩沖液按照體積比為6 3 1的比例混合；以無菌鋁箔 袋或無菌聚丙烯袋封裝，制成單菌種液體菌劑；
(4)將述步驟(3)中制備的液體菌劑與無菌泥炭粉按照體積比為1 6的比例混合，制 成固體微生物菌劑。所述促生菌劑的液體培養(yǎng)基組成為，按照重量分?jǐn)?shù)比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2 份的酵母粉，5 10份的葡萄糖，0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000 份的水組成，其中液體培養(yǎng)基的PH值為6. 4 7. 4。實(shí)施例3
本發(fā)明菌劑在控制氮、磷營養(yǎng)條件下的沙培促生作用 一、實(shí)驗(yàn)材料 1. 1試驗(yàn)材料
本發(fā)明的液體菌劑肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella /^mM^iae)，其微生物保藏號(hào)為 CGMCC No. 4128。1.2植物材料
紫花苜猜隴東(Medicogosativa. cv. LongDong)禾口皇后(Medicogo. sativa. cv. Queen)的種子，甘肅紅豆草(Qnobrychisspp. cv. Gansu)禾口燕麥(Calibre) (Avena. sativa L. Calibre)種子由草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，種子凈度98%，種子以 70%乙醇溶液消毒5min。為消除種帶根瘤菌和固氮菌對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，種子經(jīng)無菌水浸 泡催芽，去除種皮，最后經(jīng)無菌去離子水沖洗5 8遍后播種。1. 3沙培營養(yǎng)液
Hoagland's 完全營養(yǎng)液大量元素Ca(N03) 2 · 4H20 1417mg/L ； KN03 607mg/L ； MgS04 493mg/L ； (NH4) 3P04 115mg/L ；微量元素H3B03 2. 86mg/L ；MnCl2 ·4Η20 1. 81mg/L ； ZnS04 · 7H20 0. 22mg/L ；CuS04 · 5H20 0. 08mg/L ；H2Mo04 · H20 0. 02mg/L ；FeS04 50mg/L。 營養(yǎng)液以無菌去離子水稀釋至1/4濃度后用NaOH (lmol/L)或HCl (lmol/L)調(diào)節(jié)pH值為 7. 0 士 0. 2。Hoagland's無氮無磷營養(yǎng)液以Hoagland’ s完全營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，將配方中的KN03 607mg/L改為KCl 582mg/L，并去除(NH4) 3P04后配制，并調(diào)節(jié)溶液pH值至7. 0 士 0.1。二、實(shí)驗(yàn)方法 2.1.試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)于2010年4月于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，栽培基質(zhì)使用清潔河砂， 經(jīng)HCl浸泡48h后，沖洗6次，最后以蒸餾水沖洗3次，150°C烘干并干熱滅菌6h備用。在 直徑7cm、容積400ml的塑料培養(yǎng)杯中裝入280g干燥河沙，將沙面整平，用鑷子挑選10粒 大小一致的飽滿種子均勻擺放于細(xì)沙表面，覆沙20g。對(duì)各處理幼苗澆灌以無菌水稀釋100 倍的本產(chǎn)品液體菌劑(活菌數(shù)>106cfu/ml)，在栽培用的砂基質(zhì)中添加20g/kg的磷酸鈣， 以l/ffloagland’ s無氮無磷營養(yǎng)液澆灌。對(duì)不接菌液處理，僅以l/ffloagland’ s無氮無磷 營養(yǎng)液澆灌的處理作為空白對(duì)照(CKl)；以l/4H0agland’S完全營養(yǎng)液澆灌的處理作為充足營養(yǎng)對(duì)照(CK2)。每處理4次重復(fù)。處理過程中以稱量法測定各盆栽水分含量，并以無菌 水補(bǔ)充水分至沙基質(zhì)最大持水量的70%。處理50d后進(jìn)行生長和形態(tài)指標(biāo)的測定。
肥效試驗(yàn)的測定指標(biāo)和方法活苗率將各處理盆栽洗出苗后統(tǒng)計(jì)活苗數(shù)，計(jì)算活苗率。
株高和主根長各處理盆栽中隨機(jī)選取4株幼苗測定株高和主根長度。將洗凈植 株平鋪于在玻璃平板上，用直尺測出苗的自然高度，后再用鑷子將植株根系拉直，測定主根 長度。
單葉面積和單株葉片數(shù)取單株記錄葉片數(shù)目，單葉面積采用描形稱重法。
植株單株體積與單株根體積將所選苗置于濾紙上，將水吸干，采用量筒排水法測 定植株體積和根體積。
植株生物量積累取整植株于烘箱中，80°C烘至恒重，用電子天平稱出植株單株干重。
2. 2數(shù)據(jù)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16. 0軟件以LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
三.試驗(yàn)結(jié)果3. 1本發(fā)明菌劑對(duì)低有效磷條件下幼苗存活率的影響處理50d后，施用本發(fā)明菌劑可顯著提高供試作物的幼苗存活率。隴東和皇后苜蓿幼 苗存活率比CKl分別提高3 和28%，比CK2分別提高8%和12%，使紅豆草和燕麥的幼苗存 活率比CKl分別提高27% 44%表1本發(fā)明菌劑對(duì)苜蓿、燕麥和紅豆草幼苗存活率的影響(%)
權(quán)利要求
1.肺炎克雷伯氏菌(Z/e/wieWa/wewMwiae)，其微生物保藏號(hào)為CGMCC No. 4128 ； 所述肺炎克雷伯氏菌的形態(tài)學(xué)特征為直桿菌，直徑0. 5 0. 8 μ m，長3. 2 5. 0 μ m，單 個(gè)分布、有莢膜，革蘭氏染色陰性，不運(yùn)動(dòng)、生長在YMA培養(yǎng)基上產(chǎn)生圓形半透明菌落并分 泌大量多糖，有固氮、溶解無機(jī)磷的作用，可以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇為唯一碳 源。
2.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella/wewso/jiae)，微生物保藏號(hào)為CGMCC No. 4128，在 作為植物促生菌劑中的應(yīng)用。
3.一種植物促生菌劑的制備方法，其特征在于按照下列步驟進(jìn)行(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) RSN19接種培養(yǎng)基中，在 活化18 Mh ；(2)活化后的ZZd1SiWhpneumoniae RSN19接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，溫 度為25。C ，培養(yǎng)至每毫升發(fā)酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌數(shù)為4 6 10ι。個(gè).(3)將上述步驟(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的發(fā)酵菌液、無菌液體培養(yǎng)基 和無菌磷酸緩沖液按照體積比為4 8 2 4 1的比例混合，封裝，制成單菌種液體菌 劑；(4)將述步驟(3)中制備的液體菌劑與無菌泥炭粉按照體積比為1 4 8的比例混 合，制成固體微生物菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物促生菌劑，其特征在于所述促生菌劑的液體培養(yǎng)基 組成為，按照重量分?jǐn)?shù)比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2份的酵母粉，5 10份的葡萄糖， 0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000份的水組成，其中液體培養(yǎng)基的 PH值為6. 4 7. 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物促生菌劑，其特征在于所述步驟(3)中發(fā)酵菌液、無 菌液體培養(yǎng)基和無菌磷酸緩沖液按照體積比為631的比例混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物促生菌劑，其特征在于所述步驟(4)中液體菌劑與 無菌泥炭粉體積比為1 6。
7.根據(jù)權(quán)利要求3制備而成的一種植物促生菌劑，在固氮溶磷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物促生菌及其菌劑與其制備方法和應(yīng)用，即肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)及以其作為活性成分的菌劑，該菌劑的制備方法，以及在溶磷、固氮方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了一種以集溶磷、固氮和產(chǎn)生長素多種促生能力為一體的固氮溶磷菌，制備成固氮溶磷菌劑，具有促生性能全面，肥效高、造價(jià)低廉的特點(diǎn)，適用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的區(qū)域，制備工藝簡便，固氮溶磷肥效高，有良好的發(fā)展前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102031231SQ20101052929
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月3日
發(fā)明者師尚禮, 張淑卿, 李劍峰, 霍平慧 申請(qǐng)人:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)