專利名稱：一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
乙醇是一種高效、環(huán)保、可再生的燃料及汽油添加劑，大力發(fā)展燃料乙醇，不僅可以有效解決能源日益匱乏的難題，更加可以有效減少環(huán)境污染。我國傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)，一般以糧食為原料，不但成本高而且產(chǎn)量也收糧食資源的限制，產(chǎn)量有限，難以滿足需求。利用能源甜菜進(jìn)行乙醇發(fā)酵工藝的研究越來越引起人們的重視。傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵方式通常采用游離酵母間歇發(fā)酵法，為了提高酵母細(xì)胞的利用率和減少雜菌污染，同時(shí)提高設(shè)備的利用率，利用改進(jìn)的連續(xù)發(fā)酵方式可明顯提高發(fā)酵效率。最初的連續(xù)發(fā)酵使用游離的酵母菌，由于酵母菌體積小，致使在發(fā)酵過程中不斷被成熟的發(fā)酵醪帶走，造成后續(xù)發(fā)酵液中的菌液濃度降低，使整個(gè)發(fā)酵過程延遲，生產(chǎn)效率降低。為了解決以上問題，研究者采用固定化酵母的方法，使酵母菌既不受損傷又不流失，使整個(gè)連續(xù)發(fā)酵過程的菌種濃度幾乎是在同樣條件下進(jìn)行。而固定化后的酵母始終保留在發(fā)酵罐內(nèi)，并能持續(xù)不斷地進(jìn)行繁殖和代謝，從而提高發(fā)酵效率。近幾年來，利用固定化酵母生產(chǎn)乙醇技術(shù)逐漸成為發(fā)酵工藝研究的熱點(diǎn)。但研究表明不同的固定化方法對(duì)菌種的性能保持和發(fā)酵效果影響較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，本發(fā)明以酵母菌為出發(fā)菌株，以能源甜菜為發(fā)酵原料，采用固定化酵母的方法進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。本發(fā)明采用海藻酸鹽作為包埋劑進(jìn)行ADY酵母固定化，利用包埋法進(jìn)行酵母菌固定化效果較好，可連續(xù)多批次進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。I. 一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于發(fā)酵時(shí)，在250 mL三角瓶中裝入一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的固定化酵母種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵制備菌懸液，然后進(jìn)行固定化增值培養(yǎng)。2.步驟I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基稱取已水分平衡的甜菜糊樣品80 g。加入20 mL水分高溫滅菌，在無菌條件下加入15 mL液體種子及其他的營養(yǎng)元素。3.步驟2所述的液體種子培養(yǎng)基200 g馬鈴薯，1000 mL水，20 g葡萄糖，3 g無水硫酸鎂，I. 5 g磷酸二氫鉀，自然pH, 121°C,滅菌15 min,用于固定化酵母的增殖培養(yǎng)。4.步驟I所述的菌懸液的制備方法為在無菌條件下將酵母菌種接入麥芽汁培養(yǎng)基，放入搖床中在30°C，120 r/min條件下增殖12 h。之后，將增殖后的培養(yǎng)液在無菌條件下用離心管分裝，在6000 r/min,4°C下離心10 min棄去上清液,加入適量無菌生理鹽水,將其振蕩打散以清洗菌體，之后又在相同的條件下離心，再清洗，重復(fù)三次，最后一次用無菌水混合菌體制備菌懸液。
5.步驟I所述的固定化方法取一定質(zhì)量的濕菌體，將菌體細(xì)胞加入海藻酸鈉溶液，充分混勻。將海藻酸鈉菌體懸液移入10 HiL注射器中，適度加力，在無菌條件下將海藻酸鈉菌懸液滴入CaCl2溶液中，在磁力攪拌機(jī)的作用下形成固定化小球，常溫下靜置2 h，撈出用無菌去離子水清洗干凈。膠珠撈出沖洗干凈，然后浸泡于0. 5%殼聚糖溶液三維搖床上振搖，完成與殼聚糖的成膜反應(yīng)。水洗除去未反應(yīng)的殼聚糖，將膠珠保存于水中。6.步驟5所述的海藻酸鈉的最佳濃度為4%。7.步驟I所述的最適溫度在32°C，發(fā)酵周期符合生產(chǎn)要求。8.步驟5所述的填充量選擇0. 3 g/mL時(shí)最有利于固定化酵母發(fā)酵酒精。9.步驟I所述的固定化時(shí)間為3 h時(shí)最有利于固定化酵母發(fā)酵酒精。本發(fā)明的有益效果在于發(fā)明采用海藻酸鹽作為包埋劑進(jìn)行酵母固定化，根據(jù)前 期研究結(jié)果選擇所用菌種ADY，旨在探索固定化酵母的穩(wěn)定性和對(duì)能源甜菜乙醇發(fā)酵的批次發(fā)酵效果，從而為下一步工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。


圖I不同濃度海藻酸鈉的發(fā)酵結(jié)果。圖2不同溫度對(duì)固定化酵母發(fā)酵條件的影響。圖3不同填充量對(duì)固定化酵母發(fā)酵酒精的影響。圖4不同固定化時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所用的菌株為巴斯德畢赤酵母，購買于ACCC，編號(hào)為ACCC20065。實(shí)施例I
本實(shí)施案例說明不同海藻酸鈉濃度對(duì)發(fā)酵的影響，海藻酸鈉濃度分別控制在2%，4%，6%和8%，發(fā)酵條件為能源甜菜糊的初糖濃度為15%，顆粒填充率為0. 20 g/mL,溫度為30°C，搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)后靜止培養(yǎng)。得到結(jié)果如圖I所示。由圖I可知，從酒精轉(zhuǎn)化率這個(gè)方面可以較為清晰的看出，海藻酸鈉濃度在4%的時(shí)候，發(fā)酵效果是最好的，酒精濃度最高。因而在之后的固定化發(fā)酵試驗(yàn)中，我們均選取4%作為海藻酸鈉的固定化濃度。實(shí)施例2
本實(shí)施案例說明不同溫度對(duì)固定化酵母發(fā)酵條件的影響，按0. 20 g/mL填充量，將固定化細(xì)胞置于甜菜糊培養(yǎng)基中，溫度選擇分別為20°C，24°C，28°C，32°C，36°C和40°C，pH為自然pH，起始糖度15%，進(jìn)行發(fā)酵。通過測(cè)定不同溫度下的酒精轉(zhuǎn)化率，研究溫度對(duì)固定化酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。溫度對(duì)酵母的生長繁殖、發(fā)酵速度與周期、雜菌污染等影響較大。由圖2可知，當(dāng)溫度低于32°C時(shí)，固定化酵母發(fā)酵速度較慢，隨著溫度的升高，發(fā)酵速度逐漸增加至停滯，最適溫度在32°C，發(fā)酵周期符合生產(chǎn)要求。實(shí)施例3
本實(shí)施案例說明不同填充量對(duì)固定化酵母發(fā)酵酒精的影響，選擇填充量在0. I g/mL,0.2 g/mL,0. 3 g/mL, 0.4 g/mL 和 0.5 g/mL，溫度為 32°C，起始糖度 15%，發(fā)酵 30 h。通過測(cè)定不同填充量下的酒精轉(zhuǎn)化率，研究填充量對(duì)固定化酵母發(fā)酵的影響。結(jié)果見圖3所示。由圖3可知，填充量越大，酒精轉(zhuǎn)化率越高，也就是說糖分利用率越高，填充量繼續(xù)增加，酒精含量反而下降，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，酵母濃度過高，易造成無氧環(huán)境，影響酵母細(xì)胞的增殖，同時(shí)由于酒精含量的增加也對(duì)酵母的發(fā)酵發(fā)生抑制。因此，填充量選擇0.3 g/mL即能節(jié)約資源又能達(dá)到良好的發(fā)酵效果。實(shí)施例4
本實(shí)施案例說明不同固定化時(shí)間對(duì)酒精轉(zhuǎn)化率的影響，根據(jù)固定化方法，僅改變固定化時(shí)間，發(fā)酵條件與前面的實(shí)施例相同，觀察固定化時(shí)間對(duì)酒精轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，固定化時(shí)間為3 h時(shí)，載體酒精轉(zhuǎn)化率最高。海藻酸鈉與鈣鹽作后， 分子中鈉離子與鈣離子進(jìn)行交換，生成海藻酸鈣。由于Ca2+的交聯(lián)作用，隨著固化時(shí)間的增加分子間相互作用力增強(qiáng)，使線性分子彼此相互連接形成空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，母在其中活動(dòng)空間增加，加快繁殖，加速糖度下降。
權(quán)利要求
1.一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于發(fā)酵時(shí)，在250mL三角瓶中裝入一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的固定化酵母種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵制備菌懸液，然后進(jìn)行固定化增值培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基稱取已水分平衡的甜菜糊樣品80 g;加入20 mL水分高溫滅菌，在無菌條件下加入15 mL液體種子及其他的營養(yǎng)元素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，液體種子培養(yǎng)基200g馬鈴薯，1000 mL水,20 g葡萄糖,3 g無水硫酸鎂,1.5 g磷酸二氫鉀，自然pH, 121°C,滅菌15 min,用于固定化酵母的增殖培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，菌懸液的制備方法為在無菌條件下將酵母菌種接入麥芽汁培養(yǎng)基，放入搖床中在30°C，120 r/min條件下增殖12 h ;之后，將增殖后的培養(yǎng)液在無菌條件下用離心管分裝，在6000 r/min,4°C下離心10 min棄去上清液,力口入適量無菌生理鹽水，將其振蕩打散以清洗菌體，之后又在相同的條件下離心，再清洗，重復(fù)三次，最后一次用無菌水混合菌體制備菌懸液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，固定化方法取一定質(zhì)量的濕菌體，將菌體細(xì)胞加入海藻酸鈉溶液，充分混勻；將海藻酸鈉菌體懸液移入10 mL注射器中，適度加力，在無菌條件下將海藻酸鈉菌懸液滴入CaCl2溶液中，在磁力攪拌機(jī)的作用下形成固定化小球，常溫下靜置2 h，撈出用無菌去離子水清洗干凈；膠珠撈出沖洗干凈，然后浸泡于0.5%殼聚糖溶液三維搖床上振搖,完成與殼聚糖的成膜反應(yīng)；水洗除去未反應(yīng)的殼聚糖，將膠珠保存于水中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于海藻酸鈉的濃度為4%。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于最適溫度在32°C，發(fā)酵周期符合生產(chǎn)要求。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于填充量選擇0.3g/mL時(shí)最有利于固定化酵母發(fā)酵酒精。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于固定化時(shí)間為3h時(shí)最有利于固定化酵母發(fā)酵酒精。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用固定化酵母利用能源甜菜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法，本發(fā)明以酵母菌為出發(fā)菌株，以能源甜菜為發(fā)酵原料，采用固定化酵母的方法進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。本發(fā)明采用海藻酸鹽作為包埋劑進(jìn)行ADY酵母固定化，利用包埋法進(jìn)行酵母菌固定化效果較好，可連續(xù)多批次進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12P7/06GK102719487SQ201210253108
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月22日
發(fā)明者周雪琴 申請(qǐng)人:太倉市周氏化學(xué)品有限公司