專利名稱：一種用于克隆含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的dna分子及克隆方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽(-RGD-)的DNA分子及克隆方法。
背景技術：
蠶絲是天然動物蛋白纖維，包括家蠶絲和野蠶絲(柞蠶絲、天蠶絲等)。家蠶絲素由于來源豐富，也是研究的熱點，學者對其結構、性能及生物材料應用方面進行了大量的研 究。然而，有關野蠶絲素方面的研究國內外報導極少。再生野蠶絲素溶液及膜的分子構象以α-螺旋結構和無規(guī)卷曲結構為主，經過こ醇溶液處理的野蠶絲素膜的β_折疊結構含量増加。天蠶絲素來源比較稀少，有報導將編碼天蠶基因導入家蠶中進行表達并從家蠶分泌的絲物質中檢測到天蠶絲素蛋白。野蠶絲素蛋白肽鏈上含有ー種特殊的序列精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列，柞蠶絲素蛋白分子含有12個RGD，約占柞蠶絲素氨基酸殘基總數的I. 35%。天蠶絲素蛋白分子含有14個RGD，約占天蠶絲素氨基酸殘基總數的I. 7%。這種R⑶三肽序列廣泛存在于膠原蛋白、粘著蛋白等細胞外基質中，有助于細胞粘附，促使貼壁細胞粘附生長。研究發(fā)現(xiàn)，經RGD化學修飾的絲素膜及其他改性材料如高分子聚合物等都能提高細胞粘附率。因此預見野蠶(柞蠶和天蠶)絲素蛋白對細胞的親和性比家蠶絲素蛋白更好，有作為高性能的生物材料的巨大潛力。經過對再生野蠶絲素蛋白的體外生物相容性的初步研究，發(fā)現(xiàn)再生野蠶絲素材料可以很好地支持大鼠骨髄間充質干細胞的粘附與増殖。報導認為材料并不是有RGD的存在就一定有良好的促細胞黏附和增殖功能，還與RGD在肽鏈中的位置有夫。為合理科學地設計野蠶絲素蛋白生物材料，首先必須知道肽鏈中RGD與細胞粘附性之間的規(guī)律性。因此，掲示野蠶絲素蛋白的組成與其生物學功能的關系具有重要意義。傳統(tǒng)的方法主要采用溶解蠶絲獲得再生絲素蛋白的方法來研究其性能，但無法說明其生物學性能的結構(序列)。絲素蛋白研究方面，有學者通過化學合成肽段來研究其結構性能，但化學合成并不能合成大分子量的蛋白，而蛋白的分子量和聚合度與蛋白的結構或性能密切相關。Kozo Tsubouchi研究組將家蠶絲素用胰乳蛋白酶消化,分離出各種肽段，通過序列鑒定和細胞培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)絲素H鏈N-末端有2段基序NINDFDED和VITTDSDGNE對人皮膚成纖維細胞増殖有促進作用。但這種方法獲得的是各種肽段混合液，種類繁多，分子量各異，肽段分割、精確分離復雜，不易獲得高純度的單序列。采用基因工程技術來研究其組成與生物學功能的關系，有研究報導，通過大腸桿菌表達獲得的含RGD三肽的重組蛋白[TGRGDSPA (GVPGV) 2GG (GAGAGS) 3AS]n表現(xiàn)出良好的細胞粘附與増殖能力；與RGD序列共混的再生家蠶絲素蛋白以及重組RGD蜘蛛絲蛋白能支持未分化的小鼠成骨細胞的分化；將RGD重組蜘蛛絲和聚こ烯醇高分子材料結合能支持鼠胚胎成纖維細胞的生長。但是上述研究并不能夠掲示重復多次的RGD分布與天蠶絲素蛋白可能具有的出色的促細胞粘附性之間的關系。目前，提供用于修飾高分子材料的RGD短肽的方法多采用化學合成技木。化學合成方法只能得到分子量較小的多肽，很難得到大分子量的肽，所以難以進一歩研究重復多次的RGD分布與野蠶絲素蛋白的促細胞粘附性之間的關系。因此，本發(fā)明提供了一種野蠶絲素蛋白基序及野蠶絲素蛋白基因的克隆方法，用于獲得野蠶絲素蛋白RGD重復序列，以期研究野蠶絲素絲蛋白RGD三肽及其重復序列與其生物學功能的關系。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽(-RGD-)的DNA分子及克隆方法。該克隆方法操作簡單，準確度高；獲得的單倍、雙倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列結果準確。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案本發(fā)明提供了ー種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽(-RGD-)的DNA分子，其編碼鏈的序列如SEQ ID NO :I所示。本發(fā)明還提供了 ー種克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因重復序列的方法，包括如下步驟步驟I :合成編碼鏈序列如SEQ ID NO : I所示的DNA分子；所述DNA分子的編碼鏈序列的5’端含有BglII的粘末端堿基，3’端具有BamHI的粘末端堿基，所述BglII位點的上游還具有AgeI的粘末端喊基；步驟2 :取所述DNA分子與pSLFA1180FA質粒連接獲得轉化質粒，轉化感受態(tài)細 胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。在本發(fā)明提供的一些實施例中，連接具體為取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化PSLFA1180FA質粒，收集大片段，與編碼序列如SEQ ID NO : I所示的DNA分子經T4連接酶連接。本發(fā)明還提供了一種克隆單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒收集大片段，與編碼鏈序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆；轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。本發(fā)明還提供了一種克隆雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，包括如下步驟步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，收集大片段P1，與編碼序列如SEQ ID NO : I所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ；步驟2 :取限制性核酸內切酶BglII/EcoRI消化所述單倍克隆pSL_AYRl，收集小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，收集大片段P3 ;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR2 ；步驟3 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。本發(fā)明還提供了一種克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍為大于I的奇數倍，包括如下步驟步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，瓊脂糖凝膠電泳回收第一消化產物中的大片段P1，與編碼鏈序列如SEQ IDNO 1所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ；步驟2 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述單倍克隆pSL_AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第二消化產物中的小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得含雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆 pSL-AYR2 ；
步驟3 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述雙倍克隆pSL_AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3;取所述小片段P4與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得三倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆 pSL-AYR3 ；步驟4 :重復步驟3，取限制性核酸內切酶BglII/EcoRI消化所述雙倍克隆PSL-AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述三倍克隆pSL-AYR3，瓊脂糖凝膠電泳回收第五消化產物中的大片段P5 ;取所述小片段P4與所述大片段P5經T4連接酶連接，獲得五倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR5 ；步驟5 :重復步驟4，獲得奇數倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的克??；步驟6 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。本發(fā)明還提供了一種克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍為大于2的偶數倍，包括如下步驟步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，瓊脂糖凝膠電泳回收第一消化產物中的大片段P1，與編碼鏈序列如SEQ IDNO 1所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ；步驟2 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述單倍克隆pSL_AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第二消化產物中的小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆 pSL-AYR2 ；步驟3 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述雙倍克隆pSL_AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述雙倍克隆PSL-AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第六消化產物中的大片段P6;取所述小片段P4與所述大片段P6經T4連接酶連接，獲得四倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆 pSL-AYR4 ； 步驟4 :重復步驟3，取限制性核酸內切酶BglII/EcoRI消化所述四倍克隆PSL-AYR4，瓊脂糖凝膠電泳回收第七消化產物中的小片段P7 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述雙倍克隆PSL-AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第六消化產物中的大片段P6 ;取所述小片段P7與所述大片段P6經T4連接酶連接，獲得六倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR6 ；步驟5 :重復步驟4，獲得偶數倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的克隆；步驟6 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。 本發(fā)明提供一種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的DNA分子及克隆方法。該克隆方法操作簡單，準確度高；獲得的單倍、雙倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列結果準確。獲得的單倍、雙倍或多倍克隆的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因表達產物能夠用來制備細胞培養(yǎng)基質、組織誘導材料或組織工程支架。


圖I 示質粒 pSLFA1180FA 圖譜；圖2示實施例2中構建質粒pSL-AYR2的構建方法；圖 3 示實施例 12 中對質粒 pSL-AYRl、pSL-AYR2、pSL-AYR4、pSL-AYR8、pSL-AYRl2、PSL-AYR16、pSL-AYR24采用限制核酸性內切酶Bglll/BamHI消化，然后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳，用EB染色觀察鑒定結果；其中，泳道M示DNA標準分子量(bp)，泳道I示質粒pSL-AYRl，泳道2示質粒pSL-AYR2，泳道3示質粒pSL_AYR4，泳道4示質粒pSL_AYR8，泳道5示質粒pSL-AYRl2，泳道6示質粒pSL_AYR16，泳道7示質粒pSL_AYR24。
具體實施例方式本發(fā)明公開了 ー種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽(-RGD-)的DNA分子及克隆方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進エ藝參數實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內容、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技木。本發(fā)明提供的一種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的DNA分子及克隆方法中所用試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進ー步闡述本發(fā)明實施例I單倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性內切酶Agel/BamHI消化pSLFA1180FA質粒(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下pSLFAMBOFAI^ig
FastDigest@AgeI ( IFDLJ)0.5,uL
FastDigest@BamHI (I FDU)0.5μ
10><FastDigest(2;Buffer2‘uL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし 在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收AgeI與BamHI之間大片段。與設計合成的“-RGD-”的雙鏈DNA分子混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系
雙鏈 DNA 分子“-RGD-” 6μ (IOOmM )
酶切后回收的大片段 2μ[(1%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)
Τ4 DNA連接酶IpL
I Ox連接酶 BufferI μL連接體系總量為10 μ L0將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素(抗生素)的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得單倍“-RGD-”基因序列的質粒pSL-AYRl。實施例2雙倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化實施例I制得的質粒pSL_AYRl (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYRl 質粒IiLig
FastDigest@BglII (IFDU)0.5^iL
FastDigest@EcoRI (IFDU) 0.5liL I ()χ FastDigest@Buffer2μ 加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BglII與EcoRI之間小片段。用限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化質粒pSL_AYRl (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品)，反應體系如下
pSL-AYRl 質粒l,ug
FastDigest@BamHI (I FDU)0.5‘u.L
FastDigest@ EcoRI (I FDU)0.5μ.L
I OxFastDigest@Buffer2μL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與EcoRI之間大片段。將BglII與EcoRI之間小片段與BamHI與EcoRI之間大片段混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系BglII與EcoRI之間小片段5 μ L(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)BamHI與EcoRI之間大片段3 μ L(1%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)T4DNA 連接酶IyL10 X 連接酶 Buffer I μ L連接體系總量為10 μし 將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得含有雙倍“-RGD-”基因序列的質粒pSL_AYR2。實施例3三倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化實施例2制得的質粒pSL_AYR2 (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYR2 質粒Uig
FastDigest@Bg!II (IFDU)0·5μし
FastDiiiest(ii)EcoRI (I FDU) 0.5^iL I Οχ FastDigest@Buffer2\iL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BglII與EcoRI之間小片段。用限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化實施例I制得的質粒pSL_AYRl (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYR!質粒丨噸
FastDigest@BamHI (IFDU)0.5μL
FastDigest@ EcoRI (IFDLJ)0.5μΙ.
I Οχ FastDigest@Buffer2μし加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與EcoRI之間大片段。將BglII與EcoRI之間小片段與BamHI與EcoRI之間大片段混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系BglII與EcoRI之間小片段5 μ L(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)BamHI與EcoRI之間大片段3 μ L(1%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)T4DNA 連接酶I μ L10 X 連接酶 Buffer I μ L
連接體系總量為10 U L0將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得含有三倍“-RGD-”基因序列的質粒pSL_AYR3。實施例4四倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化實施例2制得的質粒pSL_AYR2 (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYR2 質粒Uig
FastDigest(mBglII (IFDU)0.5μ
FastDigest@EcoRI ( I FDU) 0.5μ10xFastDigest@Buffer2μL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BglII與EcoRI之間小片段。 用限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化實施例2制得的質粒pSL_AYR2 (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYR2 質粒l.ug
FastD.igesi@Ba.mHl (I FDU)0.5‘uL
FastDigest@ EcoRI (IFDU)0.5‘uL
I OxFastDigest@Buffer2 _uL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與EcoRI之間大片段。將BglII與EcoRI之間小片段與BamHI與EcoRI之間大片段混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系BglII與EcoRI之間小片段5 μ L(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)BamHI與EcoRI之間大片段3 μ L(1%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)T4DNA 連接酶I μ L10 X 連接酶 Buffer I μ L連接體系總量為10 μし將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得含有四倍“-RGD-”基因序列的質粒pSL_AYR4。實施例5四倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化實施例3制得的質粒pSL_AYR3 (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
·
pSL-AYR3 質粒IiUg
FastDigest@BglII (I FDU)0.5μ
FastDigest@EcoRI (IFDU) 0.5μ i Ox FastDigest@.Buffer2‘uL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BglII與EcoRI之間小片段。用限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化實施例I制得的質粒pSL_AYRl (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYRl 質粒I .Ug
FastDigest@BamHl ( IFDU)0.5μL
FastDigest@ EcoRI (I FDU)0.5,uL
I Ox FastDigest@BLiffer2\\L加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BamHI與EcoRI之間大片段。將BglII與EcoRI之間小片段與BamHI與EcoRI之間大片段混合，在T4DNA連接酶的作用下4°C連接過夜(8 12h)。連接反應體系BglII與EcoRI之間小片段5 μ L(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)BamHI與EcoRI之間大片段3 μ L(l%瓊脂糖凝膠電泳回收的上清液)T4DNA 連接酶IyL10 X 連接酶 Buffer I μ L連接體系總量為10 μし將連接產物轉化入ToplO感受態(tài)細胞，鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上倒置培養(yǎng)，挑克隆，接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，抽提質粒，用限制性內切酶和DNA測序(Invitrogen公司)鑒定獲得含有四倍“-RGD-”基因序列的質粒pSL_AYR4。實施例6五倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆用限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化實施例4或實施例5制得的質粒pSL_AYR4(所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
pSL-AYR4 質粒i.ug
FastDigest@Bg!li (I FDU)0.5μ
FastDigest@EcoRI (IFDU) 0.5μ IO X FastD igest@Buffer2 μL加入滅菌蒸餾水補足體系總量至20 μし
在37°C恒溫水浴15min進行酶切消化，然后將酶切產物進行凝膠電泳并進行DNA凝膠回收，回收BglII與EcoRI之間小片段。用限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化實施例I制得的質粒pSL_AYRl (所用內切酶及相應緩沖液為fermentas產品),反應體系如下
權利要求
1.ー種用于克隆含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的DNA分子，其特征在于，其編碼鏈的序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一種克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因重復序列的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :合成編碼鏈序列如SEQ ID NO : I所示的DNA分子；所述DNA分子的編碼鏈序列的5’端含有BglII的粘末端堿基，3’端具有BamHI的粘末端堿基，所述BglII位點的上游還具有AgeI的粘末端喊基； 步驟2 :取所述DNA分子與pSLFA1180FA質粒連接獲得轉化質粒，轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述連接具體為取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，收集大片段，與編碼鏈序列如SEQ ID NO 1所示的DNA分子經T4連接酶連接。
4.一種克隆單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，其特征在干，取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒收集大片段，與編碼鏈序列如SEQ ID NO :I所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸_甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克??；轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。
5.一種克隆雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，收集大片段P1，與編碼鏈序列如SEQ ID NO: I所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ； 步驟2 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述單倍克隆pSL_AYRl，收集小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL_AYRl，收集大片段P3 ;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR2 ； 步驟3 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。
6.一種克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍為大于I的奇數倍，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，瓊脂糖凝膠電泳回收第一消化產物中的大片段P1，與編碼鏈序列如SEQ IDNO 1所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ； 步驟2 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第二消化產物中的小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3 ;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR2 ； 步驟3 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述雙倍克隆pSL_AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3 ;取所述小片段P4與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得三倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR3 ； 步驟4 :重復步驟3，取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述雙倍克隆pSL_AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述三倍克隆PSL-AYR3，瓊脂糖凝膠電泳回收第五消化產 物中的大片段P5 ;取所述小片段P4與所述大片段P5經T4連接酶連接，獲得五倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR5 ； 步驟5 :重復步驟4，獲得奇數倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的克隆； 步驟6 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。
7. 一種克隆多倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的方法，所述多倍為大于2的偶數倍，其特征在于，包括如下步驟 步驟I :取限制性核酸內切酶AgeI和BamHI消化pSLFA1180FA質粒，瓊脂糖凝膠電泳回收第一消化產物中的大片段P1，與編碼鏈序列如SEQ IDNO 1所示的DNA分子經T4連接酶連接，獲得單倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆pSL-AYRl ； 步驟2 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第二消化產物中的小片段P2 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述單倍克隆pSL-AYRl，瓊脂糖凝膠電泳回收第三消化產物中的大片段P3;取所述小片段P2與所述大片段P3經T4連接酶連接，獲得雙倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR2 ； 步驟3 :取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述雙倍克隆pSL_AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第四消化產物中的小片段P4 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述雙倍克隆PSL-AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第六消化產物中的大片段P6 ;取所述小片段P4與所述大片段P6經T4連接酶連接，獲得四倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR4 ； 步驟4 :重復步驟3，取限制性核酸內切酶Bglll/EcoRI消化所述四倍克隆pSL_AYR4，瓊脂糖凝膠電泳回收第七消化產物中的小片段P7 ;取限制性核酸內切酶BamHI/EcoRI消化所述雙倍克隆PSL-AYR2，瓊脂糖凝膠電泳回收第六消化產物中的大片段P6;取所述小片段P7與所述大片段P6經T4連接酶連接，獲得六倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因克隆PSL-AYR6 ； 步驟5 :重復步驟4，獲得偶數倍的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列的克隆； 步驟6 :轉化感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、提取質粒、Bglll/BamHI雙酶切、收集小片段即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，特別涉及一種用于克隆來自于野蠶絲素蛋白的含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽(-RGD-)的DNA分子及克隆方法。該克隆方法操作簡單，準確度高；獲得的單倍、雙倍、多倍含精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸的多肽的基因序列結果準確。
文檔編號C12N15/10GK102732525SQ20121022319
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權日2012年6月29日
發(fā)明者盧神州, 李明忠, 楊云星, 王建南, 黃海燕 申請人:蘇州大學