專利名稱：一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物及其制備和在煙草加香中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制備煙用香料技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物及其制備和在煙草加香中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
目前煙用香料的制造方法有兩個(gè)，從煙草或其他植物中提取天然香料，或者采用傳統(tǒng)的化工方法合成香料。然而，這兩種方法均存在其各自的局限性，對(duì)于某種植物香料， 其香氣組分及特征是恒定的，我們很難按照對(duì)香味的需要使植物產(chǎn)生具有另一種風(fēng)味的香料，而且植物提取香料的開發(fā)由于可用植物資源的有限而存在局限性。對(duì)于化工合成香料， 除香氣單一外，由于受合成方法及條件的限制，很多優(yōu)良香氣成分尚不能人工合成，或成本太高。人們?cè)诶^續(xù)原有生產(chǎn)技術(shù)的同時(shí)將更多的目光投入到開發(fā)天然香料產(chǎn)品可替代資源方面，生物技術(shù)就是生產(chǎn)天然香料產(chǎn)品最有前途的方法之一。植物內(nèi)生菌是一個(gè)多樣性十分豐富的微生物類群。分布在沒有外部感染的植物組織內(nèi)，并與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，能產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的代謝產(chǎn)物。利用植物內(nèi)生真菌，來研究開發(fā)天然香料，將有十分廣闊的前景。葡萄干營養(yǎng)豐富，它的含水量只有15-25%，富含糖、氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分， 被譽(yù)為“世界水果的明珠”。葡萄干是新鮮葡萄在一定溫度和濕度下經(jīng)過一段時(shí)間晾曬下制成的，是一個(gè)自然發(fā)酵的過程，和新鮮葡萄相比，香氣濃郁，口感甜潤，受葡萄干自然發(fā)酵的啟發(fā)，本發(fā)明人利用植物內(nèi)生菌對(duì)葡萄干進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，以期對(duì)葡萄干進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵，豐富葡萄干的香味。由于微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、 纖維素酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，便可使底物發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用， 形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、酚類、呋喃類、吡嗪類、吡啶類和萜烯類等。這些香氣物質(zhì)也是煙草的香氣組分?，F(xiàn)有技術(shù)中， 利用植物內(nèi)生菌對(duì)葡萄干提取物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)特色煙用香料的方法未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物及其制備和在煙草加香中的應(yīng)用方法。本發(fā)明制成的植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物，具有獨(dú)特的清甜香韻特征，將其應(yīng)用于煙草加香中，煙氣中有果甜香，煙氣細(xì)膩感增加，刺激和殘留減少，余味舒適?！N植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物的制備方法，包括以下步驟(1)植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)將IOOmLPDB培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，用接種環(huán)挑適量植物內(nèi)生菌菌絲接種于三角瓶中，放置于30-37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Μ-2 !使菌種活化，在轉(zhuǎn)速為150r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)，得到活化的種子液，所述的植物內(nèi)生菌為青霉屬(Penicillium sp.)EFCI-24 ；保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2011342 ；(2)葡萄干提取物的制備將挑好、洗凈的葡萄干放入圓底燒瓶中，按葡萄干體積百分比濃度為65-75%的酒精=1 5. 5-6. 5的重量比混合，在75-85°C加熱回流萃取2. 5-3. 5h，提取1_2次，降溫至室溫，過濾，收集濾液。將濾液在溫度45-55°C，真空度不低于0. 95Mpa的條件下濃縮至溶劑蒸發(fā)一半，得葡萄干提取物，115°C下滅菌15-20min ；(3)生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物將培養(yǎng)好的植物內(nèi)生菌接種到滅菌后的葡萄干提取物中，接種體積比為種子液 葡萄干提取物=1 50-100，置于30-37°C的恒溫振蕩器，轉(zhuǎn)速為150r/min下培養(yǎng)M-28h ；(4)將培養(yǎng)后的葡萄干提取物使用板框過濾，過濾其中的菌種，得到生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物。一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物是由上述的方法制備而成的。上述的植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物可以作為煙用香料，添加到香煙中。發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)利用產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的變化來比較內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物的效果，葡萄干提取物用二氯甲烷萃取，將有機(jī)相減壓濃縮，進(jìn)GC-MS，分析其中的香氣成分，發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化后葡萄干中的DDMP (2，3- 二氫-3，5- 二羥基-6-甲基-4H-吡喃酮)和5-羥甲基糠醛含量都有增加，生物轉(zhuǎn)化后的葡萄干提取物清甜香增加。本發(fā)明的方法工藝過程簡單，成本低廉，所得生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物煙用香料能直接用于卷煙的加香加料。生物轉(zhuǎn)化的葡萄干煙用香料具有獨(dú)特的清甜香韻特征，添加在卷煙中有降低刺激，豐富和飽滿煙氣，增加有果甜香，煙氣細(xì)膩感增加，余味舒適。本發(fā)明的植物內(nèi)生菌已于2011年10月10日在中國湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行了保藏。保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2011342;命名為青霉屬 (Penicillium sp.)EFCI_24。


圖1為本發(fā)明中分離得到的喜樹堿內(nèi)生菌在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)學(xué)圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限定。實(shí)施例1(1)喜樹堿內(nèi)生菌的分離和純化用無菌刀刮去喜樹堿樹皮外表皮后，用無菌水沖洗干凈，切成IcmXlcm的小塊， 置于75%乙醇消毒lmin，而后用2. 5%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，再用75%乙醇消毒lmin， 無菌水沖洗2-3次，剪去邊緣，接入PDA平板培養(yǎng)基上。待樹皮表面長出菌絲后挑取其尖端部分移至新鮮PDA培養(yǎng)基上，按照平板劃線分離法反復(fù)進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，用接種環(huán)以無菌操作沾取少許樹皮表明長出的菌絲，在無菌平板表面進(jìn)行連續(xù)劃線，菌絲細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。(2)喜樹堿內(nèi)生菌形態(tài)學(xué)研究對(duì)純化后的喜樹堿內(nèi)生菌用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，顯微鏡下觀察菌絲多分枝，有隔膜，菌絲直徑為2. 6-3. 5 μ m在隔膜處會(huì)有一個(gè)類似收縮的效應(yīng)，因此整個(gè)菌絲呈現(xiàn)出藕節(jié)狀。分生孢子從菌絲細(xì)胞長出，有分枝，分生孢子梗直徑約為2. 4-2. 7 μ m，具橫隔，頂端不膨大，有掃帚狀分枝(圖1)。孢子形態(tài)為圓形或橢圓形、成串、不光滑，大小為 1. 2-1. 4μ m。(3)喜樹堿內(nèi)生菌生理特征和鑒定IOOmLPDB培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，用接種環(huán)挑適量植物內(nèi)生菌菌絲接種于三角瓶中，放置于30-37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Μ-2 !后，能產(chǎn)生白色菌絲，之后白色菌絲匍匐生長，第2天在菌落的中心產(chǎn)生墨綠色粉末狀孢子，到第3天菌落的最中心產(chǎn)生瘤狀突起，邊緣有白色氣生菌絲；培養(yǎng)基的背面青黃色。液體培養(yǎng)時(shí)候生長快速，3d就達(dá)到了生長的對(duì)數(shù)期，然后停止搖床，6d后有墨綠色菌苔布滿表面。菌球白色，菌液青綠色。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，初步可以鑒定為青霉屬。(4)葡萄干提取在裝有回流管、攪拌子的500mL圓底燒瓶中加入50g葡萄干和300mL 70%乙醇， 80°C下加熱回流池，提取2次，過濾，合并濾液，50°C下真空度不低于0. 95Mpa減壓濃縮至溶劑蒸發(fā)一半，得200g左右的葡萄干提取物。(5)葡萄干提取物的滅菌將上述得到的葡萄干提取物在高壓蒸汽式滅菌鍋中115°C下滅菌15-20min。(6)生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物IOOmLPDB培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，用接種環(huán)挑適量植物內(nèi)生菌菌絲接種于三角瓶中，放置于35°C的恒溫培養(yǎng)箱中，150r/min搖床培養(yǎng)2 后得種子液，將培養(yǎng)好的內(nèi)生菌種子液接種到滅菌后的葡萄干提取物中，置于轉(zhuǎn)速為150r/min下35°C的恒溫培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)化25h，接種體積比為種子液葡萄干提取物=1 80，將生物轉(zhuǎn)化好的葡萄干提取物中的菌種使用板框過濾，得到生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物煙用香料。發(fā)明人對(duì)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)，通過氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)葡萄干提取物和生物轉(zhuǎn)化后的葡萄干提取物進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果見表1。表1葡萄干提取物生物轉(zhuǎn)化前后揮發(fā)性成分GC-MS數(shù)據(jù)比較
權(quán)利要求
1.一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)植物內(nèi)生菌的培養(yǎng)將IOOmLPDB培養(yǎng)基裝于250mL三角瓶中，用接種環(huán)挑植物內(nèi)生菌菌絲接種于三角瓶中，放置于30-37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Μ-2 !使菌種活化，在轉(zhuǎn)速為150r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)，得到活化的種子液，所述的植物內(nèi)生菌為青霉屬(Penicillium sp.)EFCI-24 ；保藏編號(hào)為 CCTCC NO :M2011342 ；(2)葡萄干提取物的制備將挑好、洗凈的葡萄干放入圓底燒瓶中，按葡萄干體積百分比濃度為65-75%的酒精 =1:5. 5-6. 5的重量比混合，在75-85°C加熱回流萃取2. 5-3. 5h，提取1_2次，降溫至室溫；過濾，收集濾液；將濾液在溫度45-55°C，真空度不低于0. 95Mpa的條件下濃縮，濃縮至溶劑蒸發(fā)一半，得葡萄干提取物，在高壓蒸汽滅菌鍋中115°C下滅菌15-20min ；(3)生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物將培養(yǎng)好的植物內(nèi)生菌接種到滅菌后的葡萄干提取物中，接種體積比為種子液葡萄干提取物=1 50-100，置于30-37°C的恒溫振蕩器，轉(zhuǎn)速為150r/min下培養(yǎng)M-28h ；(4)將培養(yǎng)后的葡萄干提取物使用板框過濾，過濾其中的菌種，得到生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物。
2.一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物，其特征在于，是由權(quán)利要求1所述的方法制備而成的。
3.權(quán)利要求2所述的植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物的應(yīng)用方法，其特征在于，作為煙用香料，添加到香煙中。
4.一種植物內(nèi)生菌，其特征在于，為青霉菌(Penicillium sp. )EFCI_24。
全文摘要
本發(fā)明屬于煙用香料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種植物內(nèi)生菌生物轉(zhuǎn)化葡萄干提取物及其制備和在煙草加香中的應(yīng)用。方法依以下的步驟進(jìn)行，(1)植物內(nèi)生菌的分離和純化；(2)內(nèi)生菌的培養(yǎng)；(3)葡萄干的提取和精制；(4)用植物內(nèi)生菌對(duì)葡萄干提取物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物。本發(fā)明的方法工藝過程簡單，成本低廉，所得生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物能直接用于卷煙的加香加料。生物轉(zhuǎn)化的葡萄干提取物香料具有獨(dú)特的清甜香，添加在卷煙中有降低刺激，甜香感、烘烤香突出。
文檔編號(hào)C12R1/80GK102392050SQ20111034292
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者劉佳佳, 盧紅兵, 楊華武, 趙國玲 申請(qǐng)人:湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司