專利名稱：骨形成蛋白-2的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2 ；BMP-2)的制備方法，特別地，本發(fā)明涉及藉由改變培養(yǎng)基成分來増加骨形成蛋白_2的產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
骨形成蛋白，簡稱BMPs，為骨基質(zhì)中的糖蛋白聚勝肽，其包含雙硫鍵結(jié)構(gòu)。骨形成蛋白的分子量介于26，000-32，000，屬于生長因子家族，且彼此具有類似的結(jié)構(gòu)及功能。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)43種骨形成蛋白。骨形成蛋白為ー種區(qū)域性的生長因子，可単獨(dú)促進(jìn)骨組織的形成，促使未分化間葉細(xì)胞(mesenchymal cells)進(jìn)入軟骨及骨。骨形成蛋白具有各種促進(jìn)骨生成的能力。

BMPs的能力不限于骨生成，在其它組織，例如腦及腎臟也可發(fā)現(xiàn)高濃度的BMPs。已有相關(guān)文獻(xiàn)揭露BMPs在發(fā)生及分化上可能也扮演重要的角色(Wall，N.A. , Blessing, M. , Wright, C. V. E. , and Hogan, B. L. M. , J Cell Biol.，120:493-502 (1993);Ozkaynak, E. , Schnegelsberg, P. N. J. , Jin, D. F. , Clifford, G. M. , Warren, F. D. , Drier, E.A. , and Oppermann, H. , J. Biol. Chem. , 267: 25220-25227 (1992) ; Lyons, K. M. , Jones, C.M. , and Hogan, B. L. M. , Trends in Genetics, 7:408-412 (1991))。目前，BMPs 已被證實(shí)可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化(Basler, K. , Edlund, T. , Jessell, T. M. , and Yamada, T. , Cell, 73:687-702(1993) ;Paralkar, V. M. , Weeks, B. S. , Yu, Y. M. , Kleinman, H. K.，and Reddi1A. H.，J. CellBiol.，119:1721-1728(1992))。在整個(gè)BMP家族中，BMP-2具有廣泛的骨生成能力，且被研究的最為透徹。具有骨生成活性的重組人類BMP-2已被證明具有安全性，可應(yīng)用于骨的治療及再生。BMP-2的應(yīng)用對(duì)傳統(tǒng)骨科、整型外科、牙周和顱面重建手術(shù)產(chǎn)生重大的影響。目前獲得BMP-2的方法主要有ニ種，分別為由脫I丐皮質(zhì)骨(demineralized cortical bone)萃取BMP-2蛋白，和利用表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組BMP-2蛋白。由骨組織分離BMP-2蛋白的方法需要大量的骨組織且產(chǎn)量非常低，每40kg的牛骨粉僅可獲得約 40 ii g 的 BMP 混合物(ffozney etal.，Science 242 (1988)，1528-1534)。再者，若由人骨組織分離BMP-2蛋白，會(huì)產(chǎn)生道徳上的問題，且會(huì)有致病源污染的風(fēng)險(xiǎn)(賈庫氏癥、HCV等)。同樣，由豬或牛分離BMP同源蛋白也會(huì)產(chǎn)生類似的污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前主要是通過表達(dá)重組BMP-2來獲得BMP-2蛋白，表達(dá)方法包括真核表達(dá)系統(tǒng)及原核表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)為操作簡單、成本低，且可獲得較高的產(chǎn)量。相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)，原核細(xì)胞無法表達(dá)正確的BMP-2前驅(qū)物，因此難以形成成熟的BMP-2蛋白。真核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)為需要較高的技術(shù)且產(chǎn)量較低。雖然真核表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生具活性的BMP-2蛋白，但真核表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量極低。先前有文獻(xiàn)指出添加低分子量(5，OOOMw)及高分子量(500，OOOMw)的硫酸葡聚糖可增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量，但其產(chǎn)量仍顯不足。因此業(yè)界亟需ー種可增加BMP產(chǎn)量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了ー種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的細(xì)胞株，將該細(xì)胞株培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其中所述培養(yǎng)基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合所附圖示，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。


圖I顯示硫酸葡聚糖分子量與濃度對(duì)BMP-2蛋白產(chǎn)量的影響。圖2顯示分子量為6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖濃度對(duì)BMP-2蛋白
產(chǎn)量的影響。圖3a顯示肌肽濃度(10-30mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。圖3b顯示肌肽濃度(10-30mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖3c顯示肌肽濃度(10-30mM)對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響。圖4a顯示肌肽濃度(30_50mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。圖4b顯示肌肽濃度(30_50mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖4c顯示肌肽濃度(30-50mM)對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響。圖5a顯示硫酸葡聚糖(100-500 ii g/ml)與肌肽(30mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。圖5b顯示硫酸葡聚糖(100-500 u g/ml)與肌肽(30mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖5c顯示硫酸葡聚糖(100-500 U g/ml)與肌肽(30mM)對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響。圖6a顯示硫酸葡聚糖(500 U g/ml)與肌肽(10-30mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。圖6b顯示硫酸葡聚糖(500li g/ml)與肌肽(10_30mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖6c顯示硫酸葡聚糖(500 u g/ml)與肌肽(10-30mM)對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響。圖7a顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。圖7b顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖7c顯示丙氨酸與組氨酸(10-50mM)對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響。圖7d顯示丙氨酸與組氨酸(100-200mM)對(duì)細(xì)胞存活的影響。圖7e顯示丙氨酸與組氨酸(100-200mM)對(duì)細(xì)胞密度的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供ー種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白_2基因的細(xì)胞株，將此細(xì)胞株于適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其中所述培養(yǎng)基包含硫酸葡聚糖和/或肌肽。本發(fā)明所述“細(xì)胞株”指任何用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞株，包括動(dòng)物細(xì)胞、低等真核生物或原核生物，優(yōu)選動(dòng)物細(xì)胞。所述動(dòng)物細(xì)胞包括，但不限于，猴COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、人類腎臟293細(xì)胞、人類表皮A431細(xì)胞、人類Colo205細(xì)胞、3T3細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、其它經(jīng)轉(zhuǎn)殖的靈長類細(xì)胞、正常的雙套細(xì)胞、由體外培養(yǎng)的原生組織衍生的細(xì)胞株、原生移殖體、HeLa細(xì)胞、老鼠し細(xì)胞、8皿、1-60、現(xiàn)37、他1(、？61^6、勵(lì)5或11^1 ^細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞株優(yōu)選CHO細(xì)胞。所述細(xì)胞株中具有骨形成蛋白_2(以下簡稱BMP-2)基因，所述BMP-2基因可為所述細(xì)胞自源性的BMP-2基因，也可為轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)的外源性BMP-2基因或重組BMP-2基因。BMP-2基因可來自人類或非人類動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔子或駱駝等)。在ー個(gè)實(shí)施方式中，所述BMP-2基因?yàn)槿祟怋MP-2基因，并將此BMP-2基因轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。本發(fā)明中所述的“適當(dāng)條件”指可促進(jìn)細(xì)胞存活、細(xì)胞生長和/或特定物質(zhì)表達(dá)的條件。所述適當(dāng)條件可為一般的細(xì)胞培養(yǎng)條件，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可依照不同的需求而選擇不同的培養(yǎng)條件。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述適當(dāng)條件為動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件，優(yōu)選CHO細(xì)胞的培養(yǎng)條件。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述適當(dāng)條件可為37°C下，含3%至10%C02及5%至7%02的潮濕空氣。本發(fā)明中所述的培養(yǎng)基特別為用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明使用的細(xì)胞培養(yǎng)基并無特別限制，其可為任何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基。所述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括含血清培養(yǎng)基 以及不含動(dòng)物成分的培養(yǎng)基，例如，無血清培養(yǎng)基、無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基及其類似物。在本發(fā)明中優(yōu)選使用無血清或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基，例如，RPMI 1640培養(yǎng)基、Eagle' sMEM培養(yǎng)基、Dulbecco' s modified MEM(DMEM)培養(yǎng)基、199 培養(yǎng)基、F12 培養(yǎng)基、Iscove' s modifiedDulbecco' s 培養(yǎng)基(頂DM)、EX_CELL 302 培養(yǎng)基、EX-CELL -CD-CH0 及 EX-CELL 325 培養(yǎng)基、CHO培養(yǎng)基、CD-CH0 培養(yǎng)基、CD Opti CH0 培養(yǎng)基、CD FortiCHO 培養(yǎng)基、BD CHO培養(yǎng)基、及⑶DG 44 培養(yǎng)基、IS⑶-CH0 培養(yǎng)基及Ultra CH0 培養(yǎng)基，或上述經(jīng)修飾、混合或濃縮的培養(yǎng)基，及其類似物，更優(yōu)選DMEM培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基、CD Opti CH0 培養(yǎng)基、CD FortiCHO 培養(yǎng)基、Ultra CH0 培養(yǎng)基或其類似物。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，可加入硫酸葡聚糖(Dextran sulfate)以增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量。所使用的硫酸葡聚糖并無特別限制，其分子量可介于5，000至500，OOOMw之間，優(yōu)選介于6，500至12，OOOMw之間，或8，000至10，OOOMw之間。硫酸葡聚糖的添加量并無特別限制，原則上硫酸葡聚糖濃度與BMP-2蛋白的產(chǎn)量具有濃度依賴性(dose dependent)，換言之，BMP-2蛋白的產(chǎn)量會(huì)隨著硫酸葡聚糖濃度的增加而增加。培養(yǎng)基中硫酸葡聚糖的濃度可為約0. Iy g/ml以上，優(yōu)選為約IOy g/ml以上，更優(yōu)選為約200 u g/ml以上，最優(yōu)選介于約500至約1，000 u g/ml之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，硫酸葡聚糖可將BMP-2蛋白的產(chǎn)量增加I倍以上，優(yōu)選為1-5倍。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，亦可加入肌肽(Carnosine，C9H14N403)。肌肽為N-3 -Alanyl-L-histidine，其為由P -丙氨酸和組氨酸組成的肽。肌肽為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的氮源，可作為組氨酸的來源，在緊迫時(shí)可有助于組氨酸的合成。肌肽存在于哺乳動(dòng)物的心臟和骨骼肌肉組織，受緊迫(例如，骨折，感染)的動(dòng)物會(huì)消耗心臟的肌肽。受緊迫(敗血癥)時(shí)，會(huì)降低心臟的收縮。本發(fā)明中所使用的肌肽可為一般的市售肌肽，優(yōu)選為左旋肌肽。由于高濃度的肌肽會(huì)抑制細(xì)胞生長，因此最好在不影響細(xì)胞存活的條件下，選擇肌肽的添加量。一般來說，肌肽的濃度可為約50mM以下，優(yōu)選為約40mM以下，更優(yōu)選為約10 至約 30mM。相較于單獨(dú)使用硫酸葡聚糖或肌肽，同時(shí)加入硫酸葡聚糖與肌肽更可提升BMP-2
的產(chǎn)量。
在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)培養(yǎng)基中肌肽的濃度為10至30mM，且硫酸葡聚糖(6，500至12，OOOMw)的濃度介于500至1，000 u g/ml時(shí)，可獲得最大的BMP-2產(chǎn)量。相較于對(duì)照組(不含肌肽與硫酸葡聚糖)，當(dāng)培養(yǎng)基中具有30mM肌肽或500 U g/ml硫酸葡聚糖吋，BMP-2的產(chǎn)量皆可增加1-2倍，然而，當(dāng)培養(yǎng)基同時(shí)具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖時(shí)，BMP-2的產(chǎn)量可增加5_7倍。相較于30mM的肌肽，當(dāng)培養(yǎng)基同時(shí)具有30mM肌肽和500 U g/ml硫酸葡聚糖時(shí)，BMP-2的產(chǎn)量可增加約2-3倍。相較于500 U g/ml的硫酸葡聚糖(8，OOOMw)，當(dāng)培養(yǎng)基同時(shí)具有30mM肌肽和500 u g/ml硫酸葡聚糖時(shí)，BMP-2的產(chǎn)量可增加約2_3倍。一般來說，BMP-2的產(chǎn)量可為約10mg/L至200mg/L。另ー方面，由于高濃度的丙氨酸與組氨酸會(huì)抑制細(xì)胞生長，若培養(yǎng)基中含有高濃 度的丙氨酸及/或組氨酸，會(huì)造成細(xì)胞死亡，因此丙氨酸及/或組氨酸的濃度小于約200mM，優(yōu)選為約IOOmM以下，更優(yōu)選為約50mM以下。實(shí)施例I.宿主表達(dá)細(xì)胞本實(shí)施例的宿主表達(dá)細(xì)胞使用缺少ニ氫葉酸還原酶的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0dfhr-)，其購買自臺(tái)灣食品エ業(yè)發(fā)展研究所的生物資源保存及研究中心(CCRC，60133)。將 CHO dfhr-細(xì)胞培養(yǎng)于 IMDM 培養(yǎng)基(Isocoves Modified DulbeccoJ s MediumIMDM; GibcoCat. 12200-36)中，其中含有 10% 的胎牛血清(Gibco Cat. 10091148)、次黃嘌呤與胸腺嘧啶(Gibco，Cat. 11067-030)以及2mM的L-谷氨酰胺(GibcoCat. 25030-081)。Dhfr (-)標(biāo)志用于表達(dá)及篩選。通過使用ニ氫葉酸還原酶抑制劑“甲氨蝶呤(methotrexate,MTX) ”(Sigma Catno. M8407)使 dhfr 基因表達(dá)。當(dāng) dfhr 基因表達(dá)時(shí)，其它鄰近基因也被一起表達(dá)，使用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)選擇表達(dá)量高的細(xì)胞株，將細(xì)胞培養(yǎng)于 37°C、5%C02 的培養(yǎng)箱中(Model 3326，F(xiàn)orma scientific)。 2. pND/BMP2表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR，以全長人類 cDNA(LIFESEQ Catno. IHS1380-97652076)為模板復(fù)制出人類BMP-2基因片斷(正義引物ccttaattaagccaccatggtggccgggacccgc,反義引物gatatcctagcgacacccacaaccctc),并將 BMP-2 基因片斷摘入 pcDNA3. 1/Neo (+) /DHFR載體，形成pND/BMP2載體。此表達(dá)載體包含作為篩選標(biāo)志的抗新霉素基因(neomycin-resIstance gene)。3.重組細(xì)胞株的建立將含有人類BMP-2基因的載體以電脈沖法(PA4000 PulseAgi le electroporator, Cyto Pulse Sciences)轉(zhuǎn)染至CHO dhfr-細(xì)胞內(nèi)。首先將細(xì)胞以膜蛋白酶處理后，將細(xì)胞懸浮于CP-T緩沖液(Cyto pluse Cat. CP-T)中使細(xì)胞密度為3x IO6細(xì)胞/ml。將200 u I的細(xì)胞懸浮液(6xl05細(xì)胞)與10 ii g的pND/BMP2混合后進(jìn)行電脈沖處理，將經(jīng)電脈沖處理的細(xì)胞培養(yǎng)于不含篩選物質(zhì)的完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和HT補(bǔ)充物(HT Supplement)的MDM)使細(xì)胞恢復(fù)生長。在不含篩選物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞移至含有頂DM、10%胎牛血清、L-谷氨酰胺和5nM甲氨蝶呤的含篩選物質(zhì)的完全培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)2周后，將細(xì)胞株移至96孔盤中，并利用ELISA (PEPR0TECH 900-K255)定量分析篩選出高表達(dá)rhBMP-2的細(xì)胞株。將篩選出的細(xì)胞培養(yǎng)于篩選培養(yǎng)基中。將細(xì)胞稀釋至I細(xì)胞/100 u I的濃度后移至96孔盤中培養(yǎng)至生長成細(xì)胞叢。利用ELISA檢測并定量BMP-2蛋白，再依據(jù)ELISA的結(jié)果篩選出高產(chǎn)量細(xì)胞并逐步增加MTX濃度從0. 005,0.01,
0.02、0. 05、0. I 至 0. 2 u M。4.硫酸葡聚糖對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響在本實(shí)施例中，分別使用分子量為5000MW(Fluka，F(xiàn)L_31404)、8000MW(Spectrum, DE131)、6500_10000MW(Sigma, D4911)、12000MW(Spectrum, DE133)和500000MW(Sigma, D8906)的硫酸葡聚糖。首先，將濃度IxlO5的實(shí)施例I的細(xì)胞培養(yǎng)于2. 5ml的IMDM培養(yǎng)基中，分別加入不同劑量的硫酸葡聚糖使其最終濃度為0、10、20、50、100、200、300,500,750及1，000 u g/ml后，將細(xì)胞于37°C下、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天后，收集培養(yǎng)基進(jìn)行ELI SA分析。參照?qǐng)D1，當(dāng)硫酸葡聚糖的分子量介于6，500-12，000時(shí)，可有效促 進(jìn)BMP-2蛋白的表達(dá)，且BMP-2蛋白的產(chǎn)量會(huì)隨著硫酸葡聚糖濃度的增加而增加。然而，若硫酸葡聚糖的分子量小于8，000或大于12，000吋，則不會(huì)對(duì)BMP-2蛋白的產(chǎn)量造成明顯影響。此外，與分子量5，OOOMw和500，OOOMw的硫酸葡聚糖相比，分子量介于6，500-12，000硫酸葡聚糖更可增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量，分子量6，500Mw-12, OOOMw硫酸葡聚糖比分子量5，OOOMw及500，OOOMw硫酸葡聚糖所增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量大I倍以上。另外，進(jìn)ー步選用6，500-10，OOOMw(Sigma, D4911)及 12，000MW(Spectrum, DE133)的硫酸葡聚糖，分析硫酸葡聚糖在0、10、20、50、100、200、300、500、750、l，000ii g/ml濃度下時(shí)，BMP-2蛋白的產(chǎn)量。參照?qǐng)D2，不管分子量為6，500-10, 000MW或12，000MW的硫酸葡聚糖，BMP-2蛋白的產(chǎn)量皆會(huì)隨著硫酸葡聚糖濃度的升高而增加，產(chǎn)量約可増加1-4倍。然而，當(dāng)濃度大于500ug/ml后，BMP-2蛋白的產(chǎn)量就無明顯改變。5.肌肽對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響將濃度3xl06的實(shí)施例I的細(xì)胞培養(yǎng)于IOml的培養(yǎng)基中，分別加入不同劑量的肌肽(Sigma，Lot. BCBD7868V)使其最終濃度為10、20、30、50、IOOmM,以及不同劑量的硫酸葡聚糖(8000MW, Spectrum, DE131)使其最終濃度為 100、300、500 y g/ml，將細(xì)胞于 37°C 下、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天收集培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA分析。對(duì)照組中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照?qǐng)D3a_3c，肌肽可增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量，且BMP-2蛋白的產(chǎn)量會(huì)隨著肌肽濃度的增加而增加。相較于對(duì)照組，當(dāng)肌肽濃度為30mM吋，BMP-2蛋白的產(chǎn)量可增加2. 5倍。參照?qǐng)D4a_4c，肌肽可增加BMP-2蛋白的產(chǎn)量。然而，高濃度的肌肽會(huì)抑制細(xì)胞生長，因此若肌肽濃度過高，BMP-2蛋白產(chǎn)量增加的程度會(huì)變小。參照?qǐng)D5a_5c，當(dāng)培養(yǎng)基中肌肽的濃度固定為30mM時(shí)，BMP-2蛋白的產(chǎn)量會(huì)隨著硫酸葡聚糖濃度的増加而增加。當(dāng)培養(yǎng)基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖吋，可獲得最大的BMP-2產(chǎn)量。參照?qǐng)D6a_6c，當(dāng)培養(yǎng)基中硫酸葡聚糖的濃度固定為500 U g/ml吋，BMP-2蛋白的產(chǎn)量會(huì)隨著肌肽濃度的增加而增加。當(dāng)培養(yǎng)基中含有30mM的肌肽和500 u g/ml的硫酸葡聚糖時(shí)，可獲得最大的BMP-2產(chǎn)量。由圖3-6可知，相較于對(duì)照組，當(dāng)培養(yǎng)基中含有30mM的肌肽與500 U g/ml的硫酸葡聚糖吋，BMP-2蛋白的產(chǎn)量可增加5-7倍。6.丙氨酸和/或組氨酸對(duì)BMP-2產(chǎn)量的影響
將濃度3xl06的實(shí)施例I的細(xì)胞培養(yǎng)于IOml的培養(yǎng)基中，分別加入不同劑量的丙氨酸與組氨酸使其最終濃度為10、15、30、50、100、200mM，將細(xì)胞于37°C下、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天收集培養(yǎng)基進(jìn)行ELI SA分析。對(duì)照組中不含肌肽和硫酸葡聚糖。參照?qǐng)D7a_7e所示，當(dāng)丙氨酸與組氨酸的濃度在10_15mM時(shí)，不會(huì)影響細(xì)胞的生長。然而，當(dāng)丙氨酸與組氨酸的濃度增加至50mM以上時(shí)，會(huì)抑制細(xì)胞的生長，導(dǎo)致細(xì)胞濃度降低，進(jìn)而減少BMP-2的產(chǎn)量。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何熟習(xí)此技 藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動(dòng)與潤飾，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.ー種骨形成蛋白-2的制備方法，包括 提供ー細(xì)胞株，其含有骨形成蛋白_2基因， 將該細(xì)胞株培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其中該培養(yǎng)基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。
2.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白-2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于5，OOO 至 500，OOOMw 之間。
3.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白-2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的分子量介于6，500 至 12，OOOMw 之間。
4.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的濃度大于10u g/mlo
5.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述硫酸葡聚糖的濃度介于500 至 l，000ii g/ml 之間。
6.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽為左旋肌肽。
7.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽的濃度為50mM以下。
8.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述肌肽的濃度為IOmM至30mMo
9.如權(quán)利要求I所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述培養(yǎng)基還含有丙氨酸和/或組氨酸。
10.如權(quán)利要求5所述的骨形成蛋白_2的制備方法，其中所述丙氨酸和/或組氨酸的濃度為200mM以下。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種骨形成蛋白-2的制備方法，所述方法包括提供一含有骨形成蛋白-2基因的細(xì)胞株，將該細(xì)胞株于適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，其中所述培養(yǎng)基含有硫酸葡聚糖和/或肌肽。此外，本發(fā)明還提供一種增加骨形成蛋白-2產(chǎn)量的方法。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102796791SQ20121016650
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者彭文君, 楊淑萍, 楊英如 申請(qǐng)人:聯(lián)亞生技開發(fā)股份有限公司