專利名稱：一種頂頭孢霉工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種頂頭孢霉工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C (Cephalosporin C，CPC)是生產(chǎn)頭孢類抗生素重要中間體7_氨基頭孢燒酸(7-ACA)的主要原料。目前,工業(yè)上主要利用頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)發(fā)酵獲得CPC。頭孢菌素C在頂頭孢霉中的生物合成途徑已經(jīng)研究清楚，且頂頭孢霉的遺傳操作系統(tǒng)已經(jīng)成熟，這為利用基因工程手段改造這一重要的工業(yè)真菌奠定了良好基礎(chǔ)。絲狀真菌的次級代謝往往與其體內(nèi)的氧化還原平衡有著一定的聯(lián)系，當(dāng)細(xì)胞處于一定的氧化狀態(tài)時可能更有利于某些次級代謝產(chǎn)物的合成。硫氧還蛋白系統(tǒng)(thioredoxsystem)是存在于絕大多數(shù)生物體中的一類抗氧化系統(tǒng)，具有十分廣泛的功能。硫氧還蛋白 從氧化態(tài)轉(zhuǎn)化成還原態(tài)依賴于硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)的催化作用。因而，TrxR對于胞內(nèi)的氧化還原平衡或某些蛋白分子的氧化還原狀態(tài)具有重要的調(diào)控作用。破壞頂頭孢霉的TrxR編碼基因(TrxR)可能會導(dǎo)致細(xì)胞的氧化壓力增強，并刺激頭孢菌素的生物合成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種頂頭孢霉工程菌的構(gòu)建方法，是抑制頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)得到的頭孢菌素C合成能力高于所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的工程菌菌株。在上述方法中，所述抑制頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)中序列表序列I蛋 白的表達(dá)通過敲除序列表序列I所示蛋白的編碼基因?qū)崿F(xiàn)。在上述方法中，所述敲除序列表序列I所示蛋白的編碼基因通過同源重組的方式進(jìn)行。在上述方法中，所述蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因I)序列表序列2所示的DNA分子；2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子；所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC, 0. 1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5XSSC,0. 1%SDS 中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. I X SSC,0.1%SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65。。，O. 1XSSC,0. 1%SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, O. 1%SDS 和 1XSSC,0. 1%SDS 各洗膜一次。在上述方法中，所述敲除包括將如下DNA片段導(dǎo)入所述頂頭孢霉的步驟5’端連接有序列表序列3所示序列且3’端連接有序列表序列4所示序列的DNA片段。在上述方法中，所述DNA片段是通過重組質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM導(dǎo)入所述頂頭孢霉的，所述重組質(zhì)粒pAg-lActrxRDM是在質(zhì)粒pAgl_H3的SmaI和ApaI的位點間連入序列表序列3所示的DNA片段，在AscI和SwaI的位點間連入序列表序列4所示的DNA片段，和在SwaI的位點處連入序列表序列5的第10-1175位所示的DNA片段。在上述方法中，所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)為頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3.3795。本發(fā)明保護上述任一所述方法獲得的頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)工程·菌菌株，具體可為頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum) ActrxRDM,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6205。頂頭抱霉(Acremoniumchrysogenum) ActrxRDM CGMCC No. 6205 未發(fā)現(xiàn)有性階段，在正常培養(yǎng)條件下菌絲呈絲狀生長，菌絲有隔，菌絲寬3-5 μ m ;生長后期能形成產(chǎn)孢菌絲，產(chǎn)孢菌絲頂端形成分生孢子，分生孢子無隔膜(單核，極少雙核)，分生孢子大小范圍
1.1-1. 3 μ mX3. 2-3. 8 μ m ;該菌可正常利用葡萄糖、鹿糖、甘油等碳源,及蛋白胨、天冬堿、乙酸胺等氮源，最適生長溫度28°C，最適生長pH 6.8 ;在化學(xué)合成培養(yǎng)基(如MMC^PMDFA)中，該菌株的分生孢子不能正常萌發(fā)，菌絲則生長十分緩慢，但培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸后，其生長可恢復(fù)正常；生長后期，該菌株可合成頭孢菌素及黃色素；液體發(fā)酵條件下，菌絲可分化成單細(xì)胞或雙細(xì)胞的節(jié)孢子或節(jié)孢子鏈，甲硫氨酸可促進(jìn)這種形態(tài)分化。本發(fā)明保護所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)工程菌菌株在制備頭孢霉素C中的應(yīng)用。本發(fā)明保護培養(yǎng)所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)工程菌的培養(yǎng)基,即在用于培養(yǎng)頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸。本發(fā)明保護所述重組質(zhì)粒pAg I-ActrxRDM,該質(zhì)?？捎糜谇贸旑^孢霉(Acremonium chrysogenum)基因組上的編碼序列表序列I所示蛋白的基因。保藏說明菌種名稱頂頭孢霉拉丁名Acremonium chrysogenum菌株編號ActrxRDM保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2012年6月12日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 6205本發(fā)明通過基因克隆和序列分析,獲得了頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的硫氧還蛋白還原酶及其編碼基因，并基于硫氧還蛋白還原酶具有催化硫氧還蛋白從氧化態(tài)轉(zhuǎn)化成還原態(tài)的作用，且氧化壓力增強會刺激頂頭孢霉頭孢菌素的生物合成的原理，通過實驗證明敲除了頂頭孢霉中硫氧還蛋白還原酶編碼基因的頂頭孢霉工程菌，其頭孢菌素C的產(chǎn)量與野生型頂頭孢霉相比提高近I倍。本發(fā)明對工業(yè)生產(chǎn)中提高頭孢菌素C的生產(chǎn)效率具有重要的應(yīng)用價值。


圖I為頂頭抱霉(Acremonium chrysogenum)基因ActrxR編碼的蛋白序列與已知的硫氧還蛋白還原酶序列的比對結(jié)果。其中，A. chr代表頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum), P. chr 代表產(chǎn)黃青霉(Penicillium chrysogenum), E. coli 代表大桿菌(Escherichia coli), S. cla 代表帶小棒鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)。
圖2為基因敲除質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM的構(gòu)建過程。圖3為菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子的原理示意圖(A)及擴增產(chǎn)物電泳圖(B)。圖4為甲硫氨酸(Met)對恢復(fù)頂頭孢霉基因工程菌株正常生長的測定。圖5為頂頭孢霉基因工程菌株發(fā)酵液在枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基上的抑菌圈。其中，WT為野生型頂頭孢霉，DM為頂頭孢霉基因工程菌株，PenG (青霉素G)為檢測青霉素類物質(zhì)殘留的對照。圖6為頂頭孢霉基因工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)過程中CPC合成基因的相對表達(dá)量。其中，WT為野生型頂頭孢霉，DM為頂頭孢霉基因工程菌株。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、基因敲除載體pAgl-ActrxRDM的構(gòu)建I、頂頭孢霉硫氧還蛋白還原酶編碼基因ActrxR的獲得分析頂頭抱霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3. 3795的全基因組序列，獲得一個候選的硫氧還蛋白還原酶編碼基因ActrxR (Genbank號JN389793,其序列如序列表序列2所示)。采用Trizol試劑分離頂頭孢霉CGMCC 3. 3795的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以高保真酶(KOD-Plus)和引物trxR-Fl/trxR-Rl進(jìn)行PCR擴增獲得ActrxR的cDNA,并進(jìn)行DNA測序分析，將ActrxR的編碼序列與序列如序列表序列2所示序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)ActrxR的編碼序列被4個內(nèi)含子(其序列分別為序列表序列2的第20-105位、第169-234位、第355-421位和第1122-1210位)間隔開。根據(jù)ActrxR的編碼序列推測得出對應(yīng)的蛋白序列(如序列表序列I所示)，將該蛋白序列與已知的硫氧還蛋白還原酶序列進(jìn)行比對分析，鑒定出ActrxR編碼的蛋白含有硫氧還蛋白還原酶家族的典型保守結(jié)構(gòu)域黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合區(qū)I和II、還原型輔酶II (NADPH)結(jié)合區(qū)以及氧化還原功能結(jié)構(gòu)域(Redox)(如圖I所示),確定ActrxR基因編碼硫氧還蛋白還原酶。上述引物的序列(5'端-3'端)如下t rxR-F I ATGCACAGCAAGGTTGTCAGTA ；trxR-Rl :CTACTCACGGTCGTCGACCTC。2、構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒pAg I-ActrxRDM
以頂頭抱霉(Acremoniumchrysogenum) CGMCC 3. 3795 基因組 DNA 為模板,在高保真酶(KOD-Plus)作用下，分別用引物trxR-LB-F (5’端含SmaI識別序列和保護堿基)/trxR-LB-R (5’端含ApaI識別序列和保護堿基)和trxR-RB-F (5’端含AscI識別序列和保護堿基)/trxR-RB-R (5’端含SwaI識別序列和保護堿基)擴增ActrxR基因的5’端區(qū)域(記為LB，2408bp，其序列見序列表序列3)和3’端區(qū)域(記為RB，2347bp，其序列見序列表序列4)的DNA片段，得到兩端含有限制性內(nèi)切酶識別序列的LB和RB片段，經(jīng)測序驗證正確。將上述擴增得到的LB片段用SmaI和ApaI雙酶切，與經(jīng)SmaI和ApaI雙酶切的質(zhì)粒pAgl_H3 (文獻(xiàn)Zhang, A. , Lu, P. , Dahl-Roshak, A. Μ. , Paress, P. S. , Kennedy, S. , Tkacz, J.S. , An, Z. , 2003. Efficient disruption of a polyketide synthase gene (pks I)required for melanin synthesis through Agrobacterium-mediated transformation ofGlarea lozoyensis. Mol Gen Genomics 268, 645-655.公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)的骨架片段連接，獲得中間載體；將上述擴增得到的RB片段用AscI和SwaI雙酶切， 與經(jīng)AscI和SwaI雙酶切的上述中間載體的骨架片段連接，獲得載體pAgl-Ι ；以質(zhì)粒pUC43為模板，用引物ble-F (5’端含SwaI識別序列和保護堿基)/ble_R (5’端含SwaI識別序列和保護堿基)擴增得到I. Ikb的兩端含SwaI識別序列的博萊霉素抗性表達(dá)框(ble)(序列如序列表序列5所示)，將該表達(dá)框用SwaI酶切，與經(jīng)SwaI酶切的載體pAgl_l的線性片段相連，獲得基因敲除質(zhì)粒pAg I-ActrxRDM,經(jīng)測序驗證正確，即基因敲除質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM是在質(zhì)粒pAgl-H3的SmaI和ApaI位點間插入了 LB片段,在AscI和SwaI位點間插入了 RB片段，且在SwaI位點處插入了序列表序列5的第10-1175位所示的博萊霉素抗性表達(dá)框(ble)?；蚯贸|(zhì)粒pAgl-ActrxRDM的構(gòu)建過程如圖2所示。上述引物序列(5'端-3'端，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶識別序列)如下trxR-LB-F CCCCCGGGCGCCAAGTCTCGCCTTATGA ；trxR-LB-R GGGGGCCCTATGGTGCTGGGCTGGGTAG ；trxR-RB-F AGGCGCGCCGGAAGAGTCTCGGCTGATTG ；trxR-RB-R GATTTAAATCCTGACGCCCACCTTTAT ；ble-F GATTTAAATCGAGGTCGACATGGATACCCT ；ble-R GATTTAAATGTCGGTCAGTCCTGCTCCTC。實施例2、基因敲除質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌取I P g 質(zhì)粒 pAgl-ActrxRDM 的 DNA 加入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) AGL-1 (文獻(xiàn)Mul I ins, E. D. , Chen, X. , Romaine, P. , Raina, R. , Geiser,D.Μ.,Kang,S.,2001.Agrobacterium-mediated transformation of Fusariumoxysporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology. 91:173-180.公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得)的感受態(tài)細(xì)胞中混勻，放入液氮中5分鐘。取出，立即在42°C熱激2分鐘后加入700 μ L LB液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng)2小時。將菌液均勻涂布在含有75 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂平板上，28°C倒置培養(yǎng)2天，得到含有重組質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM的根癌農(nóng)桿菌單菌落。實施例3、構(gòu)建敲除ActrxR基因的頂頭孢霉基因工程菌株
I、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化及菌株的初步抗性篩選將實施例2獲得的含有重組質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于5mLMM液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)2天，用頂培養(yǎng)基將菌體稀釋到D_=0. 15，28 °C振蕩培養(yǎng)6小時,至OD6qq=O. 6,取100 μ L菌液與等體積的頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)CGMCC 3. 3795孢子懸液混合(懸液濃度=2 X IO7個孢子/mL)，均勻涂布在CM瓊脂平板(鋪有玻璃紙)上，25 °C正置共培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)菌體轉(zhuǎn)接至含有50 μ g/mL潮霉素B和200 μ g/mL噻孢霉素鈉的TSA瓊脂平板上，28°C倒置培養(yǎng)5_7天至含有潮霉素B抗性基因的轉(zhuǎn)化子長出。將獲得的轉(zhuǎn)化子編號并接種到含10 μ g/mL博萊霉素的TSA平板上，篩選博萊霉素抗性敏感而具有潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化子。2、菌落PCR篩選敲除ActrxR基因的頂頭孢霉基因工程菌株將步驟I獲得的博萊霉素抗性敏感而具有潮霉素B抗性的轉(zhuǎn)化子分別進(jìn)行如下兩個PCR反應(yīng)
PCRl (圖3A):根據(jù)ActrxR和hph (潮霉素抗性基因)兩端的LB和RB序列設(shè)計引物DI_F/DI_R，目的產(chǎn)物分別為2. 3kb和2. 7kb ；PCR2 (圖3A):根據(jù)ActrxR上的一段基因組DNA序列設(shè)計引物Trx_q_f/Trx_q_r,目的產(chǎn)物為127bp ；同時以質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM(P)、未經(jīng)轉(zhuǎn)化的頂頭抱霉(Acremoniumchrysogenum)CGMCC 3. 3795菌株(WT)和無菌水(NC)為對照，PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果如圖3B所示。圖3B 中，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的頂頭抱霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3. 3795 菌株(WT)在PCRl中得到2. 3kb的一條帶，且PCR2中有127bp的一條帶的菌株；質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM (P)在PCRl中得到2. 7kb的一條帶；無菌水(NC)在兩個PCR反應(yīng)中均無擴增條帶；PCR1得到2. 7kb的一條帶，且PCR2未得到127bp的一條帶的菌株為敲除ActrxR基因的頂頭孢霉基因工程菌株(DM) ；PCR1得到2. 3kb和2. 7kb兩條帶，且PCR2得到127bp的一條帶的菌株為發(fā)生單交換未敲除ActrxR基因頂頭孢霉轉(zhuǎn)化子(Tl)。上述引物序列(5'端-3'端)如下DI_F CTCATCACGCCAACGCTTAGT (對應(yīng)于序列表序列 3 的第 2217-2237 位)；DI_R GACCTGTCCAAGTGGCGAGA (對應(yīng)于序列表序列 4 的第 92-73 位)；Trx_q_f TACGGGTAAGGAGGAGGTGGTC (對應(yīng)于序列表序列 2 的第 912-933 位)；Trx_q_r GCCAGGCTTGGTGATGATGTAG (對應(yīng)于序列表序列 2 的第 1038-1017 位)。上述培養(yǎng)基的配方如下TSA培養(yǎng)基(IOOOmL):胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，葡萄糖2. 5g，NaC15g，K2HPO4 · 3H20 2. 5g，瓊脂 15g, ρΗ7· 0。表I. MM、頂和CM培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)工程菌的構(gòu)建方法，是抑制頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)中序列表序列I所示蛋白的表達(dá)得到的頭孢菌素C合成能力高于所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的工程菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述抑制頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)中序列表序列I所不蛋白的表達(dá)通過敲除序列表序列I所不蛋白的編碼基因?qū)崿F(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于序列表序列I所示蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)的基因 1)序列表序列2所不的DNA分子； 2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼序列表序列I所示蛋白的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述敲除包括將如下DNA片段導(dǎo)入所述頂頭孢霉的步驟5’端連接有序列表序列3所示序列且3’端連接有序列表序列4所示序列的DNA片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段是通過重組質(zhì)粒pAgI-ActrxRDM導(dǎo)入所述頂頭孢霉的,所述重組質(zhì)粒pAg-lActrxRDM是在質(zhì)粒pAgl_H3的SmaI和ApaI的位點間連入序列表序列3所示的DNA片段,在AscI和SwaI的位點間連入序列表序列4所示的DNA片段，和在SwaI的位點處連入序列表序列5的第10-1175位所示的DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于所述頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)為頂頭抱霉(Acremonium chrysogenum) CGMCC 3.3795。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述方法獲得的頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)工程菌菌株，具體為頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum) ActrxRDM,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6205。
8.權(quán)利要求7所述頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)工程菌菌株在制備頭孢菌素C中的應(yīng)用。
9.培養(yǎng)權(quán)利要求7所述頂頭孢霉(Acremoniumchrysogenum)工程菌菌株的培養(yǎng)基,其特征在于在用于培養(yǎng)頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的培養(yǎng)基中添加甲硫氨酸。
10.權(quán)利要求5所述方法中的所述重組質(zhì)粒pAgl-ActrxRDM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種頂頭孢霉工程菌及其構(gòu)建方法。該方法是抑制頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)中序列表序列1蛋白的表達(dá)得到的頭孢菌素C合成能力高于所述頂頭孢霉(Acremonium chrysogenum)的菌株。實驗證明敲除了頂頭孢霉中硫氧還蛋白還原酶編碼基因的頂頭孢霉工程菌，其頭孢菌素C產(chǎn)量與野生型頂頭孢霉相比提高近1倍。本發(fā)明對提高頭孢菌素C的生產(chǎn)效率具有重要應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/80GK102719473SQ20121022218
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者劉莉, 劉鋼, 龍良鯤 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所