專利名稱：：一種固定化氨基?；傅闹苽浞椒捌洚a(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種固定化酶的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，具體的涉及一種固定化氨基?；傅闹苽浞椒ā⒂善渲频玫墓潭ɑ被；讣捌鋺?yīng)用。
背景技術(shù)：
：氨基?；钢饕糜诓鸱瞩；?DL-氨基酸為L-型和D-型光學(xué)活性氨基酸。在生產(chǎn)光學(xué)活性氨基酸中可以使用自由酶，但是穩(wěn)定性差，而且自由酶只能采用批式反應(yīng)器，反應(yīng)后酶不能回收，使產(chǎn)品的分離純化困難，容易造成蛋白質(zhì)污染，所以對生產(chǎn)非天然氨基酸來說自由酶還不是一種理想的催化劑。為了克服自由酶的各種缺點，人們大量研究固定化氨基酰化酶的工藝以及應(yīng)用技術(shù)，1969年，Chibata等以DEAE-Sephadex為載體將米曲霉氨基酰化酶固定化，但是該固定化材料昂貴，只能夠用于固定化床反應(yīng)，工業(yè)操作并不方便。卡拉膠是一種含有許多硫酸根基團的多糖化合物，作為固定化材料具有穩(wěn)定性好、成本低的優(yōu)點，是用量最為廣泛的固定化材料。但是它有兩個比較大的缺點一是它的凝固點太高，眾所周知工業(yè)生產(chǎn)上固定化操作均在凝固點附近進行，這不僅給固定化成形帶來困難，而且嚴(yán)重影響被包埋細(xì)胞及酶的活性；二是固定化后的膠一般是大的塊狀，需要手工或者機械切片，而片狀催化劑裝卸入反應(yīng)器不方面，片狀流動性差，在反應(yīng)器內(nèi)容易流體短路等，而切片也增加了工序以及造成催化劑的流失。為了降低卡拉膠的凝固點，國內(nèi)外進行了大量的卡拉膠復(fù)配固定化研究，如歐陽平凱等用卡拉膠混合凝膠固定化延胡索酸酶生產(chǎn)L-蘋果酸，無錫輕工大學(xué)陳堅等PVA-卡拉膠混合載體固定化大腸桿菌-酵母菌混合體系生產(chǎn)谷胱甘肽等。球狀(顆粒狀)催化劑具有廣泛的優(yōu)點，能否把卡拉膠固定化酶由一般的片狀改為球狀？如果能夠成為球狀，就具有了良好的流動性，可以方便用于流化床與反應(yīng)釜中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有的固定氨基?；傅牟牧现袃r格昂貴，只能夠用于固定化床反應(yīng)，工業(yè)操作并不方便，以及凝固點太高不易固定化成形且影響酶活性，固定化后的膠多是大的塊狀或片狀，流動性差等缺陷，而提供了一種固定化氨基?；傅闹苽浞椒?、由其制得的固定化氨基?；讣捌鋺?yīng)用。本發(fā)明的制備方法可有效降低固定化材料的凝固點，并且制得的固定化氨基酰化酶是顆粒狀，流動性好，可以高效方便的拆分光學(xué)活性氨基酸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，明膠凝固點較低，同時也是固定化材料，在卡拉膠中混合一定比例的明膠，可以有效降低固定化材料的凝固點；發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，基于反相懸浮技術(shù)，以有機溶劑為固定化溶劑，將熔融的固定化材料滴入有機溶劑中，可以制備出顆粒狀的固定化酶。發(fā)明人將以上兩點結(jié)合使用，制備出凝固點低而且是顆粒狀的固定化酶，并將這樣的酶成功地應(yīng)用于流化床與反應(yīng)釜中，高效方便地拆分生產(chǎn)了光學(xué)活性氨基酸。本發(fā)明涉及一種固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其包含下列步驟在水中，60-90。C下將固定化材料(卡拉膠和明膠)溶解，降溫至40-60。C，再加入氨基酰化酶，混合均勻，然后將此混合液流加到溫度為20-35i:的有機溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KC1水溶液中固化，即可制得固定化氨基?；?，其中，所述的KC1水溶液中還含有戊二醛。其中，所述的卡拉膠和明膠的重量比較佳的為80-95:20-5，優(yōu)選88-92:512-8;所述的固定化材料(即卡拉膠和明膠)與水的重量比較佳的為l-8:99-92;所述的氨基?；概c固定化材料的重量比較佳的為1-15:99-85;所述的有機溶劑較佳的為煤油、汽油、植物油、石油醚、苯和甲苯中的一種或多種，更佳的為煤油、汽油和植物油中的一種或多種；所述的固化時間較佳的為2小時；所述的KC1水溶液中KC1的濃度較佳的為0.1N，其中戊二醛的濃度較佳的為0.5%(重量百分比)。本發(fā)明中，上述制備方法制得的固定化氨基?；傅耐庥^呈現(xiàn)為顆粒狀。本發(fā)明進一步涉及由上述制備方法制得的固定化氨基?；浮１景l(fā)明還涉及上述固定化氨基?；冈诖呋铣晒鈱W(xué)活性的氨基酸中的應(yīng)用，其包含下列步驟在固定化氨基?；傅拇呋拢阴；被岜徊鸱譃楣鈱W(xué)活性的氨基酸。其中，所述的應(yīng)用較佳的包含下列步驟(1)水中，溫度25-50。C，pH保持為7.5-7.8，DL-乙?；被嵩趬A的作用下以及固定化氨基酰化酶的催化下反應(yīng)；(2)將步驟(1)得到的反應(yīng)液過濾，過濾出固定化氨基酰化酶顆粒，將濾液濃縮結(jié)晶即可制得光學(xué)活性的L-氨基酸，母液中的D-乙酰化氨基酸通過水解反應(yīng)即可制得D-氨基酸。上述應(yīng)用包含的最佳步驟如下在反應(yīng)器中加入DL-乙?；被崴芤?，調(diào)節(jié)pH至7.5-7.8，加入上述顆粒狀固定化氨基酰化酶，用堿液維持pH，保持溫度25-5(TC，反應(yīng)至pH不再變化后DL-乙?；被岜淮呋癁長-氨基酸，然后過濾出固定化酶顆粒，將濾液濃縮結(jié)晶，即得到光學(xué)活性的L-氨基酸；母液中未轉(zhuǎn)化的D-乙?；被嵬ㄟ^水解反應(yīng)即可制得D-氨基酸，其中，反應(yīng)器指流化床與反應(yīng)釜。其中，過濾出的固定化酶顆粒還可以循環(huán)套用于下一批反應(yīng)。除特殊說明外，本發(fā)明涉及的原料和試劑均市售可得。6本發(fā)明的積極進步效果在于本發(fā)明的制備方法可有效降低固定化材料的凝固點，并且制得的固定化氨基?；甘穷w粒狀，機械強度高、回收率很高、流動性好，可以高效方便的拆分光學(xué)活性氨基酸，并且可以循環(huán)使用，便于生產(chǎn)操作。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。實施例l以卡拉膠明膠2克，配比為9:l比例，加入100ml水，加熱溶解，降到50°C，與氨基?；?.1克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(25"C)的煤油燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5。/。，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例2以卡拉膠:明膠2克，配比為4:l比例，加入100ml水，6(TC溶解，降到40°C，與氨基?；?.02克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(25°C)的汽油燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5Q/。，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例3以卡拉膠明膠2克，配比為19:l比例，加入198ml(198g)水，75°C溶解，降到5(TC，與氨基?；?.3克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(25°C)的煤油燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5c/。，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例4以卡拉膠明膠2克，配比為ll:l比例，加入100ml水，卯。C溶解，降到5(TC，與氨基酰化酶0.02克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(35°C)的植物油燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5Q/。，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例5以卡拉膠明膠2克，配比為8:l比例，加入100ml水，70。C溶解，降到50°C，與氨基酰化酶0.02克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(20°C)的石油醚燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0，1NKCL溶液戊二醛濃度0.5。/。，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例6以卡拉膠明膠2克，配比為9:l比例，加入100ml水，8(TC溶解，降到60°C，與氨基?；?.1克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(20°C)的苯燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5M，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。實施例7以卡拉膠明膠2克，配比為9:l比例，加入100ml水，80。C溶解，降到50°C，與氨基?；?.1克混合均勻，流加到室溫狀態(tài)(25"C)的甲苯燒瓶中，150rpm轉(zhuǎn)速下速，攪拌30分鐘，然后過濾，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5"/c)，固化2小時，制備為固定化酶顆粒。效果實施例對照試驗為以卡拉膠2克，加入100ml水，加熱溶解，降到6(TC，與氨基?；?.1克混合均勻，倒入培養(yǎng)皿中，固化1小時，然后切片成為2*3*2!11111塊狀，蒸餾水洗滌一次，然后加入0.1NKCL溶液戊二醛濃度0.5c/。，固化2小時，制備為片狀固定化酶。測定初始酶活力。取實施例1制得的固定化酶顆粒及上述制備的固定化顆粒各20克，加入100ml0.1M的N-乙酰-DL-苯丙氨酸底物，轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)1小時后，濾出固定化顆粒，重新加入IOOmlO.lM的N-乙酰-DL-苯丙氨酸底物，重復(fù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。共計轉(zhuǎn)化30批次。測定30批后酶活力，計算酶活力保留率。結(jié)果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表l可以看出，在同樣固定化材料比例的情況下顆粒狀酶的起始酶活力大于片狀固定化酶，這是因為低溫片狀固定化酶使用了明膠與卡拉膠作為混合材料有效降低了凝固點和制備溫度，因而酶損失較少的原因。顆粒固定化酶連續(xù)轉(zhuǎn)化30批后顆粒狀酶酶活力保留率優(yōu)于片狀酶，這可能是片狀因為切片以及攪拌緣故，有較多酶流失到了反應(yīng)液中。應(yīng)用實施例l在250L反應(yīng)釜中加入1OOL反應(yīng)底物(0.2MN-乙酰-DL-苯丙氨酸，PH7.8)，控制37匸，pH7.8，加入活力為400U/gh-l的固定化顆粒酶20KG，反應(yīng)6小時，離心機過濾回收催化劑，稱重。每隔l小時測定L-PHE-OH含量。測定反應(yīng)液中L-PHE-OH轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)罐規(guī)格為標(biāo)準(zhǔn)250L搪瓷反應(yīng)釜，攪拌為槳式攪拌，轉(zhuǎn)速為83rpm.結(jié)果表明反應(yīng)2小時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到88。1%，反應(yīng)6小時后轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。應(yīng)用實施例2實驗條件在100L固定化酶反應(yīng)器中加入100L反應(yīng)底物(0.2MN-乙酰-DL-苯丙氨酸，pH7.8)，控制37。C，PH7.8，加入活力為400U/gh-l的固定化顆粒酶20KG，當(dāng)反應(yīng)達(dá)到99%時候停止反應(yīng)，過濾出催化劑，繼續(xù)加同樣物料反應(yīng)，同時測定固定化酶活力。重復(fù)反應(yīng)。結(jié)果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4499.53655499.43606499.33567499.33508499.23469499.034010599.333211599.232612599.132013599.031214699.531315699.430516699,329517699.228718699.128019799.327520799.226921799.226222799.125623899.324924899.324225899.223726899.223127899.122428899.021529999.220930999.220231999.119532999.118833999.0180341099.2172從以上反應(yīng)可以看出，固定化酶具有良好的穩(wěn)定性，同時本專用反應(yīng)器內(nèi)體現(xiàn)了良好的轉(zhuǎn)化率。在酶套用30批次后酶依然保存了50%的酶活力。10權(quán)利要求1、一種固定化氨基?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟诎铝胁襟E在水中，60-90℃下將固定化材料溶解，降溫至40-60℃，再加入氨基?；?，混合均勻，然后將此混合液流加到溫度為20-35℃的有機溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KCl溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCl溶液中還含有戊二醛，所述的固定化材料為卡拉膠和明膠。2、如權(quán)利要求l所述的固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于所述的卡拉膠和明膠的重量比為80-95:20-5;所述的固定化材料與水的重量比為l-8:99-92;所述的氨基酰化酶與固定化材料的重量比為1-15:99-85。3、如權(quán)利要求2所述的固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于所述的卡拉膠和明膠的比例為88-92:12-8。4、如權(quán)利要求l所述的固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于所述的固化的時間為2小時；所述的有機溶劑為煤油、汽油、植物油、石油醚、苯和甲苯中的一種或多種。5、如權(quán)利要求4所述的固定化氨基?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟谒龅挠袡C溶劑為煤油、汽油和植物油中的一種或多種。6、如權(quán)利要求l所述的固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于所述的KC1溶液中KC1的濃度為0.1N，其中戊二醛的濃度為0.5%。7、一種由權(quán)利要求l所述的制備方法制得的固定化氨基?；?。8、如權(quán)利要求7所述的固定化氨基?；冈诖呋铣晒鈱W(xué)活性的氨基酸中的應(yīng)用，其包含下列步驟在固定化氨基?；傅拇呋拢阴；被岜徊鸱譃楣鈱W(xué)活性的氨基酸。9、如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用包含下列步驟(1)水中，溫度25-50。C，pH保持為7.5-7.8，DL-乙?；被嵩趬A的作用下以及固定化氨基?；傅拇呋路磻?yīng)；(2)將步驟(1)得到的反應(yīng)液過濾，將濾液濃縮結(jié)晶即可制得光學(xué)活性的L-氨基酸，母液中的D-乙?；被嵬ㄟ^水解反應(yīng)即可制得D-氨基酸。10、如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用包含下列步驟:在反應(yīng)器中加入DL-乙酰化氨基酸水溶液，調(diào)節(jié)pH至7.5-7.8，加入顆粒狀固定化氨基?；?，用堿液維持pH，保持溫度25-5(TC，反應(yīng)至pH不再變化后DL-乙?；被峒幢淮呋癁長-氨基酸，然后過濾出固定化酶顆粒，將濾液濃縮結(jié)晶，即得到光學(xué)活性的L-氨基酸；母液中未轉(zhuǎn)化的D-乙酰化氨基酸通過水解反應(yīng)即可制得D-氨基酸，其中，反應(yīng)器指流化床與反應(yīng)釜。全文摘要本發(fā)明公開了種固定化氨基酰化酶的制備方法，其包含下列步驟在水中，60-90℃下將固定化材料(卡拉膠和明膠)溶解，降溫至40-60℃，再加入氨基?；?，混合均勻，然后將此混合液流加到溫度為20-35℃的有機溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KCl水溶液中固化，即可制得固定化氨基?；?，其中，所述的KCl水溶液中還含有戊二醛。本發(fā)明還公開了由其制得的固定化氨基?；讣捌鋺?yīng)用。本發(fā)明的制備方法可有效降低固定化材料的凝固點，并且制得的固定化氨基酰化酶是顆粒狀，流動性好，可以高效方便的拆分光學(xué)活性氨基酸。文檔編號C12P13/04GK101671664SQ20091004787公開日2010年3月17日申請日期2009年3月20日優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日發(fā)明者波元,寧張,莉李,楊召鵬,董龍輝,明袁,馬士強,馬士忠,馬道功申請人:上海瀚鴻化工科技有限公司