專利名稱：氨?；璽RNA合成酶的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)氨酰基-tRNA合成酶的組合物的方法和氨?；?tRNA合成酶的組合物及其用途。本發(fā)明也涉及使用所述氨?；?tRNA合成酶和相關(guān)組合物在細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
從細(xì)菌到人類的每種已知生物體的遺傳密碼編碼相同的20種常見氨基酸。相同的20種天然氨基酸的不同組合形成蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)實(shí)際上執(zhí)行從光合作用到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)的生命的所有復(fù)雜過程。為了研究和修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家已嘗試操縱蛋白質(zhì)的遺傳密碼和氨基酸序列。然而，仍難以除去由遺傳密碼施加的約束，其使蛋白質(zhì)受限于20種遺傳編碼的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)造單元(building block)(硒代半胱氨酸(參見(例如)A. Bock 等人，(1991) , Molecular Microbiology 5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見(例如)G. Srinivasan 等人，(2002). Science 296:1459-62)為少有的例外)。對(duì)于除去所述約束已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，盡管所述進(jìn)展是有限的并且合理地控制蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的能力仍處于其初期。舉例而言，化學(xué)工作者已開發(fā)出合成和操縱小分子結(jié)構(gòu)的方法和策略(參見(例如)E. J. Corey和X. -M. Cheng, The Logicof Chemical Synthesis (ffiIey~Interscience. New York, 1995))。全合成(參見(例如)B. Merrifield, (1986), Science 232:341-7(1986))和半合成方法(參見(例如)D. Y. Jackson 等人，(1994) Science266:243-7 ;和 P. E. Dawson 和 S. B. Kent, (2000), AnnualReview of Biochemistry69:923-60),已使合成肽和小蛋白質(zhì)成為可能,但是所述方法對(duì)超過10千道爾頓(kDa)的蛋白質(zhì)來說，具有有限的實(shí)用性。雖然突變方法是有效的，但是其受限于有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)變化。在許多情況下，已經(jīng)有可能在整個(gè)蛋白質(zhì)中競(jìng)爭(zhēng)性地并入常見氨基酸的封閉結(jié)構(gòu)類似物。參見(例如),R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 K. Kirshenbaum 等人，(2002), ChemBioChem 3:235-7 ;和 V. Doring 等人，(2001), Science292:501-4?；瘜W(xué)肽連接和天然化學(xué)連接描述于美國(guó)專利第6，184，344號(hào)、美國(guó)專利公開案第 2004/0138412 號(hào)、美國(guó)專利公開案第 2003/0208046 號(hào)、WO 02/098902 和 WO 03/042235中，所述專利是以引用的方式并入本文中。Lu等人在Mol Cell. 2001年10月；8(4) :759-69中描述了一種方法，其中蛋白質(zhì)與含有非天然氨基酸的合成肽化學(xué)連接(經(jīng)表達(dá)蛋白質(zhì)連接)。早期的工作證明大腸桿菌(E. coli)的轉(zhuǎn)譯機(jī)器將容納結(jié)構(gòu)上與常見20種氨基酸相似的氨基酸。參見，Hortin, G.和 Boime, I. (1983)Methods Enzymol. 96:777-784。所述工作另外通過放寬內(nèi)源性大腸桿菌合成酶的特異性，以便其活化非天然氨基酸以及其同源天然氨基酸而擴(kuò)展。此外，展示了編輯域中的突變也可用以擴(kuò)展內(nèi)源性合成酶的底物范疇。參見，Doring，V.等人，(2001) Science 292:501-504。然而，所述策略都受限于重新編碼遺傳密碼而不是擴(kuò)展遺傳密碼，并且導(dǎo)致常見20種氨基酸中之一者經(jīng)非天然氨基酸不同程度地取代。新近，展示了非天然氨基酸可通過將經(jīng)化學(xué)氨基酰化的正交琥珀抑制基因tRNA添加到活體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯反應(yīng)中，而得以在活體外部位特異性地并入蛋白質(zhì)中。參見(例如)，Noren, C. J.等人，(1989) Science 244:182~188:Bain. T. D.等人，(1989) T. Am.Chem. Soc. Ill: 8013-8014 Dougherty, D. A. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 645-652 Cornish, V. ff.等人，(1995) Angew. Chem. , Int. Ed. 34:621-633 T. A. Ellman 等人， (1992), Science255:197-200 ;和 D. Mendel 等人，(1995), Annual Review of Biophysicsand Biomolecular Structure 24:435-462。所述研究展不，核糖體和轉(zhuǎn)譯因子可與大量非天然氨基酸，甚至是具有異常結(jié)構(gòu)的所述非天然氨基酸相容。不幸地，tRNA的化學(xué)氨基?；抢щy的，并且所述工藝的化學(xué)計(jì)量性質(zhì)嚴(yán)重地限制可產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。已經(jīng)將非天然氨基酸微量注射到細(xì)胞中。舉例而言，非天然氨基酸通過微量注射經(jīng)化學(xué)錯(cuò)誤?；氖葻崴哪はx(Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，M. E. Saks等人，(1996), An engineered Tetrahymena tRNA Gln for in vivo incorporationof unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression,J.Biol.Chem. 271:23169-23175)和相關(guān)mRNA而引入爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopus oocyte)中的煙堿酸乙酸膽喊受體中(例如，M. W. Nowak 等人,(1998), In vivo incorporation of unnaturalamino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system. MethodEnzymoI. 293:504-529)。又參見，D.A. Dougherty(2000)，Unnatural amino acids asprobes of protein structure and function, Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-652 和M. ff. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, ff.G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty 和 H. A. Lester. Science. 268:439(1995) 0爪蟾卵母細(xì)胞與以下活體外制得的兩種RNA物質(zhì)共同注射編碼在所關(guān)注的氨基酸位置處具有UAG終止密碼子的目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA，和經(jīng)所要的非天然氨基酸氨基?；溺暌种苹騮RNA。然后，卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯機(jī)器在規(guī)定的位置上通過UAG將非天然氨基酸插入。不幸地，所述方法受限于在細(xì)胞中可微量注射的蛋白質(zhì)，并且因?yàn)橄嚓P(guān)的tRNA經(jīng)活體外化學(xué)?；⑶也荒茉脔；?，所以蛋白質(zhì)的產(chǎn)量極低。為了克服所述限制，將例如正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶及其對(duì)的新穎組分添加到原核生物大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)(參見(例如)L. Wang等人，(2001), Science 292:498-500)和真核生物釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae,
S.cerevisiae)(例如，J. Chin 等人,Science 301:964-7 (2003))的蛋白質(zhì)生物合成機(jī)器中，其已使非遺傳編碼的氨基酸能活體內(nèi)并入蛋白質(zhì)中。使用所述方法，響應(yīng)(例如)琥珀密碼子(TAG)已經(jīng)將具有新穎化學(xué)、物理或生物性質(zhì)，包括光親和標(biāo)記和可光致異構(gòu)氨基酸、光致交聯(lián)氨基酸(參見(例如)，Chin, J. ff.等人(2002) ProoNatLAcad ScLU. S. A. 99:11020-11024 ；和 Chin, J. W.等人(2002) T. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027)、酮氨基酸(參見(例如)，Wang, L.等人，(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:56-61 和Zhang, Z.等人，Biochem. 42(22) :6735-6746 (2003))、含有重原子的氨基酸和經(jīng)糖基化的氨基酸的大量新穎氨基酸有效地且以高 保真度并入大腸桿菌和酵母中的蛋白質(zhì)中。參見(例如)，J. W. Chin 和 P. G. Schultz, (2002). ChemBioChem 3(11) :1135-1137 ;和 L. Wang 和P. G. Schultz, (2002) Chem. Comm. 1:1-11。已經(jīng)報(bào)道了若干其他的正交對(duì)。從釀酒酵母tRNA和合成酶得到的谷氨酰胺?；?參見(例如)，Liu，D.R.和 Schultz. P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. ,96:4780-4785)、天冬氨?；?參見(例如)，Pastrnak, M.等人，(2000) Helv.Chim. Acta 83:2277-2286)和酪氨?；?參見(例如)，Ohno, S.等人，(1998) T. Biochem.(Tokyo. Tpn. ) 124:1065-1068 和 Kowal, A.K.等人，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci.U- S. A. 98:2268-2273)系統(tǒng)已經(jīng)被描述用于將非天然氨基酸潛在地并入大腸桿菌中。從大腸桿菌谷氨酰胺酰基(參見(例如)，Kowal，A.K.等人，(2001)ProoNatLAcad Sci.U. S. A. 98:2268-2273)和酪氨?；?參見(例如)，Edwards, H.和 Schi_el, P. (1990)Mol.Cell. Biol. 10:1633-1641)合成酶得到的系統(tǒng)已經(jīng)被描述適用于釀酒酵母。大腸桿菌酪氨酰基系統(tǒng)已經(jīng)用于將3-碘-L-酪氨酸活體內(nèi)并入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。參見，Sakamoto，K.等人，(2002)Nucleic Acids Res. 30:4692-4699。通常，所述系統(tǒng)利用琥珀終止密碼子。為進(jìn)一步擴(kuò)展遺傳密碼，需要開發(fā)生物合成機(jī)器的改善和/或其他組分，例如氨?；?tRNA合成酶。如基于以下揭示案的評(píng)述將明顯可見，本發(fā)明滿足所述的和其他的需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了擴(kuò)展遺傳密碼，本發(fā)明提供正交氨?；?tRNA合成酶的組合物和生產(chǎn)正交氨?；?tRNA合成酶的方法。本發(fā)明的氨?；?tRNA合成酶用非天然編碼的氨基酸氨基酰化tRNA。這些轉(zhuǎn)譯組分可用來響應(yīng)由tRNA識(shí)別出的選擇密碼子(selector codon)而將所選氨基酸并入生長(zhǎng)多肽鏈中的特定位置中(在核酸轉(zhuǎn)譯期間))。在細(xì)胞中用所選氨基酸在規(guī)定位置生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法也是本發(fā)明的特征。舉例而言，方法包括在適當(dāng)培養(yǎng)基中使細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含包括至少一個(gè)選擇密碼子并且編碼蛋白質(zhì)的核酸；和提供所選氨基酸。細(xì)胞另外包含在細(xì)胞中起作用并且識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA (0-tRNA);和用所選氨基酸優(yōu)先氨基酰化0-tRNA的正交氨?；?tRNA合成酶(0-RS)。通常，0-tRNA包含在同源合成酶的存在下抑制活性。由所述方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的特征。


圖I-展示具有TWC莖突變部位的J17tRNA的四葉式交叉(cloverleaf)結(jié)構(gòu)。圖2-展示使用J17或J17突變體(F12、F13、F14)和E9RS的人類生長(zhǎng)激素的琥珀突變的抑制。各個(gè)樣品總細(xì)胞溶胞產(chǎn)物通過SDS PAGE來分析。圖3-展示在不同細(xì)胞系中，使用F13和E9RS的人類生長(zhǎng)激素的琥珀突變的抑制。
具體實(shí)施例方式定義在詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不受限于具體的生物系統(tǒng)，本發(fā)明當(dāng)然可以變化。也應(yīng)了解，本文中使用的術(shù)語僅是為了描述具體的實(shí)施例，并且不希望限制本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的范疇將僅由附加權(quán)利要求書來限制。如本文中和附加權(quán)利要求書中所使用，除非上下文另外清楚地規(guī)定，否則單數(shù)形式“一”和“所述”包括復(fù)數(shù)個(gè)參考物。因此，舉例而言，提及“一種細(xì)胞”包括兩種或兩種以上細(xì)胞的組合并且包括所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其等價(jià)物，等等。提及“細(xì)菌”包括細(xì)菌的混合物諸如此類。除非在本文中和以下說明書的剩余部分中規(guī)定，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所了解的相同的含義。
本文中提及的所有公開案和專利是以引用的方式并入本文中，以達(dá)到描述和揭示(例如)公開案中描述的，可能與當(dāng)前描述的發(fā)明聯(lián)系使用的構(gòu)筑體和方法的目的。所提供的本文中討論的公開案僅為在本專利申請(qǐng)案的申請(qǐng)日之前的其揭示案。在此并非解釋為允許本發(fā)明者由于先前發(fā)明或由于任何其他原因而比所述揭示案提前得到授權(quán)。同源(Homologous):蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)序列，當(dāng)其天然地或人工地從共同的原始蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)序列得到時(shí)，是“同源的”。同樣地，核酸和/或核酸序列，當(dāng)其天然地或人工地從共同的原始核酸或核酸序列得到時(shí)，是同源的。舉例而言，任何天然存在的核酸可通過任何可用的突變方法修飾以包括一個(gè)或一個(gè)以上選擇密碼子。當(dāng)被表達(dá)時(shí)，所述經(jīng)突 變的核酸編碼包含一種或一種以上所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。當(dāng)然，突變處理可另外改變一個(gè)或一個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)密碼子，進(jìn)而也改變所得突變蛋白質(zhì)中的一種或一種以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。所述一種或一種以上標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以變成非天然氨基酸或天然氨基酸。同源性通常從兩種或兩種以上的核酸或蛋白質(zhì)(或其序列)之間的序列相似性來推斷。適用于建立同源性的序列之間相似性的精確百分比隨所討論的核酸和蛋白質(zhì)而變化，但僅僅25%的序列相似性通常用以建立同源性。例如30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 或 99% 以上的高水平的序列相似性也可用以建立同源性。用于確定序列相似性百分比的方法(例如，使用缺省參數(shù)的BLASTP 和BLASTN)描述于本文中并且通?？捎?。正交^如本文中所使用，術(shù)語“正交”指的是通過所關(guān)注的系統(tǒng)(例如轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞)以降低的效率使用的分子(例如正交tRNA (0-tRNA)和/或正交氨?；鵷RNA合成酶(0-RS))。正交指的是正交tRNA和/或正交RS在所關(guān)注的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中不能起作用或效率降低，例如小于20%有效、小于10%有效、小于5%有效或例如小于1%有效。舉例而言，當(dāng)與內(nèi)源性tRNA通過內(nèi)源性RS的氨基酰化相比較時(shí)，所關(guān)注的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中的正交tRNA是通過所關(guān)注的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)的任何內(nèi)源性RS以降低或甚至為零的效率氨基?；?。在另一實(shí)例中，當(dāng)與內(nèi)源性tRNA通過內(nèi)源性RS的氨基?；啾容^時(shí)，正交RS以降低或甚至為零的效率氨基?；P(guān)注的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中的任何內(nèi)源性tRNA?？蓪⑴c第一正交分子一同起作用的第二正交分子引入細(xì)胞中。舉例而言，正交tRNA/RS對(duì)包括所引入的互補(bǔ)組分，所述互補(bǔ)組分在細(xì)胞中以某一效率(例如，約50%效率、約60%效率、約70%效率、約75%效率、約80%效率、約85%效率、約90%效率、約95%效率或約99%或99%以上的效率)一同對(duì)對(duì)應(yīng)的tRNA/RS內(nèi)源性對(duì)的組分起作用?！罢恍缘母纳啤敝傅氖桥c起始物質(zhì)或天然存在的tRNA或RS相比較正交性增強(qiáng)。同源物術(shù)語“同源物”指的是一同起作用的組分，例如tRNA和氨?；?tRNA合成酶。所述組分也可稱為互補(bǔ)組分。優(yōu)先氨基酰化術(shù)語“ 優(yōu)先氨基?；敝傅氖桥cO-RS氨基?；烊淮嬖诘膖RNA或用以產(chǎn)生0-tRNA的起始物質(zhì)的效率相比較，O-RS用例如非天然氨基酸的所選氨基酸氨基?；?-tRNA的效率，例如約70%有效、約75%有效、約80%有效、約85%有效、約90%有效、約95%有效或約99%或99%以上有效。因而，非天然氨基酸以高保真度，(例如)以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約70%的效率、對(duì)給定選擇密碼子來說大于約75%的效率、對(duì)給定選擇密碼子來說大于約80%的效率、對(duì)給定選擇密碼子來說大于約85%的效率、對(duì)給定選擇密碼子來說大于約90%的效率、對(duì)給定選擇密碼子來說大于約95%的效率或?qū)o定選擇密碼子來說大于約99%的效率，并入生長(zhǎng)多肽鏈中。詵擇密碼子術(shù)語“選擇密碼子”指的是在轉(zhuǎn)譯過程中通過0-tRNA識(shí)別并且不通過內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。0-tRNA反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇密碼子并且在多肽中的所述部位處并入其氨基酸，例如所選氨基酸，諸如非天然氨基酸。選擇密碼子可包括(但不限于)(例如)無義密碼子，諸如包括(但不限于)琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子的終止密碼子；4或4個(gè)以上堿基密碼子；稀有密碼子；由天然或非天然堿基對(duì)得到的密碼子和/或類似物。對(duì)給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包括天然3堿基密碼子之一，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或很少使用)所述天然3堿基密碼子。舉例而言，內(nèi)源性系統(tǒng)包括缺乏識(shí)別天然3堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)和/或其中天然3堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。抑制基因tRNA :抑制基因tRNA是在給定轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，(例如)通過提供響應(yīng)選擇密碼子而將氨基酸并入多肽鏈中的機(jī)制，來改變信使RNA (mRNA)的讀取的tRNA。舉例而言，抑制基因tRNA可讀遍包括(但不限于)終止密碼子、4堿基密碼子或稀有密碼子的密碼子。抑制活件術(shù)語“抑制活件”指的是例如抑制基因tRNA的tRNA讀遍選擇密碼子的能力?；钚钥杀硎緸楫?dāng)與對(duì)照物(例如缺乏同源物合成酶)相比時(shí)，所觀察到的活性的百分比。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)術(shù)語“轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)”指的是將天然存在的氨基酸并入牛長(zhǎng)多肽鏈(蛋白質(zhì))中所必需的組分。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)的組分可包括(例如)核糖體、tRNA、合成酶、mRNA,諸如此類?？蓪⒈景l(fā)明的組分添加到活體外或活體內(nèi)轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)非真核細(xì)胞，例如細(xì)菌(諸如大腸桿菌)；真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞；無細(xì)胞的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，例如細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；和/或類似物。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)可以是細(xì)胞的或無細(xì)胞的，并且可以是原核的或真核的。細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)包括(但不限于)全細(xì)胞制劑，諸如透性化細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所要的核酸序列可轉(zhuǎn)錄成mRNA并且所述mRNA被轉(zhuǎn)譯。無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)為市售的并且許多不同類型和系統(tǒng)是熟知的。無細(xì)胞系統(tǒng)的實(shí)例包括(但不限于)原核溶胞產(chǎn)物，諸如大腸桿菌溶胞產(chǎn)物；和真核溶胞產(chǎn)物，諸如小麥胚芽提取物、昆蟲細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶胞產(chǎn)物、兔卵母細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和人類細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。當(dāng)所得蛋白質(zhì)經(jīng)糖基化、磷酸化或另外修飾時(shí)，真核提取物或溶胞產(chǎn)物可為優(yōu)選的，因?yàn)樵S多所述修飾僅在真核系統(tǒng)中為可能的。一些所述提取物和溶胞產(chǎn)物為市售的(Promega;Madison, Wis. ; Stratagene ; La Jolla, Calif ；Amersham; Arlington Heights, 111. ;GIBCO/BRL;Grand Island, N. Y.)。諸如含有微粒體膜的犬胰腺提取物的膜狀提取物也可用，其適用于轉(zhuǎn)譯分泌蛋白。也可以使用重構(gòu)轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。經(jīng)純化的轉(zhuǎn)譯因子的混合物以及由諸如起始因子-I(IF-l)、IF-2、IF-3 (a或￠)、延伸因子T (EF-Tu)或末端因子的經(jīng)純化的轉(zhuǎn)譯因子補(bǔ)充的溶胞產(chǎn)物的組合或溶胞產(chǎn)物也已經(jīng)成功用以將mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。無細(xì)胞系統(tǒng)也可以是偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，其中將DNA引入系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄成mRNA并且將mRNA如CurrentProtocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等編，Wiley Interscience, 1993)中所述來轉(zhuǎn)譯，該文獻(xiàn)在此特別以引用的方式并入。在真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄的RNA可以呈異核RNA ChnRNA)或5’ -末端帽(7-甲基鳥嘌呤核苷)和3’ -末端多聚A有尾成熟mRNA形式，其可為某些轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中的優(yōu)點(diǎn)。舉例而言，加帽mRNA以高效率在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶胞產(chǎn)物系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)譯。所選氨基酸術(shù)語“所選氨基酸”指的是任何所要的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。如本文中所使用，術(shù)語“非天然氨基酸”或“非天然編碼的氨基酸”指的是任何氨基 酸、經(jīng)修飾的氨基酸和/或不為20種常見天然存在的氨基酸之一或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的氨基酸類似物。可以與術(shù)語“非天然編碼的氨基酸”和“非天然氨基酸”同義地使用的其他術(shù)語為“非天然的氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”和其各種用連字號(hào)連接的和未用連字號(hào)連接的型式。術(shù)語“非天然編碼的氨基酸”也包括(但不限于)通過修飾(例如，后轉(zhuǎn)譯修飾)天然編碼的氨基酸(包括但不限于20種常見氨基酸或吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸)產(chǎn)生的氨基酸，但不為通過轉(zhuǎn)譯復(fù)合物而將其本身天然地并入生長(zhǎng)多肽鏈的氨基酸。所述非天然存在的氨基酸的實(shí)例包括(但不限于)N-乙酰氨基葡萄糖基-L-絲氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-蘇氨酸和0-磷酸化酪氨酸。由...得到如本文中所使用，術(shù)語“由…得到”指的是從規(guī)定分子或生物體分離的組分或使用來自規(guī)定分子或生物體信息制得的組分。IH性選擇或篩選標(biāo)記物如本文中所使用，術(shù)語“ IH性選擇或篩選標(biāo)記物”指的是當(dāng)存在時(shí)(例如)經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等等時(shí)使得具有正性選擇標(biāo)記物的細(xì)胞從不具有正性選擇標(biāo)記物的細(xì)胞鑒別出的標(biāo)記物。負(fù)性選擇或篩選標(biāo)記物如本文中所使用，術(shù)語“負(fù)性選擇或篩選標(biāo)記物”指的是當(dāng)存在時(shí)(例如)經(jīng)表達(dá)、經(jīng)活化等等時(shí)容許鑒別出不具有所要性質(zhì)的細(xì)胞(例如，當(dāng)與具有所要性質(zhì)的細(xì)胞相比時(shí))的標(biāo)記物。報(bào)告基因(Reporter):如本文中所使用，術(shù)語“報(bào)告基因”指的是可用以選擇所關(guān)注系統(tǒng)的目標(biāo)組分的組分。舉例而言，報(bào)告基因可包括蛋白質(zhì)，例如給與抗生素抗性或敏感性的酶(包括(但不限于)￠-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，諸如此類)、熒光篩選標(biāo)記物(包括(但不限于)綠色熒光蛋白質(zhì)(例如GFP )、YFP、EGFP、RFP )、發(fā)光標(biāo)記物(包括(但不限于)螢火蟲熒光素酶蛋白質(zhì))、基于親和力的篩選標(biāo)記物；或正性或負(fù)性可選擇標(biāo)記物基因，諸如 lacZ、3 -gal/lacZ ( ^ -半乳糖苷酶)、ADH (醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2 等等。真核牛物如本文中所使用，術(shù)語“真核牛物”指的是屬于真核種系發(fā)牛域(phylogenetic domain Eucarya)的生物體,諸如動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬蟲、鳥等)，纖毛蟲，植物(包括(但不限于)單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)，真菌，酵母，鞭毛蟲，微粒子蟲目，原生生物等。非真核牛物如本文中所使用，術(shù)語“非真核牛物”指的是非真核牛物體。舉例而言，非真核生物體可屬于真細(xì)菌類(Eubacteria)(包括(但不限于)大腸桿菌、嗜熱細(xì)菌(Thermus thermophilics)、嗜熱月旨肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、突光極毛桿菌(Pseudomonas fluorescens)、綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡息極毛桿菌(Pseudomonas putida)等)種系發(fā)生域，或原生類(Archaea)(例如，詹氏甲燒球菌(Methanococcus jannaschii)、橫川病毒(Methanobacterium thermoautotrophicum)、諸如富饒鹽菌(Haloferax volcanii)和鹽桿菌種(Halobacterium species) NRC-I 的鹽桿菌屬(Halobacterium)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、火球菌(Pyrococcusfuriosus)、掘越氏熱球菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜熱菌敏捷氣熱菌(Aeuropyrumpernix)等)種系發(fā)生域。保守變體術(shù)語“保守變體”指的是例如保守變體0-tRNA或保守變體O-RS的轉(zhuǎn)譯 組分，所述轉(zhuǎn)譯組分如例如0-tRNA或O-RS的組分(保守變體以其為基礎(chǔ))一樣執(zhí)行功能，但在序列中具有變化。舉例而言，盡管0-tRNA和保守變體0-tRNA不具有相同序列，但是O-RS將用例如非天然氨基酸的所選氨基酸氨基酰化互補(bǔ)的0-tRNA或保守變體0-tRNA。同樣地，盡管O-RS和保守變體O-RS不具有相同序列，但是tRNA將通過互補(bǔ)的O-RS或保守變體0-RS，經(jīng)例如非天然氨基酸的所選氨基酸氨基?；?。只要保守變體與對(duì)應(yīng)的0-tRNA或O-RS互補(bǔ)，保守變體就可在序列中具有(例如)I種變化、2種變化、3種變化、4種變化或5種或5種以上的變化。選擇或篩選劑如本文中所使用，術(shù)語“選擇或篩選劑”指的是當(dāng)存在時(shí)，允許從群體中選擇/篩選某些組分的試劑。舉例而言，選擇或篩選劑包括(但不限于)(例如)營(yíng)養(yǎng)素、抗生素、光的波長(zhǎng)、抗體、經(jīng)表達(dá)的多核苷酸等等。選擇劑可(例如)因濃度、強(qiáng)度等而變化。術(shù)語“未有效地識(shí)別出”指的是來自一種生物體的RS氨基?；?-tRNA的例如小于約10%、小于約5%或小于約1%的效率。
具體實(shí)施例方式適于制造包括一種或一種以上例如非天然氨基酸的所選氨基酸的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，描述于標(biāo)題為 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL tRNA SYNTHETASE PAIRS” 的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126，931 和標(biāo)題為 “INVIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS” 的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126, 927 中。另夕卜，參見標(biāo)題為“EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE^USSN 10/825,867。每一所述申請(qǐng)案都以引用的方式全部并入本文中。所述轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)通常包含，包括正交tRNA( 0-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)和例如非天然氨基酸的所選氨基酸的細(xì)胞，其中O-RS用所選氨基酸氨基?；?-tRNA。本發(fā)明的正交對(duì)包含0-tRNA (例如抑制基因tRNA、移碼tRNA等等)和0-RS。0-tRNA識(shí)別第一選擇密碼子并且在同源合成酶的存在下響應(yīng)選擇密碼子而具有抑制活性。細(xì)胞使用所述組分將所選氨基酸并入生長(zhǎng)多肽鏈中。舉例而言，包含編碼所關(guān)注的多肽的多核苷酸的核酸也可存在，其中多核苷酸包含通過0-tRNA識(shí)別出的選擇密碼子。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)也可為活體外系統(tǒng)。本發(fā)明的RS分子適用于包括在轉(zhuǎn)譯中利用核糖體的系統(tǒng)中的任何轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)也可以是無細(xì)胞(活體外)轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。在可包括mRNA作為模板(活體外轉(zhuǎn)譯)或者DNA作為模板(經(jīng)組合的活體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯)的所述系統(tǒng)中，活體外合成通過核糖體引導(dǎo)。已經(jīng)對(duì)開發(fā)無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了相當(dāng)大的努力。參見(例如)，Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316 (2001)；Kim, D. M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000) ；Kim, D.M.和 J. R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390，(2000) ；Kim, D. M.和J. R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188，(1999)；和 Patnaik, R.和 J. R. Swartz, Biotechniques 24，862-868，(1998);美國(guó)專利第 6，337，191 號(hào)；美國(guó)專利公開案第2002/0081660號(hào)；W000/55353 ；W0 90/05785，所述文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。可以應(yīng)用的另一種方法包括mRNA-肽融合技術(shù)。參見(例如)，R. Roberts和 J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997) ；A. Frankel 等人，Chemistry&Biology 10:1043-1050(2003)。在所述方法中，與嘌呤霉素連接的mRNA模板在核糖體上被轉(zhuǎn)譯成肽。如果已經(jīng)修飾一個(gè)或一個(gè)以上tRNA分子，那么也可將非天然氨基酸并入肽中。在已經(jīng)閱讀末尾mRNA密碼子后，嘌呤霉素俘獲肽的C-末端。如果在活體外檢定中發(fā)現(xiàn)所得mRNA-肽結(jié)合物具有所關(guān)注的性質(zhì)，那么其同一性可容易地從mRNA序列展現(xiàn)。這樣，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以篩選包含一種或一種以上非天然編碼的氨基酸的多肽 的庫，以鑒別具有所要性質(zhì)的多肽。近期，已經(jīng)報(bào)道用經(jīng)純化的組分的活體外核糖體轉(zhuǎn)譯允許合成經(jīng)非天然編碼的氨基酸取代的肽。參見(例如)A. Forster等人，Proc. Natl Acad.Sci. (USA) 100:6353(2003)。在某些實(shí)施例中，包含本發(fā)明的RS的大腸桿菌細(xì)胞包括所述轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。舉例而言，本發(fā)明的大腸桿菌細(xì)胞包括正交tRNA(0-tRNA)，其中0-tRNA包含在同源合成酶存在下響應(yīng)選擇密碼子的抑制活性；正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS);所選氨基酸；和包含編碼所關(guān)注的多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含由0-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。本發(fā)明也提供在容許并入一種以上所選氨基酸的細(xì)胞中的多個(gè)0-tRNA/0-RS對(duì)。在某些實(shí)施例中，細(xì)胞可另外包括其他不同的0-tRNA/0-RS對(duì)和第二所選氨基酸，其中0-tRNA識(shí)別第二選擇密碼子并且O-RS用第二所選氨基酸優(yōu)先氨基酰化0-tRNA。舉例而言，細(xì)胞可另外包含(例如)由詹氏甲烷球菌的酪氨?；鵷RNA合成酶得到的琥珀抑制基因tRNA-氨酰基tRNA合成酶對(duì)。0-tRNA和/或O-RS可為天然存在的或可通過來自各種生物體的天然存在的tRNA和/或RS的突變而得到，例如所述突變產(chǎn)生tRNA的庫和/或RS的庫。舉例而言，一種生產(chǎn)正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶對(duì)的策略涉及將來自(例如)不同于宿主細(xì)胞的來源或多個(gè)來源的異源性tRNA/合成酶對(duì)引進(jìn)宿主細(xì)胞中。異源性合成酶候選者的性質(zhì)包括,(例如)其不裝填任何宿主細(xì)胞tRNA，并且異源性tRNA候選者的性質(zhì)包括，(例如)其不通過任何宿主細(xì)胞合成酶而氨基?；Ａ硗?，異源性tRNA與所有宿主細(xì)胞合成酶正交。用于產(chǎn)生正交對(duì)的第二種策略涉及產(chǎn)生從其篩選和/或選擇0-tRNA或O-RS的突變體庫。所述策略也可組合。在各種實(shí)施例中，0-tRNA和O-RS是由至少一種生物體得到。在另一個(gè)實(shí)施例中，0-tRNA是由來自第一生物體的天然存在的或經(jīng)突變的天然存在的tRNA得到，并且O-RS是由來自第二生物體的天然存在的或經(jīng)突變的天然存在的RS得到。在一個(gè)實(shí)施例中，第一生物體和第二生物體是不同的。舉例而言，正交對(duì)可以包括由橫川病毒得到的tRNA合成酶和由古細(xì)菌tRNA (例如來自鹽桿菌種NRC-1)得到的tRNA。或者，第一生物體和第二生物體是相同的。為補(bǔ)充信息，參見本文中標(biāo)題為“來源和宿主生物體”的部分。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，本發(fā)明的O-RS包含如SEQ ID NO: 4中所述的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列或其保守變化，或通過如SEQ ID N0:4中所述的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列或其保守變化來編碼。在某些實(shí)施例中，O-RS包含如SEQ IDN0:5中所述的氨基酸序列。又參見本文中標(biāo)題為“核酸和多肽序列和變體”的部分。tRNA (0-tRNA)正交tRNA (0-tRNA)介導(dǎo)將所選氨基酸(例如)活體內(nèi)或活體外并入蛋白質(zhì)中，所述蛋白質(zhì)通過包含由0-tRNA識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸來編碼。0-tRNA可以通過包括(但不限于)化學(xué)氨基酰化或酶促氨基?；娜魏畏椒ɑ蚣夹g(shù)用所要氨基酸來氨基?；?。經(jīng)氨基?；?-tRNA可以被直接地添加到轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中。0-tRNA可以通過本發(fā)明的RS用所選氨基酸活體外或活體內(nèi)氨基?；?。另外，RS可為0-RS。0-tRNA可直接地或通過提供編碼0-tRNA或其部分的多核苷酸而提供到轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)(例如，活體外轉(zhuǎn)譯組分或細(xì)胞)中。舉例而 言，0-tRNA或其部分通過如SEQ ID N0:USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3中所述的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列或其保守變化來編碼。O-RS可直接地(例如SEQ ID N0:5或SEQID NO: 17或其保守變化)或通過提供編碼O-RS或其部分的多核苷酸而提供到轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)(例如，活體外轉(zhuǎn)譯組分或細(xì)胞)中。舉例而言，O-RS或其部分通過如SEQ ID N0:4中所述的多核苷酸序列、編碼氨基酸序列SEQ IDNO: 17的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列或其保守變化來編碼。本發(fā)明的0-tRNA包含在同源合成酶存在下響應(yīng)選擇密碼子的抑制活性。抑制活性可通過所屬領(lǐng)域中已知的多種檢定中的任何一種來測(cè)定。舉例而言，可使用￠-半乳糖苷酶報(bào)告基因檢定。(例如)在IacZ的肽VVLQRRDWEN的Leu_25經(jīng)例如TAG、TGA、AGGA等密碼子的選擇密碼子或酪氨酸、絲氨酸、白氨酸等的有義密碼子(作為對(duì)照)置換時(shí)，使用在啟動(dòng)子控制下表達(dá)IacZ基因的質(zhì)粒的衍生物。將經(jīng)衍生的IacZ質(zhì)粒連同包含本發(fā)明的0-tRNA的質(zhì)粒一起引入來自適當(dāng)生物體(例如,其中可使用正交組分的生物體)的細(xì)胞中。也可引入同源合成酶(作為多肽或者當(dāng)被表達(dá)時(shí)編碼同源合成酶的多核苷酸)。使細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到所要密度，例如生長(zhǎng)到0D_為約0. 5，并且(例如)使用BetaFluor ^ -半乳糖苷酶檢定試劑盒(Novagen)執(zhí)行P _半乳糖苷酶檢定。抑制百分比是按樣本相對(duì)于例如從經(jīng)衍生的IacZ構(gòu)筑體觀察到的值的可比較對(duì)照物的活性的百分比來計(jì)算，其中構(gòu)筑體在所要位置具有對(duì)應(yīng)的有義密碼子而不是選擇密碼子。適用于本發(fā)明的0-tRNA的實(shí)例是揭示于美國(guó)專利申請(qǐng)案10/126，931、10/126，927和10/825，867中的0-tRNA分子的任何一種分子。在tRNA分子中，胸苷嘧啶(T)經(jīng)尿嘧啶(U)置換。另外，可存在對(duì)堿基的其他修飾。本發(fā)明也包括0-tRNA的保守變化。舉例而言，0-tRNA的保守變化包括如0-tRNA —樣起作用并且維持tRNA L-形結(jié)構(gòu)，但不具有相同序列(并且不同于野生型tRNA分子)的分子。又參見本文中標(biāo)題為“核酸和多肽序列和變體”的部分。包含0-tRNA的組合物可另外包括正交氨?；?tRNA合成酶(0-RS)，其中O-RS用所選氨基酸(例如非天然氨基酸)優(yōu)先氨基?；?-tRNA。在某些實(shí)施例中，包括0-tRNA的組合物可另外包括轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)(例如，活體外或活體內(nèi)轉(zhuǎn)譯系統(tǒng))。包含編碼所關(guān)注的多肽的多核苷酸的核酸也可存在于細(xì)胞或其他轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中，其中所述多核苷酸包含一個(gè)或一個(gè)以上由0-tRNA識(shí)別的選擇密碼子，或所述選擇密碼子的一個(gè)或一個(gè)以上的組合。又參見，本文中標(biāo)題為“正交氨?；?tRNA合成酶(0-RS)”的部分。生產(chǎn)例如0-tRNA的正交tRNA (0-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征。通過所述方法生產(chǎn)的例如0-tRNA的tRNA也是本發(fā)明的特征。生產(chǎn)正交tRNA的方法包括使tRNA的集合中的每一 tRNA的反密碼子環(huán)突變以容許識(shí)別選擇密碼子(例如，琥珀密碼子、蛋白石密碼子、4堿基密碼子等)，進(jìn)而提供多個(gè)可能的0-tRNA ;且分析多個(gè)可能的0-tRNA的成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)以鑒別二級(jí)結(jié)構(gòu)中的非規(guī)范堿基對(duì)；且視需要使非規(guī)范堿基對(duì)突變(例如，使非規(guī)范堿基對(duì)突變成規(guī)范堿基對(duì))。非規(guī)范堿基對(duì)可位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的莖區(qū)。0-tRNA可以具有一種或一種以上特征或活性的改善，諸如與例如多個(gè)tRNA序列的起始物質(zhì)相比，所要生物體的正交性的改善，同時(shí)保持其對(duì)所要RS的親和力。 或者，0-tRNA可以通過使已知tRNA突變來發(fā)展以調(diào)節(jié)其與一種或一種以上影響轉(zhuǎn)譯或?yàn)檗D(zhuǎn)譯機(jī)器的組分的分子的相互作用或?qū)λ龇肿拥慕Y(jié)合親和力。所述組分包括(但不限于)延伸因子。細(xì)菌延伸因子EF-Tu在蛋白質(zhì)合成的延伸步驟中起關(guān)鍵作用。在tRNA通過tRNA合成酶氨基?；?，EF-Tu結(jié)合經(jīng)氨基?；膖RNA并且將其帶到核糖體的A部位。由于EF-Tu與經(jīng)氨基酰化的tRNA之間的結(jié)合，經(jīng)裝填的氨基酸與tRNA之間的酯鍵受自發(fā)水解作用的保護(hù)。Stortchevoi等人研究了在TWC莖中的大腸桿菌起始tRNA 61 U50:G64擺動(dòng)堿基對(duì)的突變體，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)所述堿基對(duì)為阻斷延伸中的tRNA活性的第二負(fù)性決定子，估計(jì)可能由于EF-Tu. GTP與經(jīng)氨基酰化的tRNA之間減弱的相互作用(JBC 2003278(20) : 17672-17679)。同樣，LaRiviere 等人在 Science 2001 年 10 月 5日；294 (5540) :165-8中描述了氨基酸和tRNA體對(duì)與EF-Tu的總結(jié)合親和力的熱力學(xué)貢獻(xiàn)。他們指出，tRNA體和氨基酸的貢獻(xiàn)彼此獨(dú)立并且當(dāng)tRNA經(jīng)正確?；瘯r(shí)，其相互補(bǔ)充。對(duì)EF-Tu. GTP與經(jīng)非天然氨基酸氨基?；膖RNA之間相互作用的改變可以影響將tRNA加載到核糖體的A部位的效率?？赡艿耐蛔儾课灰部梢酝ㄟ^分析tRNA與諸如EF-Tu的轉(zhuǎn)譯機(jī)器的其他組分之間的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)而發(fā)現(xiàn)。舉例而言，Nissen等人已指出，EF-Tu.GTP與酵母苯丙氨?；?轉(zhuǎn)移RNA (Phe-tRNA)的TWC莖的磷酸酯骨架直接結(jié)合(Science1995270 (5241):1464-1472)。所述方法視需要包括分析tRNA和/或氨酰基-tRNA合成酶的序列同源性，以確定似乎對(duì)特定生物體來說為正交的0-tRNA、0-RS和/或其對(duì)的可能候選者?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域中已知的和本文中描述的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行分析。在一個(gè)實(shí)例中，為選擇適用于原核生物體的可能的正交轉(zhuǎn)譯組分，選擇對(duì)原核生物體不顯示異常同源性的合成酶和/或tRNA。tRNA的集合也可通過一致的策略生產(chǎn)。舉例而言，tRNA的集合是通過比對(duì)多個(gè)tRNA序列；確定一致序列；和使用至少一部分、大部分或全部一致序列產(chǎn)生tRNA的庫而生產(chǎn)。舉例而言，一致序列可用例如GCG程序堆積(GCG program pileup)的計(jì)算機(jī)程序來編輯。視需要，將通過所述程序確定的簡(jiǎn)并位置(degenerate position)變成在所述位置處最常見的堿基。庫通過所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)使用一致序列合成。舉例而言，寡核苷酸的重疊延伸作用(其中tRNA基因的各部位可被合成為90% —致序列和10%其他3個(gè)堿基的混合物的摻雜混合物)可用以提供基于一致序列的庫。也可使用其他混合物，例如75%—致序列和25%其他3個(gè)堿基的混合物、80% —致序列和20%其他3個(gè)堿基的混合物、95% —致序列和5%其他3個(gè)堿基的混合物等。突變tRNA的庫可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種突變技術(shù)產(chǎn)生。舉例而言,突變tRNA可通過部位特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA滑移或其他遞歸突變方法、嵌合建構(gòu)或其任何組合產(chǎn)生。其他突變可在例如反密碼子環(huán)、接納^(acceptor stem)、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TWC臂或環(huán)的tRNA的所要環(huán)或區(qū)域、tRNA分子的其他區(qū)域或其組合中的例如非保守位置或保守位置、隨機(jī)化位置或其組合的特定位置上引入。突變可以包括在莖區(qū)中的匹配堿基對(duì)。通常，0-tRNA通過使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)受負(fù)性選擇而獲得，其中細(xì)胞包含多個(gè)可能的0-tRNA的成員。負(fù)性選擇消除包含多個(gè)可能的0-tRNA的成員的細(xì)胞,所述0-tRNA通過對(duì)細(xì)胞來說為內(nèi)源性的氨?；?tRNA合成酶(RS)氨基酰化。所述負(fù)性選擇提供與第一物種的細(xì)胞正交的tRNA的集合。在負(fù)性選擇的某些實(shí)施例中，將選擇密碼子引入多核苷酸中，所述多核苷酸編碼負(fù)性選擇標(biāo)記物，例如給與抗生素抗性的酶，例如￠-內(nèi)酰胺酶；給與可檢測(cè)產(chǎn)物的酶，例如3半乳糖苷酶；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)，例如在非基本位置處的毒性產(chǎn)物，諸如barnase ;等。篩選/選擇可通過在選擇劑(例如,抗生素,諸如氨節(jié)青霉素(ampicillin))存在下，使細(xì)胞群體生長(zhǎng)來進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇劑的濃度是變化的。舉例而言，為測(cè)量抑制基因tRNA的活性，使用基于例如無義密碼子的選擇密碼子的活體內(nèi)抑制，或引入編碼例如￠-內(nèi)酰胺酶(bla)的基因的負(fù)性選擇標(biāo)記物的多核苷酸中的移碼突變的選擇系統(tǒng)。舉例而言，建構(gòu)在某個(gè)位置上具有(例如)TAG、AGGA和TGA的多核苷酸變體，例如bla變體。例如細(xì)菌的細(xì)胞經(jīng)所述多核苷酸轉(zhuǎn)形。在不能通過內(nèi)源性大腸桿菌合成酶有效地裝填的正交tRNA的情況下，例如氨芐青霉素抗性的抗生素抗性應(yīng)約為或小于不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)形的細(xì)菌的抗生素抗性。如果tRNA是非正交的，或如果能夠裝填tRNA的異源性合成酶在系統(tǒng)中被共表達(dá)，那么觀察到高水平的例如氨芐青霉素的抗生素的抗性。選擇在抗生素濃度約等于不經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)形的細(xì)胞的LB瓊脂培養(yǎng)盤上不能生長(zhǎng)的細(xì)胞，例如細(xì)菌。在毒性產(chǎn)物(例如核糖核酸酶barnase)的情況下，當(dāng)多個(gè)可能的tRNA的成員通過 例如大腸桿菌合成酶的內(nèi)源性宿主氨基?；?也就是說，其不與例如大腸桿菌合成酶的宿主正交)時(shí)，選擇密碼子被抑制并且所產(chǎn)生的毒性多核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。懷有正交tRNA或無功能的tRNA的細(xì)胞存活。在一個(gè)實(shí)施例中，隨后使與所要生物體正交的tRNA的集合經(jīng)受正性選擇，其中將選擇密碼子放置在(例如)通過諸如P-內(nèi)酰胺酶基因的耐藥性基因編碼的正性選擇標(biāo)記物中。正性選擇是在包含編碼或包含tRNA的集合的成員的多核苷酸、編碼正性選擇標(biāo)記物的多核苷酸和編碼同源RS的多核苷酸的細(xì)胞上執(zhí)行。所述多核苷酸在細(xì)胞中表達(dá)并且細(xì)胞在例如氨芐青霉素的選擇劑存在下生長(zhǎng)。然后，就響應(yīng)所述選擇密碼子tRNA通過共表達(dá)的同源合成酶氨基?；哪芰筒迦氚被岬哪芰磉x擇tRNA。通常，與懷有無功能的tRNA或不能由所關(guān)注的合成酶有效識(shí)別出的tRNA的細(xì)胞相比，所述細(xì)胞展示抑制效率的增強(qiáng)。懷有無功能tRNA或通過所關(guān)注的合成酶不有效識(shí)別出的tRNA的細(xì)胞對(duì)抗生素敏感。因此，(i )不為內(nèi)源性宿主(例如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii )可通過所關(guān)注的合成酶氨基?；痡P(iii)在轉(zhuǎn)譯中起作用的tRNA在兩種選擇中存活。
上述方法中選擇(例如正性選擇、負(fù)性選擇或正性和負(fù)性選擇)的嚴(yán)格性視需要可以變化。舉例而言，因?yàn)閎arnase是極具毒性的蛋白質(zhì)，所以負(fù)性選擇的嚴(yán)格性可通過將不同數(shù)量的選擇密碼子引入barnase基因中和/或通過使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子而控制。在另一個(gè)實(shí)例中，選擇或篩選劑(例如氨芐青霉素)的濃度是變化的。在一個(gè)方面中，因?yàn)樵谠缙谘h(huán)期間，所要活性可為低的，所以嚴(yán)格性是變化的。因此，在早期循環(huán)中應(yīng)用較低嚴(yán)格性的選擇準(zhǔn)則并且在選擇的后期循環(huán)中應(yīng)用更嚴(yán)格的準(zhǔn)則。在某些實(shí)施例中，負(fù)性選擇、正性選擇或負(fù)性和正性選擇可重復(fù)多次?？墒褂枚喾N不同的負(fù)性選擇標(biāo)記物、正性選擇標(biāo)記物或負(fù)性和正性選擇標(biāo)記物。在某些實(shí)施例中，正性和負(fù)性選擇標(biāo)記物可為相同的。其他類型的選擇/篩選可用于本發(fā)明以生產(chǎn)例如0-tRNA、O-RS和0-tRNA/O-RS對(duì)的正交轉(zhuǎn)譯組分。舉例而言，負(fù)性選擇標(biāo)記物、正性選擇標(biāo)記物或正性和負(fù)性選擇標(biāo)記物可包括發(fā)熒光或在適合的反應(yīng)物存在下催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記物。在另一個(gè)實(shí) 施例中，標(biāo)記物的產(chǎn)物通過突光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過發(fā)光來檢測(cè)。視需要,標(biāo)記物包括基于親和力的篩選標(biāo)記物。參見，F(xiàn)rancisco, J. A.等人，(1993)Production andfluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functionalantibody fragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci USA. 90:10444-8。生產(chǎn)重組正交tRNA的其他方法可見于(例如)標(biāo)題為“Methods and Compositionsfor the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs，，的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126，931 和標(biāo)題為 “In vivo Incorporation of UnnaturalAmino Acids” 的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126，127，和標(biāo)題為 “EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE” 的 USSN10/825, 867 中。又參見 Forster 等人，(2003)Programmingpeptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS100 (11):6353-6357 ；和 Feng 等人，(2003)，Expanding tRNA recognition of a tRNAsynthetase by a single amino acid chanRe, PNAS100(10):5676-5681。tRNA可以通過包括(但不限于)化學(xué)氨基?；蛎复侔被；娜魏畏椒ɑ蚣夹g(shù)用所要氨基酸氨基?；０被；梢酝ㄟ^氨?；鵷RNA合成酶或通過包括(但不限于)核糖酶的其他酶促分子完成。術(shù)語“核糖酶”可與“催化性RNA”互換。Cech和同事(Cech，1987, Science, 236:1532-1539 ；McCorkle 等人，1987, Concepts Biochem. 64:221-226)證明可擔(dān)當(dāng)催化劑(核糖酶)的天然存在的RNA的存在。然而，盡管已經(jīng)展示所述天然RNA觸媒僅對(duì)用于裂解和剪接的核糖核酸底物起作用，但是核糖酶的人工進(jìn)化的近期發(fā)展已經(jīng)將催化作用的清單擴(kuò)展到各種化學(xué)反應(yīng)。研究已經(jīng)鑒別可在其自身(2’)3’-末端上催化氨?；?RNA鍵的RNA分子(Illangakekare等人，1995Science 267:643-647)和可將氛基酸從一個(gè)RNA分子轉(zhuǎn)移到另一個(gè) RNA 分子的 RNA 分子(Lohse 等人，1996, Nature381:442-444)。以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利申請(qǐng)公開案2003/0228593，描述建構(gòu)核糖酶的方法和其在用天然編碼的和非天然編碼的氨基酸氨基?；痶RNA中的用途。包括(但不限于)核糖酶的可氨基?；痶RNA的酶促分子的底物固定形式，可以使經(jīng)氨基?；漠a(chǎn)物能夠有效親和力純化。適合底物的實(shí)例包括瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。用于氨基?；暮颂敲傅牡孜锕潭ㄐ问降纳a(chǎn)和用途描述于Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084和美國(guó)專利申請(qǐng)公開案2003/0228593中，其都以引用的方式并入本文中。
化學(xué)氨基酰化方法包括(但不限于)由Hecht和同事(Hecht，S. M. Acc.Chem. Res. 1992，25，545 ;Heckler，T. G. ; Roesser, J. R. ; Xu，C. ; Chang, P. ; Hecht, S.M. Biochemistry 1988, 27，7254 ;Hecht，S. M. ; Alford, B. L. ; Kuroda, Y. ; Kitano, S.J. Biol. Chem. 1978，253，4517)和由 Schultz、Chamberlin、Dougherty 和其他人(Cornish, V. W. ;Mendel, D. ; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995，34，621 ；Robertson, S. A. ;Ellman, J. A. ; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991，113，2722 ；Noren, C.J. ; Anthony-Cahi 11, S. J. ; Griff ith，M. C. ; Schultz, P. G. Science 1989，244，182 ;Bain，J.D. ; Glabe, C. G. ; Dixj T. A. ; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989，111，8013 ;Bain，J.D 等人 Nature 1992，356，537 ；Gallivan, J. P. ; Lester, H. A. ;Dougherty, D. A. Chem.Biol. 1997，4，740 ;Turcatti 等人，J. Biol. Chem. 1996，271，19991 ；Nowak, M. W.等人，Science, 1995，268，439 ;Saks，M. E.等人 J. Biol. Chem. 1996，271，23169 ;Hohsaka，T.等人J. Am. Chem. Soc. 1999，121，34)所介紹的避免在氨基?；惺褂煤铣擅傅姆椒āＫ龇椒ɑ蚱渌瘜W(xué)氨基?；椒捎靡园被；痶RNA分子。

使用經(jīng)化學(xué)修飾的氨?；?tRNA的生物合成方法已經(jīng)用以將若干生物物理學(xué)探 針活體外并入所合成的蛋白質(zhì)中。參見以下公開案和其中引用的參考文獻(xiàn)Biamner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu. Rev Biochem，62:483-514(1993)；和Krieg，IL C.，Walter，P.，Hohnson，A. E. Photocrosslinking of the signal sequence ofnascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognitionparticle, Proc. Natl. Acad. Sci. 83 (22) : 8604-8608 (1986)。以前，已經(jīng)展示，非天然氨基酸可通過將經(jīng)化學(xué)氨基?；囊种苹騮RNA添加到用含有所要琥珀無義突變的基因程式化的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中而在部位特異地活體外并入蛋白質(zhì)中。使用所述方法，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可用封閉結(jié)構(gòu)的同源物取代大量常見的20種氨基酸，例如，氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸，使用營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株取代具體的氨基酸。參見(例如)，Noren, C. J.，Anthony-Cahi 11，Griffith, M. C.，Schultz, P. G. A generalmethod for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244:182-188 (1989) M. ff. Nowak 等人，Science 268:439-42 (1995) ;Bain，J.D.，Glabe，C. G.，Dixj T. A.，Chamberlin, A. R.，Diala，E. S. Biosynthetic site-specificIncorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J. Am ChemSoc, 111:8013-8014(1989) ；N. Budisa 等人，F(xiàn)ASEB J. 13:41-51 (1999) ;Ellman，J. A.，Mendel, D.，Anthony-Cahi 11, S.，Noren, C. J.，Schultz, P. G. Biosynthetic method forintroducing unnatural amino acidssite-specificalIy into proteins. Methodsin Enz.，第 202 卷，301-336(1992)；和 Mendel，D.，Cornish，V. W.和 Schultz，P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct. 24，435-62(1995)0舉例而言，制備識(shí)別終止密碼子UAG的抑制基因tRNA并且用非天然氨基酸將其化學(xué)氨基酰化。慣用的定位突變用以在蛋白質(zhì)基因中的所關(guān)注的部位引入終止密石馬子 TAG0 參見(例如)，Sayers, J. R.，Schmidt, W. Eckstein, F. 5，-3，Exonucleases inphosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic AcidsRes. 16(3) :791-802(1988)。當(dāng)經(jīng)?；囊种苹騮RNA和突變基因在活體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)中組合時(shí)，響應(yīng)UAG密碼子將非天然氨基酸并入，得到在規(guī)定位置上含有那個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。使用[3H]_Phe的實(shí)驗(yàn)和用a-羧酸的實(shí)驗(yàn)證明，僅僅所要氨基酸在規(guī)定的位置上通過UAG密碼子并入，并且所述氨基酸未在蛋白質(zhì)中的任何其他部位并入。參見(例如)，Noren 等人，同上；Kobayashi 等人，(2003) Nature Structural Biology 10 (6) : 425-432 ；和 Ellman,J.A.，Mendel, D.，Schultz, P. G. Site-specific incorporation of novelbackbone structures into proteins, Science, 255 (5041) : 197-200 (1992)。
用于產(chǎn)生催化性RNA的方法可以涉及產(chǎn)生隨機(jī)化的核糖酶序列的分離池、對(duì)池執(zhí)行定位進(jìn)化、為所需氨基?；钚远Y選池和選擇顯示所要氨基酰化活性的所述核糖酶的序列。核糖酶可包含有利于?；钚缘幕?或區(qū)域，諸如GGU基元和U富集區(qū)域。舉例而言，已經(jīng)報(bào)道U富集區(qū)域可促進(jìn)氨基酸底物的識(shí)別，并且GGU-基元可與tRNA的3’末端形成堿基對(duì)。在組合時(shí)，GGU和基元和U富集區(qū)域同時(shí)促進(jìn)氨基酸和tRNA的同時(shí)識(shí)別，并且進(jìn)而促進(jìn)tRNA的3’末端的氨基?；?。核糖酶可通過使用與tRNAAsnera結(jié)合的部分隨機(jī)化的r24mini進(jìn)行活體外選擇，接著通過見于活性無性系中的一致序列的系統(tǒng)工程化而產(chǎn)生。通過所述方法獲得的示范性核糖酶被稱為“Fx3核糖酶”并且描述于美國(guó)公開申請(qǐng)案第2003/0228593號(hào)中，所述專利的內(nèi)容是以引用的方式并入本文中，所述核糖酶擔(dān)當(dāng)多用途催化劑用于合成經(jīng)同源非天然氨基酸裝填的各種氨?；?tRNA。底物上的固定可用以促成經(jīng)氨基?；膖RNA的有效親和力純化。適合的底物的實(shí)例包括(但不限于)瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁性珠粒。核糖酶可通過利用RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)固定于樹脂上，諸如RNA的核糖上的3’ -順式二醇可經(jīng)高碘酸鹽氧化以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的二醛以促進(jìn)RNA在樹脂上的固定?？墒褂冒畠r(jià)酰肼樹脂的各種類型的樹脂，其中還原性胺化作用使樹脂與核糖酶之間的相互作用成為不可逆的鍵。氨酰基-tRNA的合成可通過所述管柱上氨基?；夹g(shù)而顯著地促進(jìn)。Kouroukl i s等人Methods 2005; 36:239-4描述基于管柱的氨基酰化系統(tǒng)。經(jīng)氨基?；膖RNA的分離可以各種方式完成。一種適合的方法是，從具有諸如含有IOmM EDTA的乙酸鈉溶液的緩沖液、含有50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -(3-丙烷磺酸)、pH 7. 0的12. 5mM KClUOmM EDTA的緩沖液或僅為經(jīng)EDTA緩沖的水(pH 7. 0)的管柱洗提經(jīng)氨基酰化的tRNA。可將經(jīng)氨基?；膖RNA添加到轉(zhuǎn)譯反應(yīng)中，以便并入氨基酸，在通過轉(zhuǎn)譯反應(yīng)制得的多肽中的特別位置上，tRNA被所述氨基酸氨基?；？梢允褂媒?jīng)氨基?；膖RNA的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)的實(shí)例，包括(但不限于)細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物提供為從輸入mRNA活體外轉(zhuǎn)譯多肽所必需的反應(yīng)組分。所述反應(yīng)組分的實(shí)例包括(但不限于)核糖體蛋白、rRNA、氨基酸、tRNA、GTP、ATP、轉(zhuǎn)譯起始因子和延伸因子和與轉(zhuǎn)譯相關(guān)的其他因子。另外，轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)可以是分批轉(zhuǎn)譯或隔開轉(zhuǎn)譯。分批轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)在單一隔室中組合反應(yīng)組分，而隔開轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)使轉(zhuǎn)譯反應(yīng)組分與可抑制轉(zhuǎn)譯效率的反應(yīng)產(chǎn)物分離。所述轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)是市售的。另外，可以使用偶合轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。偶合轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)允許將輸入的DNA轉(zhuǎn)錄成對(duì)應(yīng)的mRNA,而mRNA又被反應(yīng)組分轉(zhuǎn)譯。市售偶合轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯的實(shí)例是RapidTranslation System (RTS, Roche Inc.)。系統(tǒng)包括含有用于提供諸如核糖體的轉(zhuǎn)譯組分的大腸桿菌溶胞產(chǎn)物和轉(zhuǎn)譯因子的混合物。另外，包括RNA聚合酶用于將輸入DNA轉(zhuǎn)錄成適用于轉(zhuǎn)譯的mRNA模板。RTS可通過插入反應(yīng)隔室(包括供應(yīng)/消耗隔室和轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯隔室)之間的膜使反應(yīng)組分隔開。tRNA的氨基?；梢酝ㄟ^包括(但不限于)移轉(zhuǎn)酶、聚合酶、催化性抗體、多官能蛋白質(zhì)，諸如此類的其他試劑執(zhí)行。if奪氡酰某-tRNA合成酶(0-RS)本發(fā)明的O-RS優(yōu)先地用所選氨基酸在活體外或活體內(nèi)氨基?；?-tRNA。本發(fā)明的O-RS可通過包括O-RS的多肽和/或通過編碼O-RS或其部分的多核苷酸而提供到轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)(例如，活體外轉(zhuǎn)譯組分或細(xì)胞)中。舉例而言，O-RS或其部分通過如SEQ IDN0. :4中所述的多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列或其保守變化編碼。本發(fā)明的O-RS可以氨基?；罅坎煌?-tRNA分子，包括(但不限于)本文中揭示的所述0-tRNA分子。
用于鑒別供0-tRNA (例如0-tRNA)使用的正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)(例如O-RS)的方法也是本發(fā)明的特征。舉例而言，方法包括使第一物種的細(xì)胞群體經(jīng)受正性選擇，其中所述細(xì)胞各自包含I)多個(gè)氨?；?tRNA合成酶(RS)的成員，其中多個(gè)RS包含突變體RS、由不同于第一物種的物種得到的RS或突變體RS和由不同于第一物種的物種得到的RS兩者；2)來自第二物種的正交tRNA (0-tRNA);和3)編碼正性選擇標(biāo)記物并且包含至少一個(gè)選擇密碼子的多核苷酸。對(duì)于與缺乏多個(gè)RS的成員或具有降低量的多個(gè)RS的成員的細(xì)胞相比，展示抑制效率增強(qiáng)的所述細(xì)胞來選擇或篩選細(xì)胞。具有抑制效率增強(qiáng)的細(xì)胞包含氨基酰化0-tRNA的活性RS。將來自第一物種的第一組tRNA的通過活性RS氨基?；?活體外或活體內(nèi))的水平，與來自第二物種的第二組tRNA的通過活性RS氨基?；?活體外或活體內(nèi))的水平相比較。氨基?；乃娇赏ㄟ^可檢測(cè)物質(zhì)(例如，經(jīng)標(biāo)記的氨基酸或非天然氨基酸)測(cè)定。選擇與第一組tRNA相比，更有效地氨基?；诙MtRNA的活性RS，進(jìn)而提供供0-tRNA使用的正交氨酰基-tRNA合成酶。通過所述方法鑒別的例如O-RS的O-RS也是本發(fā)明的特征?？墒褂么罅繖z定中的任何檢定來測(cè)定氨基?；Ｋ鰴z定可在活體外或活體內(nèi)執(zhí)行。舉例而言，活體外氨基?；瘷z定描述于(例如)Hoben, P.和Soil, D. (1985)MethodsEnzymoI. 113:55-59和美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第2003/0228593號(hào)中。氨基?；部赏ㄟ^使用報(bào)告基因以及正交轉(zhuǎn)譯組分，并且檢測(cè)在細(xì)胞中表達(dá)包含至少一個(gè)編碼蛋白質(zhì)的選擇密碼子的多核苷酸的報(bào)告基因而測(cè)定。又參見，標(biāo)題為“IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURALAMINO ACIDS” 的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126,927 和標(biāo)題為 “EXPANDING THE EUKARYOTICGENETIC CODE” 的 USSN 10/825,867。經(jīng)鑒別的O-RS可另外經(jīng)操縱以改變合成酶的底物特異性以便僅所要非天然氨基酸，而不是常見20種氨基酸的任何氨基酸被裝填到0-tRNA中。產(chǎn)生對(duì)非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨?；鵷RNA合成酶的方法包括，使合成酶(例如)在合成酶中的活性部位、在合成酶中的編輯機(jī)制部位、在通過組合合成酶的不同域的不同部位等處突變，和應(yīng)用選擇處理。使用基于正性選擇接著負(fù)性選擇的組合的策略。在正性選擇中，在正性標(biāo)記物的非基本位置引入的選擇密碼子的抑制作用使細(xì)胞在正性選擇壓力下存活。在天然氨基酸和非天然氨基酸存在下，存活者因此編碼用天然氨基酸或非天然氨基酸裝填正交抑制基因tRNA的活性合成酶。在負(fù)性選擇中，在負(fù)性標(biāo)記物的非基本位置引入的選擇密碼子的抑制作用除去具有天然氨基酸特異性的合成酶。負(fù)性和正性選擇的存活者編碼僅用非天然氨基酸氨基酰化(裝填)正交抑制基因tRNA的合成酶。所述合成酶可隨后經(jīng)受例如DNA滑移或其他遞歸突變方法的其他突變。突變體O-RS的庫可使用所屬領(lǐng)域中已知的各種突變技術(shù)產(chǎn)生。舉例而言，突變體RS可通過部位特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA滑移或其他遞歸突變方法、嵌合建構(gòu)或其任何組合產(chǎn)生。舉例而言，突變體RS的庫可由兩個(gè)或兩個(gè)以上的其他(例如更小、較少變化)的“子庫”產(chǎn)生。RS的嵌合庫也包括在本發(fā)明中。應(yīng)注意，來自各種生物體(例如，諸如真細(xì)菌或太古細(xì)菌的微生物)的tRNA合成酶的庫，諸如包含天然多樣性的庫(參見(例如),Short等人的美國(guó)專利第6，238, 884號(hào)；Schallenberger等人的美國(guó)專利第5，756, 316號(hào)；Petersen等人的美國(guó)專利第5，783，431號(hào)！Thompson等人的美國(guó)專利第5，824，485號(hào)；Short等人的美國(guó)專利第5，958，672號(hào))視需要經(jīng)建構(gòu)且對(duì)于正交對(duì)篩選。一旦合成酶經(jīng)受正性和負(fù)性選擇/篩選策略，所述合成酶就可隨后經(jīng)受進(jìn)一步突變。舉例而言，可分離編碼O-RS的核酸；可由所述核酸產(chǎn)生一組編碼經(jīng)突變的0-RS(例如，通過隨機(jī)突變、部位特異性突變、重組或其任何組合)的多核苷酸；并且，可重復(fù)所述單獨(dú)步 驟或所述步驟的組合直到獲得用非天然氨基酸優(yōu)先氨基酰化0-tRNA的經(jīng)突變的0-RS。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，將所述步驟執(zhí)行多次，例如至少2次。其他水平的選擇/篩選嚴(yán)格性也可用于本發(fā)明的方法中，以生產(chǎn)0-tRNA、O-RS或其對(duì)。選擇或篩選嚴(yán)格性可在用以生產(chǎn)O-RS的方法的一個(gè)或兩個(gè)步驟中變化。其可包括(例如)改變所使用的選擇/篩選劑的量等。也可執(zhí)行正性和/或負(fù)性選擇的其他循環(huán)。選擇或篩選也可包含一次或多次包括(例如)氨基酸通透性的改變、轉(zhuǎn)譯效率的改變、轉(zhuǎn)譯保真度的改變等的正性或負(fù)性選擇或篩選。通常，所述一種或一種以上改變是基于其中使用正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生物體中的一個(gè)或一個(gè)以上基因的突變。其他類型的選擇可用于本發(fā)明中，以用于(例如)O-RS、0-tRNA和0_tRNA/0_RS對(duì)。正性選擇標(biāo)記物可為包括(但不限于)為生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的產(chǎn)物的各種分子中的任何分子，并且選擇是在缺乏營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的培養(yǎng)基上執(zhí)行。編碼正性選擇標(biāo)記物的多核苷酸的實(shí)例包括(但不限于)(例如)基于補(bǔ)充細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺陷氨基酸的報(bào)告基因、his3基因(例如，其中通過提供3-氨基三唑(3-AT)所檢測(cè)，his3基因編碼咪唑磷酸甘油脫水酶)、ura3基因、leu2基因、lys2基因、IacZ基因、adh基因等。參見(例如)，G. M. Kishore和 D. M. Shah, (1988), Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides, AnnualReview of Biochemistry 57:627-663。在一個(gè)實(shí)施例中，IacZ生產(chǎn)是通過鄰硝基苯基-0-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)水解作用檢測(cè)。參見(例如)，I.G. Serebriiskii和 E.A.Golemis, (2000), Uses of IacZ to study gene function: evaluation ofbeta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system, AnalyticalBiochemistry 285:1-15。其他正性選擇標(biāo)記物包括(例如)熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)(例如GAL4)等。視需要，編碼正性選擇標(biāo)記物的多核苷酸包含選擇密碼子。編碼正性選擇標(biāo)記物的多核苷酸可操作性地與反應(yīng)元素連接。也可存在編碼調(diào)節(jié)從反應(yīng)元素的轉(zhuǎn)錄并且包含至少一個(gè)選擇密碼子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。通過經(jīng)非天然氨基酸氨基?；?-tRNA將非天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)中，產(chǎn)生編碼正性選擇標(biāo)記物的多核苷酸(例如報(bào)告基因)的轉(zhuǎn)錄。視需要，選擇密碼子位于或大體上靠近編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合域的多核苷酸的一部分。編碼負(fù)性選擇標(biāo)記物的多核苷酸也可操作性地與反應(yīng)元素連接，從所述反應(yīng)元素的轉(zhuǎn)錄是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)介導(dǎo)。參見(例如)，A. J. DeMaggio等人，(2000)，The yeastsplit-hybrid system, Method Enzymol. 328:128-137 ;H. M. Shih等人，(1996)，A positivegenetic selection for disrupting protein-protein interactions: identificationof CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP,Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 93:13896-13901 ；M. Vidal 等人，(1996)，Genetic characterizationof a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reversetwo-hybrid system，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321—10326 ;和 M. Vidal 等人，(1996)，Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociationof protein-protein and DNA-protein interactions (Proc.Natl. Acad. Sci.U. S. A. 93:10315-10320)。通過經(jīng)天然氨基酸氨基?；?-tRNA將天然氨基酸并入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)中，產(chǎn)生負(fù)性選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄。視需要，負(fù)性選擇標(biāo)記物包含選擇密碼子。本 發(fā)明的正性選擇標(biāo)記物和/或負(fù)性選擇標(biāo)記物可包含至少兩個(gè)選擇密碼子，其各自或兩者可包含至少兩個(gè)不同的選擇密碼子或至少兩個(gè)相同的選擇密碼子。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)是(直接地或間接地)與核酸序列(例如反應(yīng)元件)結(jié)合的分子，并且調(diào)節(jié)操作性地與反應(yīng)元素連接的序列的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)可為轉(zhuǎn)錄活化劑蛋白質(zhì)(例如，GAL4、核激素受體、API、CREB. LEF/tcf家族成員、SMAD、VP16、SPl等)，轉(zhuǎn)錄阻遏物蛋白質(zhì)(例如，核激素受體、Groucho/tle家族、中鋸齒家族(Engrailed €&111；[17)等)，或視環(huán)境而定具有兩種活性的蛋白質(zhì)(例如，LEF/tcf、同盒蛋白質(zhì)(homobox protein)等)。反應(yīng)元素通常是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)識(shí)別的核酸序列或起與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)一致的作用的其他試劑。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)的另一個(gè)實(shí)例是轉(zhuǎn)錄活化劑蛋白質(zhì)，GAL4。參見(例如)，A. Laughon 等人，(1984),Identification of two proteins encoded by theSaccharomyces cerevisiae GAL4 gene, Molecular&Cellular Biology 4:268—275 ；A. Laughon 和 R. F. Gesteland，(1984)，Primary structure of the Saccharomycescerevisiae GAL4gene，Molecular&Cellular Biology 4:260-267 ；L. Keegan 等人，(1986)，Separation of DNA binding from the transcription-activating functionof a eukaryotic regulatory protein, Science 231:699-704;和M. Ptashne，(1988), Howeukaryotic transcriptional activators work,Nature 335:683-689。 所述 881 氨基酸蛋白質(zhì)的N-末端147氨基酸形成特異性結(jié)合DNA序列的DNA結(jié)合域(DBD)。參見(例如)，M. Carey 等人，(1989)，An amino-terminal fragment of GAL4 binds DNAas a dimer, J. Mol. Biol. 209:423-432 ；和 E. Giniger 等人，(1985)，Specific DNAbinding of GAL4，a positive regulatory protein of yeast, Cell 40:767—774。DBD是通過插入蛋白質(zhì)序列與當(dāng)與DNA結(jié)合時(shí)可活化轉(zhuǎn)錄的C-末端113氨基酸活化域(AD)連接。參見(例如)，J.Ma 和 M. Ptashnej (1987)，Deletion analysis of GAL4defines two transcriptional activating segments, Cell 48:847—853;和 J. Ma 和M.Ptashne, (1987)，The carboxy-terminal 30amino acids of GAL4 are recognized byGAL80，Cell 50:137-142。通過將琥珀密碼子朝向(例如)含有GAL4的N-末端DBD和其C-末端AD的單一多肽的N-末端DBD放置，通過O-tRNA/O-RS對(duì)的琥珀抑制作用可與通過GAL4的轉(zhuǎn)錄活化聯(lián)系。經(jīng)GAL4活化的報(bào)告基因可用以執(zhí)行使用基因的正性和負(fù)性選擇。用于負(fù)性選擇的培養(yǎng)基可包含通過負(fù)性選擇標(biāo)記物轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)物質(zhì)的選擇或篩選劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，可檢測(cè)物質(zhì)是毒性物質(zhì)。編碼負(fù)性選擇標(biāo)記物的多核苷酸可為(例如)ura3基因。舉例而言，URA3報(bào)告基因可在含有GAL4DNA結(jié)合部位的啟動(dòng)子控制下放置。當(dāng)負(fù)性選擇標(biāo)記物(例如)通過編碼具有選擇密碼子的GAL4的多核苷酸的轉(zhuǎn)譯而生產(chǎn)時(shí)，GAL4活化URA3的轉(zhuǎn)錄。負(fù)性選擇是在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基上完成，所述5-氟乳清酸通過ura3基因的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)物質(zhì)(例如殺死細(xì)胞的毒性物質(zhì))。參見(例如)，J. D. Boeke 等人，(1984), A positive selection for mutants lackingorotidine-S' -phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluoroorotic acid resistance, Molecular&General Genetics 197:345-346) ;M. Vidal 等人，(1996)，Geneticcharacterization of a mammalian protein-protein interaction domain by usinga yeast reverse two-hybrid system. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326 ；和 M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detectdissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. , Proc. Natl. Acad.Sci.U. S. A. 93:10315-10320。與正性選擇標(biāo)記物一樣，負(fù)性選擇標(biāo)記物也可為各種分子中的任何分子。正性選擇標(biāo)記物和/或負(fù)性選擇標(biāo)記物可以是發(fā)熒光或在適合的反應(yīng)物存在下催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。舉例而言，負(fù)性選擇標(biāo)記物包括(但不限于)(例如)熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)、YFP、EGFP, RFP、抗生素抗性基因的產(chǎn)物(例如，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT))、IacZ基因的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑蛋白質(zhì)等。正性選擇標(biāo)記物和/或負(fù)性選擇標(biāo)記物可以通過熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)或通過發(fā)光來檢測(cè)。正性選擇標(biāo)記物和/或負(fù)性選擇標(biāo)記物可以包含基于親和力的篩選標(biāo)記物。相同多核苷酸可編碼正性選擇標(biāo)記物和負(fù)性選擇標(biāo)記物。舉例而言，正性選擇步驟、負(fù)性選擇步驟或正性和負(fù)性選擇步驟可包括使用報(bào)告基因，其中報(bào)告基因是通過熒光活化細(xì)胞揀選(FACS)檢測(cè)。舉例而言，正性選擇可先用例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的正性選擇標(biāo)記物進(jìn)行，其中CAT基因包含在CAT基因中的例如琥珀終止密碼子的選擇密碼子，接著進(jìn)行負(fù)性選擇篩選，其是基于在例如I7RNA聚合酶基因的負(fù)性標(biāo)記物中的位置上不能抑制(例如)兩個(gè)或兩個(gè)以上的選擇密碼子來進(jìn)行。正性選擇標(biāo)記物和負(fù)性選擇標(biāo)記物可在例如質(zhì)粒的相同載體上見到。負(fù)性標(biāo)記物的表達(dá)驅(qū)動(dòng)例如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的報(bào)告基因的表達(dá)。選擇和篩選的嚴(yán)格性可以變化，例如，使報(bào)告基因發(fā)熒光所需要的光的強(qiáng)度可以變化。正性選擇可用報(bào)告基因作為正性選擇標(biāo)記物來進(jìn)行，所述報(bào)告基因是通過FACS篩選，接著進(jìn)行負(fù)性選擇篩選，其是基于在例如barnase基因的負(fù)性標(biāo)記物中的位置上不能抑制(例如)兩個(gè)或兩個(gè)以上的選擇密碼子來進(jìn)行。視需要，報(bào)告基因展示在細(xì)胞表面上，例如卩遼菌體展示(phage display)等等上。例如基于OmpA的細(xì)胞-表面展示系統(tǒng)的細(xì)胞-表面展示依靠例如與大腸桿菌細(xì)胞表面上的外膜孔蛋白OmpA融合的脊髓灰白質(zhì)病毒C3肽的具體抗原決定基的表達(dá)。僅當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)信息中的選擇密碼子在轉(zhuǎn)譯期間被抑制時(shí)，抗原決定基才展示在細(xì)胞表面上。然后，所展示的肽含有由庫中的突變體氨?；?tRNA合成酶之一識(shí)別出的氨基酸，并且含有對(duì)應(yīng)合成酶基因的細(xì)胞可用抵抗含有特定非天然氨基酸的肽而產(chǎn)生的抗體來分離?；贠mpA的細(xì)胞-表面展示系統(tǒng)是由Georgiou等人開發(fā)且優(yōu)化以作為噬菌體展示的替換物° 參見，F(xiàn)rancisco, J. A. , Campbell, R. , Iverson, B. L.和 Georgoiu, G. Productionand fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing afunctional antibody fragment on the external surface. Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:10444-8(1993)。本發(fā)明的其他實(shí)施例包括活體外進(jìn)行一個(gè)或一個(gè)以上選擇步驟。例如合成酶和/或tRNA的所選組分可隨后被引入細(xì)胞中以用于活體內(nèi)并入非天然氨基酸。生產(chǎn)O-RS和改變合成酶的底物特異性的其他細(xì)節(jié)可見于標(biāo)題為“Methodsand Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNASynthetase Pairs” 的美國(guó)專利申請(qǐng)案 10/126,931 和標(biāo)題為 “EXPANDING THEEUKARYOTIC GENETIC CODE”的USSN 10/825，867，其是以引用的方式并入本文中。生產(chǎn) O-RS 的其他細(xì)節(jié)可見于 Hamano-Takaku 等人，(2000)A mutant Escherichia coliTyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid AzatyrosineMore Efficiently than Tyrosine, Journal of Biological Chemistry,275(51):40324-40328 ；Kiga 等人，(2002)，An engineered Escherichia colityrosyl-tRNA synthetase for site-specific incorporation of an unnaturalamino acid into proteins in eukaryotic translation and its applicationin a wheat germ cell-free system, PNAS99(15):9715-9723 ;和 Francklyn 等人，(2002), Aminoacyl-tRNA synthetases: Versatile players in the changing theateroftranslation;RNA, 8:1363-1372，各參考文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。來源和宿主牛物體本發(fā)明的轉(zhuǎn)譯組分通常由非真核生物體得到。舉例而言，正交0-tRNA可由例如古細(xì)菌，諸如詹氏甲烷球菌、橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等等的非真核生物體得到，而正交O-RS可由例如橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等；或真細(xì)菌，諸如大腸桿菌、嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等等的非真核生物體得到。在一個(gè)實(shí)施例中，也可使用包括(但不限于)植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等等的真核來源。0-tRNA/0-RS對(duì)的個(gè)別組分可由相同生物體或不同生物體得到。在一個(gè)實(shí)施例中，0-tRNA/0-RS對(duì)是來自相同的生物體?；蛘?，0-tRNA/0-RS對(duì)的0-tRNA和O-RS是來自不同的生物體。舉例而言,0-tRNA可由(例如)鹽桿菌種NRC-I得到，并且O-RS可由(例如)嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌得到。0-tRNA,O-RS或0-tRNA/0-RS對(duì)可經(jīng)活體內(nèi)或活體外選擇或篩選和/或用于例如非真核細(xì)胞(諸如大腸桿菌細(xì)胞)或真核細(xì)胞的細(xì)胞中以生產(chǎn)具有所選氨基酸(例如非天然氨基酸)的多肽。非真核細(xì)胞可來自各種來源，諸如原生種系發(fā)生域，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、橫川病毒、諸如富饒鹽菌和鹽桿菌種NRC-I的鹽桿菌屬、閃爍古生球菌、火球菌、掘越氏熱球菌、嗜熱菌敏捷氣熱菌等等，或可屬于真細(xì)菌種系發(fā)生域，包括(但不限于)大腸桿菌、嗜熱細(xì)菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、熒光極毛桿菌、綠膿桿菌、惡息極毛桿菌等等。真核細(xì)胞可來自各種來源，包括(但不限于)植物(例如，諸如單子葉植物或雙子葉植物的復(fù)雜植物)、藻類、原生生物、真菌、酵母(包括(但不限于)釀酒酵母);動(dòng)物(包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等)等等。具有本發(fā)明的轉(zhuǎn)譯組分的細(xì)胞的組合物也是本發(fā)明的特征。對(duì)在一種物種中篩選用于另一種物種的0-tRNA和/或O-RS來說，又參見，標(biāo)題為“Expandingthe Eukaryotic Genetic Code” 的 USSN 10/825,867。為在宿主細(xì)胞中表達(dá)具有所選氨基酸的所關(guān)注的多肽，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將編碼所關(guān)注的多肽的多核苷酸亞克隆到表達(dá)載體中，該表達(dá)載體含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯終止子和(如果對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的核酸來說)用于轉(zhuǎn)譯起始的核糖體結(jié)合部位的。適合的細(xì)菌啟動(dòng)子在所屬領(lǐng)域中為熟知的并且描述于(例如)Samtoook等人和Ausubel等人中。用于表達(dá)所關(guān)注的多肽的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可在包括(但不限于)大腸桿菌、芽胞桿菌種、熒光極毛桿菌、綠膿桿菌、惡息極毛桿菌和沙門氏菌(沙門氏菌屬)中得到(Palva等人，Gene 22:229-235(1983) ;Mosbach 等人，Nature 302:543-545(1983))。用于所述表達(dá)系統(tǒng) 的試劑盒是市售的。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)在所屬領(lǐng)域中是熟知的并且也是市售的。本發(fā)明的tRNA和/或RS和/或所關(guān)注的多肽可以應(yīng)用于和/或表達(dá)于包括(例如)酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌的許多適合的表達(dá)系統(tǒng)中。示范性表達(dá)系統(tǒng)的描述提供于下文。酵母如本文所使用，術(shù)語“酵母”包括能夠表達(dá)所關(guān)注的多肽的各種酵母中的任何酵母。所述酵母包括(但不限于)產(chǎn)子囊孢子酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、擔(dān)子菌有抱子酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌(芽生菌(Blastomycetes))群組的酵母。產(chǎn)子囊孢子酵母分成2個(gè)科，即蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包含 4 個(gè)亞科，即裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae) (例如，裂殖酵母屬(genus Schizosaccharomyces))> 拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、Lipomycoideae 和 Saccharomycoideae (例如畢赤氏酵母屬(genera Pichia)、克盧費(fèi)氏酵母屬(Kluyveromyces)和酵母菌屬(Saccharomyces))。擔(dān)子菌有孢子酵母包括擔(dān)子菌白冬抱酵母屬(genera Leucosporidium)、紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、線黑粉菌屬(Filobasidium)和香灰擬鎖擔(dān)菌屬(Filobasidiella)。屬于半知菌(芽生菌)群組的酵母分成2個(gè)科，即擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，擲孢酵母屬(genera Sporobolomyces)和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌屬(genus Candida))。供本發(fā)明使用的尤其受關(guān)注的是以下物種中的物種畢赤氏酵母屬、克盧費(fèi)氏酵母屬、酵母菌屬、裂殖酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、球擬酵母屬(Torulopsis)和念珠菌屬，包括(但不限于)巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、P. guiIlerimondii、釀酒酵母、嘉士伯酵母(S. carlsbergensis)、糖化酵母(S. diastaticus)、道格拉斯酵母(S. douglasii)、科魯維爾酵母(S. kluyveri)、諾本斯酵母(S. norbensis)、卵形酵母(S. oviformis)、乳酸克魯維酵母(K. lactis)、乳糖酶酵母(K. fragilis)、白色念珠菌(C. albicans)、麥芽糖假絲酵母(C. maltosa)和漢森酵母(H. polymorpha)。酵母通?？蓮陌?但不限于)以下來源的各種來源購(gòu)得Yeast Genetic Stock Center、Department of Biophysics andMedical Physics,University of California (Berkeley, CA)和 American Type CultureCollection dTCG, (Manassas, VA)0術(shù)語“酵母宿主”或“酵母宿主細(xì)胞”包括可用作或已經(jīng)用作用于重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的接受者的酵母。術(shù)語包括已經(jīng)接受重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的原始酵母宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于意外的或有意的突變，單一親代細(xì)胞的子代可以不必在形態(tài)學(xué)或補(bǔ)充于原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似于有待通過諸如編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列存在的相關(guān)性質(zhì)表征的母體的親代細(xì)胞的子代包括在所述定義所指的子代中。已經(jīng)開發(fā)包括染色體外復(fù)制子或合并載體的表達(dá)和轉(zhuǎn)形載體，用于轉(zhuǎn)形到許多酵母宿主中。舉例而言，已經(jīng)開發(fā)用于釀酒酵母的表達(dá)載體(Sikorski等人，GENETICS(1989) 122:19 ；Ito 等人，J. Bacteeiol. (1983) 153:163 ；Hinnen 等人，Peoc. Natl.Acad. Sci. USA(1978)75:1929);用于白色念珠菌的表達(dá)載體(Kurtz 等人，MOL. CELL. BIOL. (1986)6:142);用于麥芽糖假絲酵母的表達(dá)載體(Kunze等人，J-Basic Miceobiol.(1985)25:141);用于漢森酵母的表達(dá)載體(Gleeson 等人，J. Gen. Miceobiol. (1986) 132:3459 ；Roggenkamp 等人，MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302);用于乳糖酶酵母的表達(dá)載體(Das等人，J. BACTERI0L. (1984) 158:1165);用于乳酸克魯維酵母的表達(dá)載體(DeLouvencourt 等人，J. BACTERI0L. (1983) 154:737 ；Van den Berg 等人，BIOTECHNOLOGY (NY)(1990)8:135);用于 P. guillerimondii 的表達(dá)載體(Kunze 等人，J. BASIC MICROBIOL.(1985)25:141);用于巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體(美國(guó)專利第5，324, 639 ;4，929，555 ；和 4，837，148 號(hào)；Cregg 等人，MOL. CELL. BIOL. (1985)5:3376);用于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的表達(dá)載體(Beach 等人,NATURE (1982) 300:706);和用于解脂耶羅威亞酵母(Y. Iipolytica);構(gòu)巢曲霉(八.nidulans)的表達(dá)載體(Ballance等人，Bloc腿 B刪YS. Res. Commun. (1983) 112:284-89 ；TiIburn 等人，Gene(1983) 26:205-221 ；和Yelton 等人，Peoc- Natl. Acad. Sci. USA(1984)81:1470-74);用于黑霉菌(A. niger)的表達(dá)載體(Kelly 和 Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479);用于里氏木霉(T. reesia)的表達(dá)載體(EP 0 244 234);和用于諸如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)的絲狀真菌的表達(dá)載體(W0 91/00357)，各個(gè)參考文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。酵母載體的控制序列為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知并且包括(但不限于)來自諸如以下基因的基因的啟動(dòng)子區(qū)域醇脫氫酶(ADH) (EP 0 284 044);烯醇酶；葡糖激酶；葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸變位酶；和丙酮酸激酶(PyK) (EP 0 329 203)。編碼酸性磷酸酶的酵母PH05基因也可以提供有效的啟動(dòng)子序列(Miyanohara等人，PROC. NATL. ACAD. SCI.USA(1983)80:1)。供酵母宿主使用的其他適合的啟動(dòng)子序列可以包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BI0L.CHEM. (1980) 255:12073);和其他糖解酶，諸如丙酮酸脫羧酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶(Holland等人，Biochemistry (1978) 17:4900;Hess等人，J. AdvEnzyme Reg. (1969) 7:149)的啟動(dòng)子。具有通過生長(zhǎng)條件來控制的轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點(diǎn)的誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)子，可以包括醇脫氫酶2 ;異細(xì)胞色素C ;酸性磷酸酶；金屬硫蛋白；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與氮代謝相關(guān)的降解酶；和擔(dān)負(fù)麥芽糖和半乳糖應(yīng)用的酶的啟動(dòng)子區(qū)域。適用于酵母表達(dá)的適合的載體和啟動(dòng)子另外描述于EP O 073 657中。酵母強(qiáng)化子也可以與酵母啟動(dòng)子一起使用。另外，合成啟動(dòng)子也可以起酵母啟動(dòng)子的作用。舉例而言，酵母啟動(dòng)子的上游活化序列(UAS)可以與另一酵母啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域接合，產(chǎn)生合成雜交啟動(dòng)子。所述雜交啟動(dòng)子的實(shí)例包括與GAP轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域連接的ADH調(diào)節(jié)序列。參見美國(guó)專利第4，880，734和4，876，197號(hào)，其是以引用的方式并入本文中。雜交啟動(dòng)子的其他實(shí)例所包括的啟動(dòng)子由與諸如GAP或PyK的糖解酶基因的轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域組合的ADH2、GAL4、GAL10或PH05基因的調(diào)節(jié)序列組成。參見EP 0 164 556。此 外，酵母啟動(dòng)子可以包括具有結(jié)合酵母RNA聚合酶并且弓I發(fā)轉(zhuǎn)錄的能力的非酵母源的天然存在的啟動(dòng)子?？梢园糠纸湍副磉_(dá)載體的其他控制元件包括(例如)來自GAPDH或烯醇酶基因的終止子(Holland等人，J.BI0L.CHEM. (1981)256:1385)。另夕卜，來自質(zhì)粒源的復(fù)制源適用于酵母。適用于酵母的適合的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒中的trpl基因。參見，Tschumper 等人，GENE (1980) 10:157 ；Kingsman 等人，GENE (1979) 7:141。trpl 基因提供為沒有能力在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母突變菌株的選擇標(biāo)記物。同樣地，缺Leu2的酵母菌株(ATCC20，622或38，626)是通過帶有Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充。將外原性DNA引入酵母宿主中的方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，并且通常包括(但不限于)用堿性陽離子處理的球形體或完整酵母宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)形。舉例而言，酵母的轉(zhuǎn)形可根據(jù) Hsiao 等人，PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 和 Van Solingen 等人，J.BACT. (1977) 130:946中所述的方法進(jìn)行。然而，諸如通過核注射、電穿孔或原生質(zhì)體融合的用于將DNA引入細(xì)胞中的其他方法，也可以如SAMBR00K等人，MOLE⑶LAR CLONING:ALAB. MANUAL(2001)中的一般描述使用。然后，可以使用為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)培養(yǎng)酵母宿主細(xì)胞。用于在酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的其他方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。通常參見，美國(guó)專利公開案第20020055169號(hào)、美國(guó)專利第6, 361,969 ;6，312，923 ；6，183，985 ;6，083，723 ;6，017，731 ;5，674，706 ;5，629，203 ;5，602，034 ；和 5，089，398號(hào)；美國(guó)再審專利第RE37, 343和RE35, 749號(hào)；PCT公開專利申請(qǐng)案WO 99/078621 ；WO 98/37208 ；和 WO 98/26080 ；歐洲專利申請(qǐng)案 EP 0 946 736 ；EP 0 732 403 ；EP 0 480 480 ；W0 90/10277 ；EP 0 340 986 ；EP 0 329 203 ；EP 0 324 274 ;和 EP 0164 556，所述專利是以引用的方式并入本文中。又參見Gellissen等人，ANTONIEVAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2) :79-93 ；Romanos 等人，YEAST(1992)8(6):423-488 ；Goedde I ,METHODS IN ENZYM0L0GY (1990) 185:3_7，各個(gè)參考文獻(xiàn)是以引用的方式并入本文中。酵母宿主菌株在擴(kuò)增階段期間，使用為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)料分批發(fā)酵方法，在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)。發(fā)酵方法可以由于具體的酵母宿主的碳利用路徑或表達(dá)控制的模式的差異而修改。舉例而言，酵母菌屬酵母宿主的發(fā)酵可需要單一葡萄糖進(jìn)料、復(fù)合氮源(例如酪蛋白水解物)和多次維生素增補(bǔ)。相反，甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母可需要甘油、甲醇和痕量礦物質(zhì)進(jìn)料，但僅需要簡(jiǎn)單的銨(氮)鹽以達(dá)到最佳生長(zhǎng)和表達(dá)。參見(例如)，以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利第5，324，639號(hào)；Elliott等人，J. PROTEINCHEM. (1990)9:95 ;和 Fieschko 等人，BIOTECH. BIOENG. (1987)29:1113。然而，所述發(fā)酵方法可以具有某些獨(dú)立于所用酵母宿主菌株的共同特征。舉例而言，通常為碳的生長(zhǎng)限制營(yíng)養(yǎng)物可在擴(kuò)增階段期間被添加到發(fā)酵罐中以容許最大生長(zhǎng)。另夕卜，發(fā)酵方法通常使用經(jīng)設(shè)計(jì)以含有足夠量的碳、氮、基本鹽、磷和其他微量養(yǎng)分(維生素、痕量礦物質(zhì) 和鹽等)的發(fā)酵培養(yǎng)基。適于供畢赤氏酵母屬使用的發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)例描述于美國(guó)專利第5，324，639和5，231，178號(hào)中，所述專利是以引用的方式并入本文中。經(jīng)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞術(shù)語“昆蟲宿主”或“昆蟲宿主細(xì)胞”指的是可用作或已經(jīng)用作用于重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的接受者的昆蟲。術(shù)語包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)染的原始昆蟲宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于意外的或有意的突變，單一親代細(xì)胞的子代可以不必在形態(tài)學(xué)或補(bǔ)充到原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似于有待通過諸如編碼所關(guān)注的多肽的核苷酸序列存在的相關(guān)性質(zhì)表征的母體的親代細(xì)胞的子代包括在所述定義所指的子代中。用于表達(dá)所關(guān)注的多肽的適合昆蟲細(xì)胞的選擇為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。若干昆蟲物種充分描述于所屬領(lǐng)域中并且是市售的，包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、家蠶(Bombyx mori)、果妮(Drosophila melanogaster)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)。在選擇用于表達(dá)的昆蟲宿主時(shí),適合的宿主可以包括展示具有(尤其)良好分泌能力、低蛋白質(zhì)分解活性和總堅(jiān)固性的所述宿主。昆蟲通?？蓮陌?但不限于)以下來源的各種來源購(gòu)得Insect Genetic Stock Center、Departmentof Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley;CA);和American Type Culture Collection (“ATCC，，)(Manassas, VA)。通常，經(jīng)桿狀病毒感染的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的組分包括轉(zhuǎn)移載體，通常為細(xì)菌質(zhì)粒，其含有桿狀病毒基因組的片段和用于插入待表達(dá)的異源基因的適當(dāng)?shù)南拗菩圆课唬痪哂信c轉(zhuǎn)移載體中的桿狀病毒特異性片段同源的序列的野生型桿狀病毒(其允許異源基因在桿狀病毒基因組中的同源重組);和適當(dāng)?shù)睦ハx宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、挑選溶菌斑、使細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)諸如此類的物質(zhì)、方法和技術(shù)在所屬領(lǐng)域中為已知的并且描述所述技術(shù)的手冊(cè)是可用的。將異源基因插入轉(zhuǎn)移載體中后，載體和野生型病毒基因組被轉(zhuǎn)染到載體和病毒基因組在其中重組的昆蟲宿主細(xì)胞中。表達(dá)經(jīng)包裝的重組病毒并且鑒別和純化重組溶菌斑。用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的物質(zhì)和方法，是以來自(例如)InvitrogenCorp. (Carlsbad, CA)的試劑盒形式市售。所述技術(shù)通常為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知并且全部描述于以引用的方式并入本文的SUMMERS和SMITH, TEXAS AGRI⑶LTURALEXPERIMENT STATION BULLETIN 第 1555 號(hào)(1987)中。又參見，Richardson, 39METH0DS INMOLECULAR BIOLOGY:BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995) ;AUSUBEL 等人，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY16. 9-16. 11(1994) ;KING 和 POSSEE, THE BACULOVIRUSSYSTEM:A LABORATORY ⑶IDE (1992)；和 O’REILLY 等人，BACULOVIRUS EXPRESSIONVECTORS:ALAB0RAT0RY MANUAL(1992)。實(shí)際上，使用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的各種異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。參見(例如)，美國(guó)專利第6，368, 825 ;6，342,216 ;6，338, 846 ;6，261,805 ；6，245，528 ;6，225，060 ;6，183，987 ;6，168，932 ;6，126，944 ;6，096，304 ;6，013，433 ；5，965，393 ；5, 939，285 ；5, 891，676 ；5, 871，986 ；5, 861，279 ；5, 858，368 ；5, 843, 733 ；5，762，939 ；5, 753，220 ；5, 605，827 ；5, 583，023 ；5, 571，709 ；5, 516，657 ；5, 290，686 號(hào)；WO 02/06305 ；W0 01/90390 ；W0 01/27301 ；W0 01/05956 ；W0 00/55345 ；W0 00/20032 ；WO 99/51721 ；W0 99/45130 ；W0 99/31257 ；W0 99/10515 ；W0 99/09193 ；W0 97/26332 ；WO 96/29400 ；W0 96/25496 ；W0 96/06161 ；W0 95/20672 ；W0 93/03173 ；W0 92/16619 ；WO 92/02628 ；W0 92/01801 ；W0 90/14428 ；W0 90/10078 ；W0 90/02566 ；W0 90/02186 ；W090/01556 ；W0 89/01038 ；W0 89/01037 ；W0 88/07082號(hào)，所述專利以引用的方式并入本文中。適用于桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體在所屬領(lǐng)域中為已知的并且包括(例如)由桿狀病毒苜猜丫紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角體病毒(AcNPV)得到的昆蟲表達(dá)和轉(zhuǎn)移載體，其為輔助病毒(helper)獨(dú)立性、病毒表達(dá)載體。由所述系統(tǒng)得到的病毒表達(dá)載體通常使用強(qiáng)病毒性多角體蛋白基因啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)。通常參見，0’Reilly 等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS:A LABORATORY MANUAL(1992)。在將外來基因插入桿狀病毒基因組中之前，通常將包含啟動(dòng)子、引子(如果需要)、所關(guān)注的編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的上述組分裝配成中間錯(cuò)位構(gòu)筑體(轉(zhuǎn)移載體)。常將 中間錯(cuò)位構(gòu)筑體維持在諸如能夠穩(wěn)定維持在諸如細(xì)菌的宿主中的其他染色體元件(例如質(zhì)粒)的復(fù)制子中。復(fù)制子將會(huì)具有復(fù)制系統(tǒng)，因此容許其被維持在用于克隆和擴(kuò)增的適合的宿主中。更明確地說，質(zhì)粒可以含有多角體蛋白多聚腺苷酸化信號(hào)(Miller, Ann. Rev.Microbiol. (1988)42:177)和原核抗氨節(jié)青霉素(amp)基因和用于在大腸桿菌中選擇和繁殖的復(fù)制源。用于將外來基因引入AcNPV中的一種常用轉(zhuǎn)移載體是pAc373。也已經(jīng)設(shè)計(jì)了為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的許多其他載體，包括(例如)pVL985，其將多角體蛋白起始密碼子從ATG改變成ATT，并且在ATT下游的32個(gè)堿基對(duì)處引入BamHI克隆部位。參見，Luckow和 Summers, Virology 170:31(1989)。其他市售載體包括(例如)PBlueBac4. 5/V5_His ；pBlueBacHis2 ；pMelBac ；pBlueBac4. 5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)。在插入異源基因后，將轉(zhuǎn)移載體和野生型桿狀病毒基因組共轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞宿主中。用于將異源DNA引入桿狀病毒病毒中的所要部位中的方法在所屬領(lǐng)域中為已知的。參見，Summers 和 Smith, Texas Ageicultueal Expeeiment Station BulletinJ^J 1555 可(1987) ；Smith ^人，MOL. CELL. BIOL. (1983)3:2156 ; Luckow 和 Summers, Virology (1989) 170:31 舉例而言，插入可為通過同源復(fù)式轉(zhuǎn)線軌道重組，插入到諸如多角體蛋白基因的基因中；插入也可為插入到被工程化成所要桿狀病毒基因的限制性內(nèi)切酶部位中。參見，Miller等人，Bioessays (1989) 11(4):91。轉(zhuǎn)染可以通過電穿孔完成。參見Trotter And Wood, 39Methods inMolecular Biology(1995) ；Mann 和 King, J. Gen. Virol. (1989)70:3501?；蛘?，月旨質(zhì)體可用以轉(zhuǎn)染具有重組表達(dá)載體和桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞。參見(例如)，Liebman等人，Biotechniques(1999)26(1) :36 ；Graves 等人，BIOCHEMISTRY(1998) 37:6050 ；Nomura等人，J. B10L. CHEM. (1998) 273 (22) : 13570 ；SCHMIDT 等人，PROTEIN EXPRESSION ANDPURIFICATION(1998) 12:323 ；Siffert 等人，NATURE GENETICS (1998) 18:45 ;TILKINS 等人，CELLBI0L0GY:A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998) ;CAI 等人，PROTEIN EXPRESS IONANDPURIFICATION(1997) 10:263 ；DOLPHIN 等人，NATURE GENETICS (1997) 17:491 ；Kost 等人，GENE (1997) 190:139 JAKOBSSON 等人，J. BIOL. CHEM. (1996)271:22203 ；Rowles 等人，J. BIOL. CHEM. (1996) 271 (37) : 22376 ；Reverey 等人，J. BIOL. CHEM.(1996) 271 (39) : 23607-10 !Stanley 等人，J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121 ；Sisk 等人，J. Virol. (1994) 68 (2) : 766 ；和 Peng 等人，BIOTECHNIQUES (1993) 14 (2) : 274。市售脂質(zhì)體包括(例如)CeHfectin 和Lipofectin ( Invitrogen, Corp. , Carlsbad, CA)。另夕卜，可以使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染。參見，TROTTER AND WOOD, 39METH0DS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；Kitts, NAR(1990) 18(19) :5667 ;和，Mann 和 King, J. GEN. VIROL. (1989)70:3501。桿狀病毒表達(dá)載體通常含有桿狀病毒啟動(dòng)子。桿狀病毒啟動(dòng)子是任何能夠結(jié)合桿狀病毒RNA聚合酶并且弓I發(fā)將編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(3’)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常位于最接近于編碼序列的5’末端的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域通常包括RNA聚合酶結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起始部位。桿狀病毒啟動(dòng)子也可以具有稱為強(qiáng)化子的第二域，如果存在，那么其通常遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)基因。此外，表達(dá)可為調(diào)節(jié)性或?yàn)闃?gòu)成性的。在感染循環(huán)的后期充分轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因提供尤其有效的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括由編碼病毒多面體蛋白質(zhì)的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus GeneExpression, THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986) ；EP 0 127 839 和 0 155476)和編碼plO蛋白質(zhì)的基因(Vlak等人，J. Gen. Virol. (1988)69:765)得到的序列。將新形成的桿狀病毒表達(dá)載體包裝到感染重組桿狀病毒中并且隨后，可以通過為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的技術(shù)純化已生長(zhǎng)的溶菌斑。參見，Miller等人，Bioessays(1989) 11(4):91 !SUMMERS和 SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATIONBULLETIN 第 1555 號(hào)(1987)。已經(jīng)開發(fā)用于感染到若干昆蟲細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá)載體。舉例而言，已經(jīng)開發(fā)尤其用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125號(hào))、家蠶(ATCC第CRL-8910號(hào))、果蠅(ATCC第1963號(hào))、草地夜蛾和粉蚊夜蛾的重組桿狀病毒。參見，Wright, NATURE (1986)321:718 ；Carbonell 等人，J. VIROL. (1985)56:153 ;Smith 等人，MOL. CELL. BIOL. (1983)3:2156。通常參見，F(xiàn)raser等人，InViteoCELL. DEV. BIOL. (1989)25:225。更明確地說，用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的細(xì)胞系通常包括(但不限于)Sf9 (草地夜蛾)(ATCC第CRL-1711號(hào))、Sf21 (草地夜蛾)(Invitrogen Corp. , Cat.第 11497-013 號(hào)(Carlsbad, CA))、Tri-368 (粉蚊夜蛾)和 High-Five BTI-TN-5B1-4 (粉蚊夜蛾)。用于在桿狀病毒/表達(dá)中直接表達(dá)和融合表達(dá)異源多肽的細(xì)胞和培養(yǎng)基是市售的，并且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)通常為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。大腸桿菌、假單胞菌種和其他原核牛物細(xì)菌表汰技術(shù)為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。多種載體可得到用于細(xì)菌宿主中。載體可以是單拷貝或低或高多拷貝載體。載體可以用于克隆和/或表達(dá)。鑒于關(guān)于載體、許多載體的工業(yè)效用和甚至描述載體和其限制圖和特征的手冊(cè)的豐富的文獻(xiàn)，在此不需要廣泛討論。如所熟知的，載體通常涉及允許選擇的標(biāo)記物，所述標(biāo)記物可以提供細(xì)胞毒性劑抗性、原營(yíng)養(yǎng)或免疫性。常常，存在提供不同特征的多個(gè)標(biāo)記物。細(xì)菌啟動(dòng)子是任何能夠結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶和引發(fā)將編碼序列(例如結(jié)構(gòu)基因)下游(3’)轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列。啟動(dòng)子將具有通常位于最接近于編碼序列的5’末端的轉(zhuǎn)、錄起始區(qū)域。所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域通常包括RNA聚合酶結(jié)合部位和轉(zhuǎn)錄起始部位。細(xì)菌的啟動(dòng)子也可以具有稱為操縱子的第二域，其可以重疊RNA合成開始處的鄰近RNA聚合酶結(jié)合部位。操縱子容許負(fù)性調(diào)節(jié)(誘導(dǎo)型)轉(zhuǎn)錄，因?yàn)榛蜃瓒舻鞍卓梢越Y(jié)合操縱子并且進(jìn)而抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)成性表達(dá)可以在不存在諸如操縱子的負(fù)性調(diào)節(jié)元件時(shí)發(fā)生。另外，正性調(diào)節(jié)可以通過基因活化子蛋白結(jié)合序列達(dá)成，如果存在，那么其通常最接近于RNA聚合酶結(jié)合序列(5’)?；?活化子蛋白質(zhì)的實(shí)例是代謝活化蛋白(CAP)，其幫助引發(fā)Iac操縱子在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄[Raibaud等人，ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]。經(jīng)調(diào)節(jié)的表達(dá)因此可以是正性的或負(fù)性的，進(jìn)而增強(qiáng)或者減少轉(zhuǎn)錄。編碼代謝路徑酶的序列提供尤其有效的啟動(dòng)子序列。實(shí)例包括由諸如半乳糖、乳糖(lac) [Chang等人，Nature (1977) 198:1056]和麥芽糖的糖代謝酶得到的啟動(dòng)子序列。其他實(shí)例包括由諸如色氨酸(trp)的生物合成酶得到的啟動(dòng)子序列[Goeddel等人，Nuc. Acids Res. (1980) 8:4057 ;Yelverton 等人,Nucl. Acids Res. (1981) 9:731 ;美國(guó)專利第4，738,921號(hào)；歐洲專利公開案第036776和121775號(hào)，其是以引用的方式并入本文中]。3 -半乳糖苷酶(bla)啟動(dòng)子系統(tǒng)[Weissmann (1981) “The cloning of interferonand other mistakes.，，In Interferon 3 (I. Gresser 編)]、卩遼菌體入 PL[Shimatake 等人，Nature (1981) 292:128]和T5 [美國(guó)專利第4，689，406號(hào)]啟動(dòng)子系統(tǒng)也提供有效的啟動(dòng)子序列。諸如17啟動(dòng)子的強(qiáng)啟動(dòng)子可用以誘導(dǎo)高水平的所關(guān)注的多肽。所述載體的實(shí)例為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知并且包括來自Novagen的pET29系列和描述于以引用的方式并入本文中的W099/05297中的pPOP載體。所述表達(dá)系統(tǒng)在宿主中產(chǎn)生高水平的多肽，而不會(huì)危害宿主細(xì)胞生存性或生長(zhǎng)參數(shù)。PET19 (Novagen)是在所屬領(lǐng)域中已知的另一種載體。另外，非天然存在的合成啟動(dòng)子也起細(xì)菌啟動(dòng)子的作用。舉例而言，一個(gè)細(xì)菌啟動(dòng)子或噬菌體啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化序列可以與另一個(gè)細(xì)菌啟動(dòng)子或噬菌體啟動(dòng)子的操縱子序列接合，產(chǎn)生合成雜交啟動(dòng)子[美國(guó)專利第4，551，433號(hào)，所述專利是以引用的方式并入本文中]。舉例而言，tac啟動(dòng)子是通過Iac阻遏物調(diào)節(jié)的由trp啟動(dòng)子和Iac操縱子序列組成的雜交 trp-lac 啟動(dòng)子[Amann 等人，GENE (1983) 25:167; de Boer 等人，Peoc. Natl. Acad.Sci. (1983)80:21]。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可包括具有結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶并且引發(fā)轉(zhuǎn)錄的能力的非細(xì)菌性源的天然存在的啟動(dòng)子。非細(xì)菌性源的天然存在的啟動(dòng)子也可與相容的RNA聚合酶偶合以產(chǎn)生一些基因在原核生物中的高水平表達(dá)。細(xì)菌磷酸酶(bacteriophase)I7RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)是經(jīng)偶合的啟動(dòng)子系統(tǒng)的實(shí)例[Studier等人，J. Mol. Biol.(1986) 189:113 ;Tabor 等人，Proc Natl. Acad. Sci. (1985)82:1074]。另外，雜交啟動(dòng)子也可由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(歐洲專利公開案第267851號(hào))。除功能啟動(dòng)子序列之外，有效的核糖體結(jié)合部位也適用于外來基因在原核生物中的表達(dá)。在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合部位稱為Shine-Dalgarno (SD)序列并且包括起始密碼子(ATG)和定位于起始密碼子的3-11個(gè)核苷酸上游的長(zhǎng)度為3-9個(gè)核苷酸的序列[Shine等人，Nature (1975) 254:34]。認(rèn)為SD序列通過SD序列與大腸桿菌16SrRNA的3’末端之間的堿基的配對(duì),而促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合[Steitz等人“Geneticsignals and nucleotide sequences in messenger RNA，，，In Biological Regulationand Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]。用弱核糖體結(jié)合部位表達(dá)真核基因和原核基因[Sambrook 等人 “Expression of cloned genes in Escherichiacoli，，，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 1989]。術(shù)語“細(xì)菌宿主”或“細(xì)菌宿主細(xì)胞”指的是可用作或已經(jīng)用作用于重組載體或其他轉(zhuǎn)移DNA的接受者的細(xì)菌。術(shù)語包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的原始細(xì)菌宿主細(xì)胞的子代。應(yīng)了解，由于意外的或有意的突變，單一親代細(xì)胞的子代可以不必在形態(tài)學(xué)或補(bǔ)充于原始母體的染色體組或總DNA方面完全相同。足夠相似于有待通過諸如編碼hGH的核苷酸序列存在的相關(guān)性質(zhì)表征的母體的親代細(xì)胞的子代包括在所述定義所指的子代中。用于表達(dá)多肽的適合寄主細(xì)菌的選擇為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。在選擇用于表達(dá)的細(xì)菌宿主時(shí)，適合的宿主可以包括展示具有(尤其)良好內(nèi)含體形成能力、低蛋白質(zhì)分解活性和總堅(jiān)固性的所述宿主。細(xì)菌宿主通?？蓮陌?但不限于)以下來源的各種來源購(gòu)得Bacterial Genetic Stock Center、Department of Biophysics and MedicalPhysics, University of California (Berkeley, CA)； 和 American Type CultureCollection(“ATCC”)(Manassas，VA)。工業(yè)發(fā)酵/醫(yī)藥發(fā)酵通常使用由K菌株(例如W3110) 得到的細(xì)菌或由B菌株(例如BL21)得到的細(xì)菌。所述菌株是尤其有效的，因?yàn)槠渖L(zhǎng)參數(shù)是十分熟知的和穩(wěn)固的。另外，所述菌株是非病原性的，其在商業(yè)上對(duì)安全性和環(huán)境原因?yàn)橹匾?。適合的大腸桿菌宿主的其他實(shí)例包括(但不限于)BL21、DH10B或其衍生物的菌株。在本發(fā)明的方法的另一個(gè)實(shí)施例中，大腸桿菌宿主是包括(但不限于)OMP-和LON-的蛋白酶負(fù)菌株。宿主細(xì)胞菌株可以是包括(但不限于)熒光極毛桿菌、綠膿桿菌和惡息極毛桿菌的假單胞桿菌種。已知命名為菌株MB 101的熒光極毛桿菌生物變種I適用于重組生產(chǎn)并且可用于治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)工藝。假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括可以宿主菌株(可在WorldWide Web, dow. com 上購(gòu)得的 Midland, MI)購(gòu)自 Dow Chemical Company 的系統(tǒng)。以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利第4，755，465和4，859，600號(hào)，描述假單胞菌株作為用于hGH生產(chǎn)的宿主細(xì)胞的用途。一旦重組宿主細(xì)胞菌株已經(jīng)建立(也就是說，表達(dá)構(gòu)筑體已經(jīng)被引入宿主細(xì)胞中并且具有正確表達(dá)構(gòu)筑體的宿主細(xì)胞被分離)，就在適于生產(chǎn)所關(guān)注的多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞菌株。如所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞菌株的方法將視所利用的表達(dá)構(gòu)筑體的性質(zhì)和宿主細(xì)胞的同一性而定。通常使用所屬領(lǐng)域中熟知的方法培養(yǎng)重組宿主菌株。重組宿主細(xì)胞通常是在含有碳、氮和無機(jī)鹽的可吸收源，和(視需要)含有維生素、氨基酸、生長(zhǎng)因子和其他為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的蛋白質(zhì)培養(yǎng)補(bǔ)充物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞的液體培養(yǎng)基可以視需要含有防止不良微生物生長(zhǎng)的抗生素或抗真菌劑和/或包括(但不限于)選擇含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的抗生素的化合物。重組宿主細(xì)胞可以分批或以連續(xù)形式培養(yǎng)，同時(shí)細(xì)胞收集(在所關(guān)注的多肽細(xì)胞內(nèi)積聚的情況下)或培養(yǎng)物上清液的收集以分批或以連續(xù)形式進(jìn)行。為在原核宿主細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)，分批培養(yǎng)和細(xì)胞收集為優(yōu)選的。詵擇密碼子本發(fā)明的選擇密碼子擴(kuò)展蛋白質(zhì)生物合成器的遺傳密碼子框架。舉例而言，選擇密碼子包括(例如)獨(dú)特的3堿基密碼子，無義密碼子，諸如包括(但不限于)琥珀密碼子(UAG)、赭石密碼子或蛋白石密碼子(UGA)的終止密碼子，非天然密碼子，4堿基(或4個(gè)以上)密碼子，稀有密碼子等等。大量選擇密碼子(例如一個(gè)或一個(gè)以上、兩個(gè)或兩個(gè)以上、3個(gè)或3個(gè)以上的選擇密碼子)可被引入所要基因或多核苷酸中。在一個(gè)實(shí)施例中，方法涉及選擇密碼子的用途，該選擇密碼子為用于活體內(nèi)并入例如非天然氨基酸的所選氨基酸的終止密碼子。舉例而言，生產(chǎn)識(shí)別終止密碼子的0-tRNA并且通過O-RS用所選氨基酸氨基酰化。所述0-tRNA不能通過天然存在的宿主的氨酰基-tRNA合成酶識(shí)別出。慣用定位突變可用以在所關(guān)注的多肽中的所關(guān)注部位引入終止密石馬子。參見(例如)，Sayers, J. R.等人(198 8)，5’_3’Exonucleasesinphosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis Nucleic Acids Res,16:791-802。當(dāng) Q-RS、0-tRNA和編碼所關(guān)注的多肽的核酸(例如)活體內(nèi)組合時(shí)，響應(yīng)終止密碼子并入所選氨基酸以得到在規(guī)定位置上含有例如非天然氨基酸的所選氨基酸的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，用作選擇密碼子的終止密碼子是琥珀密碼子UAG和/或蛋白石密碼子UGA0舉例而言，就識(shí)別琥珀密碼子的0-tRNA的實(shí)例來說，參見SEQ ID NO. :6，并且就識(shí)別蛋白石密碼子的0-tRNA的實(shí)例來說，參見SEQ ID NO. :7。UAG和UGA都用作選擇密碼子的遺傳密碼可編碼22種氨基酸，同時(shí)保持為最豐富終止信號(hào)的赭石無義密碼子UAA。能在活體內(nèi)并入例如非天然氨基酸的所選氨基酸而不會(huì)顯著干擾宿主細(xì)胞。舉例而言，在諸如大腸桿菌的非真核細(xì)胞中，因?yàn)閁AG密碼子的抑制效率視例如琥珀抑制基因tRNA的0-tRNA與釋放因子I (RFl)(其結(jié)合于UAG密碼子并且引發(fā)生長(zhǎng)肽從核糖體的釋放)之間的競(jìng)爭(zhēng)而定，所以抑制效率可通過(例如)增加例如抑制基因tRNA的0-tRNA的表達(dá)水平或使用缺乏RFl的菌株來調(diào)節(jié)。在真核細(xì)胞中，因?yàn)閁AG密碼子的抑制效率視例如琥珀抑制基因tRNA的0-tRNA與真核釋放因子(例如eRF)(其結(jié)合于終止密碼子并且引發(fā)生長(zhǎng)肽從核糖體的釋放)之間的競(jìng)爭(zhēng)而定，所以抑制效率可通過(例如)增加例如抑制基因tRNA的0-tRNA的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)。非天然氨基酸也能由稀有密碼子編碼。舉例而言，當(dāng)活體外蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的精氨酸濃度降低時(shí)，已經(jīng)證明稀有的精氨酸密碼子，即AGG對(duì)通過由丙氨酸?；暮铣蓆RNA插入Ala來說為有效的。參見(例如)，Ma等人，Biochemistry. 32:7939(1993)。在所述情況下，合成tRNA與作為次要物種存在于大腸桿菌中的天然存在的tRNAArg競(jìng)爭(zhēng)。一些生物體不使用所有的三聯(lián)體密碼子。藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)中的未指定的密碼子AGA已經(jīng)被應(yīng)用于在活體外轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯提取物中插入氨基酸。參見(例如)，Kowal和Oliver. Nucl. Acid. Res. . 25:4685(1997)?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的組分以在活體內(nèi)使用所述稀有密碼子。選擇密碼子也包含(例如)4個(gè)或4個(gè)以上堿基密碼子的擴(kuò)展密碼子，諸如4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或6個(gè)以上堿基密碼子。4堿基密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGA, CUAG, UAGA,CCCU，諸如此類。5堿基密碼子的實(shí)例包括(但不限于)AGGAC,CCCCU、CCCUC、CUAGA, CUACU、UAGGC，諸如此類。特征可包括基于移碼抑制使用擴(kuò)展密碼子。4個(gè)或4個(gè)以上堿基密碼子可將(例如)一種或多種包括(但不限于)非天然氨基酸的所選氨基酸插入相同蛋白質(zhì)中。舉例而言，在具有反密碼子環(huán)，例如具有CU(X)nXXXAA序列(其中n=l)的例如特殊移碼抑制基因tRNA的經(jīng)突變0-tRNA的存在下，4個(gè)或4個(gè)以上堿基密碼子讀取為單一氨基酸。舉例而言，就識(shí)別出4堿基密碼子的0-tRNA來說，參見來自PCT/US0422061的SEQ IDNO. :6、SEQ ID NO. :12。在其他實(shí)施例中，反密碼子環(huán)可解碼(例如)至少4-堿基密碼子、至少5-堿基密碼子或至少6-堿基密碼子或至少6個(gè)以上堿基密碼子。因?yàn)榇嬖?56種可能的4-堿基密碼子，所以可使用4個(gè)或4個(gè)以上堿基密碼子在相同細(xì)胞中編碼多個(gè)非天然氨基酸。參見，Anderson 等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and AnticodonSize, Chemistry and Biology, 9:237-244 :Magliery, (2001)Expanding the GeneticCode:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identificationof^Shifty^Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli. I. Mol.Biol.307:755-769o舉例而言，使用活體外生物合成方法，4-堿基密碼子已經(jīng)被用以將非天然氨基酸并入蛋白質(zhì)中。參見(例如)，Ma等人，(1993)Biochemistry. 32:7939 :和Hohsaka等人,
(1999)LAm. Chem. Soc. 121:34。CGGG和AGGU用以同時(shí)將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物與兩種經(jīng)化學(xué)?；囊拼a抑制基因tRNA —起活體外并入抗生蛋白鏈菌素中。參見(例如),Hohsaka 等人，(1999) I. Am. Chem. Soc, 121:12194。在活體內(nèi)研究中，Moore 等人調(diào)查了具有NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現(xiàn)四聯(lián)體UAGA可通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu，以13到26%的效率解碼，同時(shí)在0或-I框中少量解碼。參見，Moore等人，(2000) T. Mol. Biol. , 298:195。在一個(gè)實(shí)施例中， 基于稀有密碼子或無義密碼子的擴(kuò)展密碼子可用于本發(fā)明中，所述擴(kuò)展密碼子可降低在其他不需要的部位上的錯(cuò)義讀取和移碼抑制。對(duì)給定系統(tǒng)來說，選擇密碼子也可包括天然3堿基密碼子之一，其中內(nèi)源性系統(tǒng)不使用(或很少使用)天然堿基密碼子。舉例而言，所述系統(tǒng)包括缺乏識(shí)別出天然3堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或其中3堿基密碼子是稀有密碼子的系統(tǒng)。選擇密碼子視需要包括非天然堿基對(duì)。所述非天然堿基對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)展現(xiàn)存的遺傳字母表。一個(gè)額外的堿基對(duì)使三聯(lián)體密碼子的數(shù)目從64增加到125。第三堿基對(duì)的性質(zhì)包括穩(wěn)定的和選擇性的堿基配對(duì)、以高保真度通過聚合酶有效地酶促并入DNA中，和在初生非天然堿基對(duì)的合成后有效的連續(xù)的引物延伸。可適宜于方法和組合物的非天然堿基對(duì)的描述包括(例如)Hirao 等人，(2002) An unnatural base pair for incorporating aminoacid analogues into protein. Nature BiotechnoloRY, 20:177182。又參見，Wu，Y.等人，
(2002)I. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630。其他相關(guān)公開案列于下文。對(duì)活體內(nèi)使用來說，非天然核苷可滲透膜并且經(jīng)磷酸化以形成對(duì)應(yīng)的三磷酸鹽。另外，增加的遺傳信息是穩(wěn)定的并且不會(huì)被細(xì)胞酶破壞。Benner和其他人的早先努力利用不同于典型的Watson-Crick對(duì)中的所述型式的氫鍵型式，其中最值得注意的實(shí)例是 iso_C: iso_G 對(duì)。參見(例如)，Switzer 等人，(1989) .1. Am. Chem. Soc, 111:8322 和Piccirilli 等人，(1990)Nature. 343:33;KooI，(2000)Curr. Opin. Chem. Biol.，4:602。所述堿基一般說來在某種程度上與天然堿基錯(cuò)配并且不能酶促地復(fù)制。Kool和同事證明，堿基之間的疏水性包裝相互作用能置換氫鍵以驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)的形成。參見，Kool, (2000)Curr.Opin. Chem. Biol.，4:602 ;和 Guckian 和 Kool, (1998) AnRew. Chem. Int. Ed. EnRl. , 36, 2825。在致力于開發(fā)滿足所有上述要求的非天然堿基對(duì)的過程中，Schultz、Romesberg和同事系統(tǒng)地合成和研究了一系列非天然疏水性堿基。發(fā)現(xiàn)PICS:PICS自身對(duì)比天然堿基對(duì)更穩(wěn)定，并且可有效地通過大腸桿菌DNA聚合酶I的克林諾片段(Klenow fragment, KF))并入DNA 中。參見(例如)，McMinn 等人，(1999).1. Am. Chem. Soc, 121:11585-6 和 Ogawa 等人,
(2000)I. Am. Chem. Soc. 122:3274。3MN:3MN自身對(duì)能通過KF，以足夠用于生物功能的效率和選擇性來合成。參見(例如)，Ogawa等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:8803。然而，兩個(gè)堿基擔(dān)當(dāng)進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止劑。最近，已經(jīng)開發(fā)可用以復(fù)制PICS自身對(duì)的突變DNA聚合酶。另外，可復(fù)制7AI自身對(duì)。參見(例如)，Tae等人，(2001) T. Am. Chem. Soc. 123:7439。也已經(jīng)開發(fā)了新穎的金屬堿基對(duì)，即Dipic:Py，其在結(jié)合銅(II)后形成穩(wěn)定的對(duì)。參見，Meggers等人，(2000) T. Am. Chem. Soc. 122:10714。因?yàn)閿U(kuò)展密碼子和非天然密碼子本質(zhì)上與天然密碼子正交，所以本發(fā)明的方法可以利用所述性質(zhì)來產(chǎn)生其正交的tRNA。轉(zhuǎn)譯旁路系統(tǒng)也可用以將例如非天然氨基酸的所選氨基酸并入所要多肽中。在轉(zhuǎn)譯旁路系統(tǒng)中，大的序列被插入基因中但不轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。序列含有充當(dāng)誘導(dǎo)核糖體跳過序列并且在插入物的下游恢復(fù)轉(zhuǎn)譯的結(jié)構(gòu)。所選氨基酸和非天然氨基酸如本文中所使用，所選氨基酸指的是任何所要求的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸。天然存在的氨基酸包括20種經(jīng)遺傳編碼的a-氨基酸中的任何一種丙氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、白氨 酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，所選氨基酸是以高保真度，以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約70%的效率、以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約75%的效率、以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約80%的效率、以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約85%的效率、以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約90%的效率、以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約95%的效率，或以對(duì)給定選擇密碼子來說大于約99%或99%以上的效率，并入生長(zhǎng)多肽鏈中。如本文中所使用，非天然氨基酸指的是任何氨基酸、經(jīng)修飾的氨基酸或不同于硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下20種經(jīng)遺傳編碼的a -氨基酸的氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異白氨酸、白氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。a-氨基酸的通用結(jié)構(gòu)由式I說明
I
R
H2NCfeH
O非天然氨基酸通常為具有式I的任何結(jié)構(gòu)，其中R基團(tuán)是不同于20種天然氨基酸中所用取代基的的任何取代基。就20種天然氨基酸的結(jié)構(gòu)來說，參見(例如)L. Stryer的Biochemistry,第三版 1988，F(xiàn)reeman and Company, New York。注意，本發(fā)明的非天然氨基酸可為不同于上述20種a-氨基酸的天然存在的化合物。因?yàn)楸景l(fā)明的非天然氨基酸通常僅在側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)上不同于天然氨基酸，所以非天然氨基酸以與酰胺鍵在天然存在的蛋白質(zhì)中形成的相同方式，與包括(但不限于)天然或非天然的其他氨基酸形成酰胺鍵。然而，非天然氨基酸具有使其區(qū)別于天然氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)。舉例而言，式I中的R可以包含烷基_、芳基_、?；鵢、酮基_、疊氮基_、羥基_、肼、氰基-、齒基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺?；?、硼酸基_、酉朋酸基、磷酸基、膦酰基、膦、雜環(huán)基、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺，諸如此類或其任何組合。其他非天然存在的氨基酸包括(但不限于)包含可光活化的交聯(lián)劑的氨基酸、經(jīng)自旋標(biāo)記的氨基酸、發(fā)熒光的氨基酸、結(jié)合金屬的氨基酸、含金屬的氨基酸、放射性氨基酸、具有新穎的官能團(tuán)的氨基酸、共價(jià)地或非共價(jià)地與其他分子相互作用的氨基酸、光致籠罩和/或光致異構(gòu)化的氨基酸、包含生物素或生物素類似物的氨基酸、諸如經(jīng)糖取代的絲氨酸的經(jīng)糖基化的氨基酸、經(jīng)其他碳水化合物修飾的氨基酸、含酮的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、經(jīng)重原子取代的氨基酸、可化學(xué)裂解和/或可光致裂解的氨基酸、當(dāng)與天然氨基酸比較時(shí)具有伸長(zhǎng)側(cè)鏈的氨基酸，所述伸長(zhǎng)側(cè)鏈包括(但不限于)聚醚或(包括(但不限于))大于約5個(gè)或大于約10個(gè)碳的長(zhǎng)鏈烴、經(jīng)碳連接的含糖氨基酸、氧化還原活性的氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸和包含一個(gè)或一個(gè)以上毒性部分的氨基酸。又參見，美國(guó)專利申請(qǐng)公開案2003/0082575和2003/0108885，其是以引用的方式并入本文中。非天然氨基酸可以具有用以(例如)將蛋白質(zhì)連接到固體支撐物的可光活化的交聯(lián)劑。非天然氨基酸可以具有與氨基酸側(cè)鏈連接的糖類部分。除含有新穎側(cè)鏈的非天然氨基酸之外，(例如)由式II和III的結(jié)構(gòu)所說明，非天 然氨基酸視需要也包含經(jīng)修飾的骨架結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種在細(xì)胞中用所選氨基酸在規(guī)定位置上生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包含 使所述細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞包含包括至少ー個(gè)選擇密碼子并編碼多肽的核酸；和， 提供所述所選氨基酸； 其中所述細(xì)胞另外包含 在所述細(xì)胞中起作用的正交RS (0-RS)，其中所述RS具有選自由以下序列組成的群組的氨基酸序列SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 17、其互補(bǔ)多核苷酸序列和其保守變化；和， 識(shí)別出所述選擇密碼子的正交tRNA (O-tRNA)，其中所述O-RS用所述所選氨基酸氨基?；?-tRNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述所選氨基酸是對(duì)こ?；奖彼?。
3.—種通過根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法產(chǎn)生的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述所選氨基酸是對(duì)こ酰基苯丙氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)包括正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶和tRNA/合成酶的正交對(duì)的蛋白質(zhì)生物合成器的組分的組合物和方法。本發(fā)明也提供用于鑒別所述正交對(duì)的方法以及使用所述正交對(duì)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102732588SQ20121022433
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月22日
發(fā)明者丘霍松, 安德魯·鮑賽爾 申請(qǐng)人:Ambrx公司