專利名稱：地頂孢霉及分離培養(yǎng)方法和發(fā)酵工藝方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種真菌及培養(yǎng)方法，確切地說是一種中國新記錄蟲草菌種地頂孢霉(Acremonium terricola、CGMCC0346)及分離培養(yǎng)方法和發(fā)酵工藝方法。
在21世紀的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中，生物多樣性的合理開發(fā)利用對支持社會經濟發(fā)展極為重要。目前，生物多樣性的保護受到空前重視，世界各國投入了大量的人力物力，致力于生物多樣性的研究和保護工作。在生物多樣性的研究和利用中，微生物的生物多樣性在目前尚研究得不夠，但卻又非常重要的研究領域。其中，真菌的物種多樣性又更是“重”中之“重”。因為，真菌是很多制藥工業(yè)、食品工業(yè)的“原料庫”、“基因庫”。近年來，美、英、日等發(fā)達國家有遠見的藥物學家和制藥公司都已將注意力從放線菌等轉移到真菌上來，其中“蟲草”又因其獨有的藥理價值，更引人“矚目”。
蟲草類資源開發(fā)，不僅有重要的社會價值，而且有可觀的經濟效益。由于不同的蟲草含有不同的生物活性物質，且藥理作用不同，因而一種新蟲草菌種的發(fā)現，往往意味著一種新的生物產品的產生。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有食品、藥品開發(fā)用途的中國新記錄微生物純培養(yǎng)物——地頂孢霉及其分離培養(yǎng)方法和發(fā)酵工藝方法。
所述發(fā)明目的是通過下述方案實現的。
CGMCC0346是從采自安徽祁門牯牛降自然保護區(qū)的古尼蟲草小孢變種[Cordyceps gunnii var.minor]的內菌核被感染的昆蟲蟲體上分離出的一株產生孢梗束的絲孢菌，在中國屬首次發(fā)現。
1、CGMCC0346為中國新記錄種，其特征在于A、在MA培養(yǎng)基上，CGMCC0346的培養(yǎng)形態(tài)為25℃培養(yǎng)10天，菌落圓形，直徑13～21mm，白色，中部粉狀，邊緣絨狀，有時形成孢梗束，背面淡黃棕色；B、在察氏培養(yǎng)基上，CGMCC0346的培養(yǎng)形態(tài)為25℃培養(yǎng)10天，菌落園形，直徑21～22mm，形成孢梗束，白色，邊緣淡紅色，背面奶油色至赭黃色。其顯微形態(tài)為菌絲無色，光滑、具隔膜，寬1.5μm；瓶梗直接從菌絲上長出，錐形，多單生，10.8～19.8×1.8～2.9μm；分生孢子無色、光滑，形成干燥的鏈，長紡錘形，兩端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，長徑比(L/D)3～3.5。
上述的CGMCC0346，其特征在于所述的MA培養(yǎng)基為麥芽汁30g，瓊脂15g，水1000ml。
上述的CGMCC0346，其特征在于上述的察氏培養(yǎng)基為NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000ml。
2、一種分離培養(yǎng)CGMCC0346的方法，其特征在于2.1、在超凈工作臺中，在無菌條件下，用無菌水將長有蟲草子座的新鮮蟲尸沖洗三次；2.2、用無菌手術刀片將長有蟲草子座的新鮮蟲尸小心切開，在此操作過程中不要碰破昆蟲背血管；2.3、從切開部位內，取出小米粒大小的蟲尸塊，接種于滅菌的SDAY培養(yǎng)基平皿上；2.4、將接種后的培養(yǎng)基平皿置于18℃光照培養(yǎng)箱的自然光下培養(yǎng)14～16天；2.5、待長出菌落后，用接種針取少量菌絲轉接于另一SDAY培養(yǎng)基平皿中；2.6、將轉接后的培養(yǎng)基平皿置于18℃光照培養(yǎng)箱的自然光下培養(yǎng)，直至長出單一純化的菌落；2.7、將純化的菌種點植于滅菌的、直徑為9cm、每皿具有15ml MA培養(yǎng)基液的平皿上，25℃培養(yǎng)10天；或將純化的菌種點植于滅菌的、具有察氏培養(yǎng)基液的平皿上，25℃培養(yǎng)10天。
一種分離培養(yǎng)CGMCC0346的方法，其特征在于所述的SDAY培養(yǎng)基，為葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，瓊脂20g，水1000ml。
一種分離培養(yǎng)CGMCC0346的方法，其特征在于所述的MA培養(yǎng)基為芽汁30g，瓊脂15g，水1000ml。
一種分離培養(yǎng)CGMCC0346的方法，其特征在于所述的察氏培養(yǎng)基為NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000ml。
3、一種地頂孢霉的發(fā)酵工藝方法，其特征在于3.1、將純化的菌種接種于SDAY培養(yǎng)基斜面，24～26℃下培養(yǎng)7天，待產生大量的孢梗束后，即可作為液體搖瓶菌種；
3.2、將上述二支斜面菌種接種到一只內裝液體培養(yǎng)基200ml的500ml三角瓶內，接種量5～10％，在24～26℃下，置于旋轉式搖床上150～160r/m振蕩培養(yǎng)24～26小時，即得到一級種子罐的液體種子；3.3、在50升塔板式發(fā)酵罐內加入液體培養(yǎng)基30升，并加入0.03％消泡劑泡敵，在14.71×104Pa壓力下，保壓30分鐘，消毒冷卻后，在24～26℃將搖瓶種子接入培養(yǎng)，通氣量1∶0.5，并在4.903～7.0845×104Pa下保壓，并經48～60小時通氣培養(yǎng)。
一種CGMCC0346的發(fā)酵工藝方法，其特征在于所述的SDAY培養(yǎng)基為葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，瓊脂20g，水1000ml。
一種CGMCC0346的發(fā)酵工藝方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基為白砂糖1.5％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％，且PH6.0-7.0。
一種CGMCC0346的發(fā)酵工藝方法，其特征在于發(fā)酵罐內的液體培養(yǎng)基為白砂糖2.0％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水94.5％。
本發(fā)明的菌種已按專利法實施細則第二十五條的規(guī)定在國家知識產權局專利局指定的保藏單位——中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期1998年4月22日，保藏號CGMCC0346，并附具存活性報告書。
該菌種已用于工業(yè)發(fā)酵生產。利用該菌種生產的菌絲體膠囊，經江蘇省衛(wèi)生防疫站所作的功能測定，具有明顯的免疫功能(細胞免疫、體液免疫、單核巨噬細胞吞噬功能)，符合保健食品的免疫功能學評價標準。經安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所測定，其菌絲體亦有抗風濕作用。由其發(fā)酵液中提取的胞外多糖，經安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所測定，有明顯的抗肝炎作用。在用果蠅所作的抗衰老試驗中，能明顯延長果蠅壽命，表現出極好的抗衰老作用。有開發(fā)為保健食品和藥品的可能性。
下面對本發(fā)明作進一步地說明。
該菌由Miller于1957年首次分離自土壤，并將其歸于Fusidium屬中，定名為Fusidium terricola Miller，Giddens Foster。1967年Onions等將其改名為Paecilomyces terricola(Miller et al.)Onions Barron。1971年Gams將之轉屬到頂孢霉屬(Acremonium)中，并定名為Acremonium terricola(Miller et al.)Gams。
Miller于1957年發(fā)表新種時的原始描述為在MA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)10天，菌落直徑12～22mm，正面粉狀，白色，背面黃褐色。菌絲聚集為孢梗束，菌絲無色，瓶梗多數單生，纖細，錐形，12～20～(25)×1.2～2.0μm，頂部0.5～1.0μm，分生孢子形成干燥的長鏈，無色，光滑，長紡錘形，兩端尖，3.8～5.4～(6.0)×0.9～1.5μm，L/D 2.8～5.0。
本次發(fā)現的CGMCC0346屬中國新記錄種。菌種的鑒定及新記錄種的確定，主要根據其培養(yǎng)特性和顯微形態(tài)參考有關分類文獻確定。
該中國新記錄種CGMCC0346的培養(yǎng)特性將純化的菌種點植于滅菌(1.5Kg/cm230分鐘)的MA培養(yǎng)基平皿上，25℃培養(yǎng)10天；菌落圓形，直徑13～21mm，白色，中部粉狀，邊緣絨狀，有時形成孢梗束，背面淡黃棕色。所述的MA培養(yǎng)基為麥芽汁30g、瓊脂15g、水1000ml，所述的平皿為直徑9cm的培養(yǎng)皿，每皿15ml培養(yǎng)基。將純化的菌種點植于滅菌的察氏培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)10天菌落圓形，直徑21～22mm，形成孢梗束，白色，邊緣淡紅色，背面奶油色至赭黃色。菌絲無色，光滑、具隔膜，寬1.5μm。瓶梗直接從菌絲上長出，錐形，多單生，10.8～19.8×1.8～2.9μm。分生孢子無色、光滑，形成干燥的鏈，長紡錘形，兩端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，長徑比(L/D)3～3.5。
CGMCC0346的分離培養(yǎng)條件為在超凈工作臺中，用無菌手術刀片將用無菌水沖洗三次的長有蟲草子座的新鮮蟲尸小心切開，在此操作過程中注意不要碰破昆蟲背血管，取出小米粒大小的蟲尸塊，接種于滅菌(1.5Kg/cm30分鐘)的SDAY培養(yǎng)基平皿上，置于18℃光照培養(yǎng)箱(自然光下)培養(yǎng)15天，待長出菌落后用接種針挑取少量菌絲轉接于另一平皿中(SDAY培養(yǎng)基)同上法培養(yǎng)，直至長出單一純化的菌落為止。所述的SDAY培養(yǎng)基為葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，瓊脂20g，水1000ml；所述的平皿為直徑9cm，每皿15ml培養(yǎng)基。
CGMCC0346的發(fā)酵工藝方法分為三步，一是一級斜面菌種培養(yǎng)；二是液體種子培養(yǎng)；三是發(fā)酵罐培養(yǎng)。下面分步進行說明1、一級斜面菌種培養(yǎng)將保藏菌種接種于SDAY培養(yǎng)基斜面，24～26℃下培養(yǎng)7天，待產生大量孢梗束后，即可作為液體搖瓶菌種。所述的SDAY培養(yǎng)基為葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，瓊脂20g，水1000ml。
2、液體種子培養(yǎng)用二支斜面菌種接一只內裝液體培養(yǎng)基200ml的500ml三角瓶，接種量5～10％，24～26℃下，置于旋轉式搖床(160r/m)上振蕩培養(yǎng)24～36小時，即可作為一級種子罐的液體種子。所述的液體培養(yǎng)基為白砂糖1.5％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％；其pH值為6.0～7.0。
3、發(fā)酵罐培養(yǎng)50升塔板式發(fā)酵罐，以培養(yǎng)30升液體菌種計算，在發(fā)酵罐內加入白砂糖2.％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，接著加入水95.5％，水溫大于等于95℃，并加入消泡劑泡敵如聚氧乙烯氧丙烯甘油，用量為0.03％，攪拌均勻。在14.71×104Pa壓力下，保壓30min，消毒冷卻至24～26℃，將搖瓶種子接入培養(yǎng)，通氣量1∶0.5，在4.903～7.0845×104Pa下保壓，經48～60小時通氣培養(yǎng)，菌絲大量生長并開始產孢即可放罐。
權利要求
1.地頂孢霉(Acremonium terricola、CGMCC0346)，為中國新記錄種，其特征在于A、在MA培養(yǎng)基上，CGMCC0346的顯微形態(tài)為菌落圓形，直徑13～21mm，白色，中部粉狀，邊緣絨狀，有時形成孢梗束，背面淡黃棕色；B、在察氏培養(yǎng)基上，CGMCC0346的顯微形態(tài)為直徑21～22mm，形成孢梗束，白色，邊緣淡紅色，背面奶油色至赭黃色；菌絲無色，光滑、具隔膜，寬1.5μm；瓶梗直接從菌絲上長出，錐形，多單生，10.8～19.8×1.8～2.9μm；分生孢子無色、光滑，形成干燥的鏈，長紡錘形，兩端尖，3.6～5.8×0.9～1.4μm，長徑比(L/D)3～3.5。
2.一種分離培養(yǎng)地頂孢霉的方法，其特征在于2.1、在超凈工作臺中，在無菌條件下，用無菌水將長有蟲草子座的新鮮蟲尸沖洗三次；2.2、用無菌手術刀片將長有蟲草子座的新鮮蟲尸小心切開，在此操作過程中不要碰破昆蟲背血管；2.3、從切開部位內，取出小米粒大小的蟲尸塊，接種于滅菌的SDAY培養(yǎng)基平皿上；2.4、將接種后的培養(yǎng)基平皿置于18℃光照培養(yǎng)箱的自然光下培養(yǎng)14～16天；2.5、待長出菌落后，用接種針取少量菌絲轉接于另一SDAY培養(yǎng)基平皿中；2.6、將轉接后的培養(yǎng)基平皿置于18℃光照培養(yǎng)箱的自然光下培養(yǎng)，直至長出單一純化的菌落；2.7、將純化的菌種點植于滅菌的、直徑為9cm、每皿具有15ml MA培養(yǎng)基的平皿上，25℃培養(yǎng)10天；或將純化的菌種點植于滅菌的、具有察氏培養(yǎng)基的平皿上，25℃培養(yǎng)10天。
3.根據權利要求2所述的一種分離培養(yǎng)地頂孢霉的方法，其特征在于所述的SDAY培養(yǎng)基為葡萄糖40g，蛋白胨10g，酵母浸出粉10g，瓊脂20g，水1000ml。
4.根據權利要求2所述的一種分離培養(yǎng)地頂孢霉的方法，其特征在于所述的MA培養(yǎng)基為麥芽汁30g、瓊脂15g、水1000ml。
5.根據權利要求2所述的一種分離培養(yǎng)地頂孢霉的方法，其特征在于所述的察氏培養(yǎng)基為NaNO32g，K2HPO32g，KCL 0.5g，MgSO44g，FeSO40.01g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000ml。
6.一種地頂孢霉的發(fā)酵工藝方法，其特征在于6.1、將純化的菌種接種于SDAY培養(yǎng)基斜面，在24～26℃下培養(yǎng)7天，待產生大量的孢梗束后，即可作為液體搖瓶菌種；6.2、將上述二支斜面菌種接種到一只內裝液體培養(yǎng)基200ml的500ml三角瓶內，接種量5～10％，在24～26℃下，置于旋轉式搖床上150～160r/m振蕩培養(yǎng)24～26小時，即得到一級種子罐的液體種子；6.3、在50升塔板式發(fā)酵罐內加入液體培養(yǎng)基30升，并加入0.03％消泡劑泡敵， 在14.71×104Pa壓力下，保壓30分鐘，消毒冷卻后，在24～26℃將搖瓶種子接入培養(yǎng)，通氣量1∶0.5，并在4.903～7.0845×104Pa下保壓，并經48～60小時通氣培養(yǎng)。
7.根據權利要求6所述的一種地頂孢霉的發(fā)酵工藝方法，其特征在于所述的SDAY培養(yǎng)基為葡萄糖40g，酵母浸出粉10g，蛋白胨10g，瓊脂20g，水1000ml。
8.根據權利要求6所述的一種地頂孢霉的發(fā)酵工藝方法，其特征在于所述三角瓶內的液體培養(yǎng)基為白砂糖1.5％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水95％，且pH值6.0-7.0。
9.根據權利要求6所述的一種地頂孢霉的發(fā)酵工藝方法，其特征在于發(fā)酵罐內的液體培養(yǎng)基為白砂糖2.0％，蠶蛹粉2.5％，酵母粉1.0％，水94.5％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌及分離培養(yǎng)方法和發(fā)酵工藝方法,確切地說是一種中國新記錄種——地頂孢霉及分離培養(yǎng)方法和發(fā)酵工藝方法。其特征在于:在MA培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)10天即得,在察氏培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)10天,也可得到;其分離培養(yǎng)方法的特征在于:從蟲草子座的新鮮蟲尸上取出蟲尸塊,接種于SDAY培養(yǎng)基上,在18℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待長出菌落后再進行轉接,直至長出單一純化的菌落;其發(fā)酵工藝方法為三級擴大培養(yǎng),一是一級斜面菌種培養(yǎng),二是液體種子培養(yǎng),三是發(fā)酵罐培養(yǎng)。該發(fā)明在食品和藥品的開發(fā)利用方面有廣闊前景。
文檔編號A61P1/16GK1259570SQ9911452
公開日2000年7月12日 申請日期1999年10月27日 優(yōu)先權日1999年10月27日
發(fā)明者樊美珍, 李春如 申請人:樊美珍, 李春如