骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應(yīng)用。具體地，外源骨形成蛋白（BMPs）具有誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的作用，BMP4可使肝癌細(xì)胞系的CD133蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞系CD133+肝癌干細(xì)胞分化；BMP4還能夠抑制肝癌細(xì)胞系的體外增殖和自我更新，抑制免疫缺陷小鼠的成瘤能力。本發(fā)明還提供了BMP4誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的作用機(jī)制。
【專利說(shuō)明】骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及骨形成蛋白4在抑制癌癥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范圍內(nèi)第五大高發(fā)腫瘤，也是第三大的腫瘤致死病因。隨著對(duì)腫瘤研究不斷進(jìn)展，手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療都成功使腫瘤瘤體縮小，但是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然十分普遍，常常導(dǎo)致肝癌患者的最終死亡。近年來(lái)，針對(duì)腫瘤易于復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的特性，研究者發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞(Cancer StemCells, CSCs),并認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展對(duì)肝癌發(fā)揮了重要作用。
[0003]腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是一群存在于腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中為數(shù)不多、但具有低分化、高耐藥性和高抗放射治療的特性的特殊腫瘤細(xì)胞，它們可以在體內(nèi)或體外成為分化程度更高的腫瘤細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行分選和分離，并接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，CSCs可以形成與其來(lái)源腫瘤細(xì)胞分化層級(jí)一致的腫瘤組織。雖然臨床治療可以殺死大部分的腫瘤細(xì)胞，但治療過(guò)程中CSCs的殘存，經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)甚至轉(zhuǎn)移。CSCs在體外除具有干細(xì)胞的基本特征(自我更新和分化潛能)，還具有如下特征:(I) CSCs可以通過(guò)特定細(xì)胞表面標(biāo)志物來(lái)分離；(2)多數(shù)CSCs可以在懸浮培養(yǎng)條件下形成球形克隆,或稱腫瘤球(tumorspheres);
[3]CSCs對(duì)化療藥物和放射線具有很強(qiáng)的耐受性。大多數(shù)的腫瘤的進(jìn)展都與癌干細(xì)胞有關(guān)。在肝癌研究中，多種細(xì)胞標(biāo)志物都被認(rèn)為能夠有效富集肝癌干細(xì)胞群，包括EpCAM、CD133、0V6、⑶90和SP細(xì)胞?？缒さ鞍注?33可以作為肝癌CSCs的一種表面標(biāo)志物，⑶133+的肝癌CSCs在體外具有更高的克隆形成能力，并且在免疫缺陷小鼠體內(nèi)更容易形成腫瘤。
[0004]⑶133是prominin-Ι基因編碼的蛋白，基因定位于染色體4ρ15.32，編碼含865個(gè)氨基酸的蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量120kD，是一種5次跨膜糖蛋白。CD133的mRNA在許多正常組織細(xì)胞中表達(dá)，但CD133蛋白的表達(dá)僅限于未分化細(xì)胞中，如內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胎兒腦干細(xì)胞與前列腺上皮干細(xì)胞等。在腫瘤研究中，CD133主要用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞中CSC群，100個(gè)⑶133+腦腫瘤CSCs在裸鼠體內(nèi)6個(gè)月即可形成腫瘤，而10萬(wàn)個(gè)⑶133—腫瘤細(xì)胞在相同時(shí)間內(nèi)未在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤。
[0005]但迄今為止，研究者對(duì)⑶133+肝癌CSC的分化及其調(diào)控機(jī)制并不十分清楚。因此本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)能夠影響肝癌干細(xì)胞分化的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的藥物及其應(yīng)用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述用途為選自下組的一種或多種的用途:
[0008](a)用于制備治療肝癌的藥物；
[0009](b)用于制備促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的分化的組合物；。[0010](C)用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物；
[0011](d)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物；
[0012](e)用于制備提高肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑敏感性的組合物；
[0013](f)用于制備降低肝癌細(xì)胞耐藥性的組合物。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的治療是分化治療肝癌。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的肝癌干細(xì)胞是人或非人哺乳動(dòng)物的肝癌干細(xì)胞。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)目動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠)等ο
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳動(dòng)物的BMP4蛋白、或其具有相同誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化功能的同源蛋白、突變蛋白或衍生蛋白。
[0019]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，所述的用途為選自下組的一種或多種用途:
[0020](a)用于制備治療癌癥的藥物；
[0021](b)用于制備促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的分化的組合物；
[0022](c)用于制備抑制癌癥的體外增殖和/或自我更新的組合物；
[0023](d)用于制備抑制癌癥的成瘤能力的組合物；
[0024](e)用于制備提高癌癥細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性的組合物；
[0025](f)用于制備降低癌癥細(xì)胞的耐藥性的組合物。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥是實(shí)體瘤，或所述的癌癥細(xì)胞來(lái)源于實(shí)體瘤。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地，為肝癌。
[0028]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種體外非治療性的誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的方法，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞，從而誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞的分化。
[0029]在另一優(yōu)選例中，將肝癌干細(xì)胞與含BMP4蛋白的溶液進(jìn)行接觸或混合，然后進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030]在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)體系中BMP4蛋白的濃度≥30ng/ml，較佳地≥50ng/ml，更佳地 > 100ng/mlo
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的BMP4蛋白為BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)，較佳地為BMP4同二聚體。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟:在步驟(I)之前、之中或之后，在培養(yǎng)體系中添加額外的抗腫瘤劑。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU、或其組合。
[0035]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性的方法，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤細(xì)胞包括選自下組癌癥的腫瘤細(xì)胞:肝癌、肺癌、胃癌，更佳地為肝癌。
[0037]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種緩釋藥物組合物，所述的藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括緩釋顆粒以及吸附于緩釋顆粒的BMP4蛋白。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的緩釋顆粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的緩釋藥物組合物為注射劑。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的緩釋藥物組合物的給藥方式為局部給藥或瘤內(nèi)給藥。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的BMP4蛋白包括BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或BMP4的融合蛋白(保留BMP4活性)。
[0043]在另一優(yōu)選例中，所述的BMP4蛋白單體是由Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為NM_001202.3、NM_130850.2、或NM_130851.2所示的核苷酸序列編碼的。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的緩釋藥物組合物還包括額外的抗腫瘤劑。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。
[0046]在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0047]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種用于治療腫瘤的藥盒，所述藥盒包括:
[0048](a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑；
[0049](b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和
[0050](C)使用說(shuō)明書(shū)。
[0051]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種治療腫瘤或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的方法，包括步驟:給需要的對(duì)象施用BMP4蛋白或第五方面所述的緩釋藥物組合物。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的癌癥是實(shí)體瘤；較佳地，所述的癌癥包括肝癌、肺癌、胃癌；更佳地為肝癌。
[0053]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0054]下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
[0055]圖1顯示⑶133是PLC/PRF/5細(xì)胞系的CSC表面標(biāo)志物；其中，圖1A顯示不同肝癌細(xì)胞系中⑶133+細(xì)胞率；圖1B顯示PLC/PRF/5細(xì)胞中，⑶133+細(xì)胞％約為52%，通過(guò)流式分選后得到的⑶133+/⑶133-肝癌細(xì)胞群的分選純度達(dá)到90%以上；圖1C顯示，PLC/PRF/5⑶133+細(xì)胞群腫瘤球形成的數(shù)目和大小均大于⑶133-細(xì)胞群；圖1D顯示，多種干細(xì)胞相關(guān)基因在PLC/PRF/5CD133+細(xì)胞群中表達(dá)上調(diào)。
[0056]圖2顯示，高濃度外源性BMP4處理肝癌細(xì)胞后其⑶133+細(xì)胞比例下降；其中，圖2A顯示采用流式細(xì)胞分析法分析PLC/PRF/5 (PLC)和Huh7細(xì)胞中CD133+細(xì)胞率，結(jié)果顯示高濃度外源性BMP4處理6天后兩種細(xì)胞系中的CD133+細(xì)胞率分別有原來(lái)的約52.1 %下降至32.9%，和約73.0%下降至47.5%。
[0057]圖3顯示，外源性BMP4可以降低肝細(xì)胞癌細(xì)胞中⑶133蛋白表達(dá)；其中，圖3A顯示用0-100ng/ml不同濃度的外源性BMP4處理PLC/PRF/5CD133+/CD133-細(xì)胞中CD133蛋白的表達(dá)情況；圖3B顯示50ng/ml BMP4處理不同時(shí)間后PLC/PRF/5細(xì)胞中CD133蛋白的表達(dá)情況；圖3C顯示采用Western Blot法分析50ng/ml BMP4處理6天后，Huh7細(xì)胞中⑶133蛋白表達(dá)情況。
[0058]圖4顯示，外源性高濃度BMP4抑制PLC/PRF/5細(xì)胞增殖但不引起凋亡，其中，圖4A顯示BrdU-ELISA法檢測(cè)0-100ng/ml不同濃度BMP4處理3天對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞增殖能力的影響；圖4B顯示Annexin V/7-AAD雙標(biāo)法檢測(cè)50ng/mlBMP4處理后PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡率的變化。
[0059]圖5顯示，高濃度外源性BMP4誘導(dǎo)肝癌CSCs的分化，其中，圖5A顯示通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)分別在CDM懸浮培養(yǎng)或在50ng/ml BMP4處理單層貼壁3天的PLC/PRF/5CD133+/-肝癌細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)情況；圖5B顯示W(wǎng)estern Blot檢測(cè)顯示BMP4處理在⑶133+PLC/PRF/5細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性上調(diào)CK8/18蛋白并下調(diào)CK19蛋白表達(dá)；圖5C顯示免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD133+PLC/PRF/5細(xì)胞中CK8/18和CK19在BMP4處理前后表達(dá)的變化。
[0060]圖6顯示BMP4處理對(duì)Huh7和MHCC-97L細(xì)胞CK8/18和CK19蛋白表達(dá)的影響；其中，圖6A顯示BMP4處理Huh7細(xì)胞0-6天后CK8/18和CK19蛋白的表達(dá)；圖6B顯示BMP4處理6天后MHCC-97L細(xì)胞CK8/18和CK19蛋白的表達(dá)。
[0061 ] 圖7顯示高濃度外源性BMP4處理抑制肝CSCs自我更新；圖7A和圖7B顯示將分選得到的⑶133+/-PLC/PRF/5細(xì)胞用BMP4預(yù)處理6天后，在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)并計(jì)算克隆形成率(colony formation efficiency, CFE) (n=3);圖7C顯示將分選得到的CD133+PLC/PRF/5細(xì)胞用BMP4預(yù)處理6天后，種入超低黏附板中觀察腫瘤球形成情況，培養(yǎng)液 為無(wú)血清CDM。
[0062]圖8顯示BMP4抑制⑶133+肝癌CSCs在體內(nèi)的成瘤能力，其中，圖8A和圖8B顯示，CD133+/-PLC/PRF/5 (PLC)和MHCC-97L (97L)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)肝原位注射形成移植瘤的重量；圖8C顯示，PLC/PRF/5與MHCC-97L CD133+/-細(xì)胞與BMP4包被beads共同注射時(shí)的成瘤性。
[0063]圖9顯示⑶133+/-肝癌細(xì)胞與BMP4包被beads共同接種的成瘤性；其中，圖9A為PLC/PRF/5 (PLC)肝癌細(xì)胞；圖9B為MHCC-97L (97L)肝癌細(xì)胞。
[0064]圖10顯示BMP4提高了肝癌CSCs的化療藥物敏感性；其中，圖1OA和圖10B顯示，⑶133+/-PLC/PRF/5細(xì)胞經(jīng)過(guò)BMP4預(yù)處理后，經(jīng)MTT試驗(yàn)檢測(cè)計(jì)算每種細(xì)胞對(duì)阿霉素(Doxorubicin)和長(zhǎng)春新喊(Vincristine)的 IC50 值;圖 10C 顯不 BMP4 處理降低了 PLC/PRF/5細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)；圖10D顯示BMP4處理降低了 MHCC-97L細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)；圖10E顯示流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析BMP4處理前后MHCC-97L細(xì)胞中SP細(xì)胞比例。
[0065]圖11顯示BMP受體在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)和激活；其中，圖1lA顯示PLC/PRF/5和 Huh7 細(xì)胞用 50ng/ml BMP4 處理 0_90min，Western Blot 結(jié)果顯示 BMPRIa、BMPRIb 和SMAD4在這些細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，并且SMADl出現(xiàn)BMP4濃度依賴性磷酸化激活；圖1lB顯示，Western Blot分析BMPRIa、BMPRIb在BMP4處理3天后的SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)和激活情況；圖11(:顯示BMPRla在0)133+/0)133-肝癌細(xì)胞表達(dá)的 Western Blot檢測(cè)；圖1lD顯示，Western Blot分析SMAD4siRNA干擾片段在PLC/PRF/5細(xì)胞中的干擾效率；圖1lE顯示SMAD4干擾阻斷了 BMP4在PLC/PRF/5細(xì)胞中的促分化作用。
[0066]圖12顯示BMP受體在人原發(fā)性肝癌組織中的蛋白表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)BMPRIa和BMPRIb蛋白在236例人原發(fā)性肝癌組織樣品中的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0067]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次在眾多的生長(zhǎng)因子中，意外地發(fā)現(xiàn)，外源性骨形成蛋白(BMPs)具有誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的作用，具體地，外源性BMP4處理可使肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5和Huh7細(xì)胞中CD133蛋白表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性；BMP4能夠促進(jìn)PLC/PRF/5、Huh7和MHCC-97L細(xì)胞系中CD133+肝癌干細(xì)胞分化，并且肝系上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增多；抑制PLC/PRF/5細(xì)胞體外增殖，抑制其CD133+肝癌干細(xì)胞的自我更新以及在免疫缺陷小鼠體內(nèi)的成瘤能力；BMP4通過(guò)下調(diào)ABCG2蛋白表達(dá)等途徑增強(qiáng)PLC/PRF/5和MHCC-97L CD133+腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；BMP4激活⑶133+腫瘤干細(xì)胞中的BMP經(jīng)典信號(hào)通路，干擾經(jīng)典通路關(guān)鍵分子SMAD4，使BMP4失去促⑶133蛋白表達(dá)下降作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0068]術(shù)語(yǔ)
[0069]BMP4
[0070]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“BMP4”,“BMP4 蛋白，” “Bone morphogenetic protein 4” “骨形成蛋白4”或“成骨蛋白4”可以互換使用。BMP4是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生長(zhǎng)因子，屬于TGF-β家族。ΒΜΡ4可以是Genbank登錄號(hào)為ΝΡ_001193.2、ΝΡ_570911.2、或ΝΡ_570912.2所示的任一氨基酸序列；所述的ΒΜΡ4蛋白也可以是由Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為ΝΜ_001202.3、ΝΜ_130850.2、或ΝΜ_130851.2所示的核苷酸序列編碼的。
[0071]該所述的ΒΜΡ4蛋白為ΒΜΡ4單體、或ΒΜΡ4同二聚體，或ΒΜΡ4異二聚體、或ΒΜΡ4的融合蛋白(保留ΒΜΡ4活性)，較佳地為ΒΜΡ4同二聚體。
[0072]該術(shù)語(yǔ)還包括ΒΜΡ4在藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指ΒΜΡ4與酸或堿所形成的適合用作藥物的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)鹽。優(yōu)選的鹽是ΒΜΡ4與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于:鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機(jī)酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
[0073]制備方法
[0074]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用常規(guī)的方法，如生物合成或全化學(xué)合成法制備ΒΜΡ4。在一個(gè)優(yōu)選例中，生物合成ΒΜΡ4的步驟如下:
[0075]I)提供編碼ΒΜΡ4的核酸序列；
[0076]2)將I)的核酸序列插入到合適的表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；
[0077]3)將2)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞；
[0078]4)在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；
[0079]5)收集上清液，并純化ΒΜΡ4。[0080]根據(jù)BMP4的核苷酸序列，本【技術(shù)領(lǐng)域】人員可方便地用各種已知方法制得所述的編碼核酸。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見(jiàn)J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過(guò)分段合成核苷酸序列再進(jìn)行重疊延伸PCR的方法來(lái)構(gòu)建所述核酸序列。編碼BMP4的核苷酸序列可以與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0081]表達(dá)載體可采用市售的例如但不限于:pIRES、pDR，pUC18等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細(xì)胞來(lái)選擇合適的表達(dá)載體。根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過(guò)限制性酶剪切與拼接，將BMP4的編碼序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得重組表達(dá)載體。
[0082]宿主細(xì)胞優(yōu)選的是真核細(xì)胞，例如但不限于CHO，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，RSF細(xì)胞等。作為優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞，其可良好地表達(dá)BMP4蛋白。將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見(jiàn)Olander RM Dev Biol Stand 1996;86:338?？赏ㄟ^(guò)離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘?jiān)占逡?。可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定。
[0083]可將上述制備獲得的BMP4純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)所述蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來(lái)分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子 交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽(yáng)離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。
[0084]可利用含有所述BMP4蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽?？蛇x擇地，所述蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG, HA, HAl，c-Myc，6_His或8_His等。這些標(biāo)簽可用于對(duì)BMP4蛋白進(jìn)行純化。
[0085]此外，BMP4蛋白還可以從例如Sigma公司等公司購(gòu)得。
[0086]BMP4 的用途
[0087]本發(fā)明還提供了 BMP4用途，它被用于制備治療肝癌的藥物；用于制備促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的分化的組合物；用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物；)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物；用于制備提高肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑敏感性的組合物；用于制備降低肝癌細(xì)胞耐藥性的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的BMP4蛋白包括人或非人哺乳動(dòng)物的BMP4蛋白、或其具有相同誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化功能的同源蛋白、突變蛋白或衍生蛋白。
[0088]藥物組合物和施用方法[0089]本發(fā)明提供了能誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。所述組合物包括緩釋顆粒以及吸附于緩釋顆粒的BMP4蛋白。所述的緩釋顆粒由生物可降解材料(如聚乳酸，聚丙烯酸)制成。所述的緩釋藥物組合物為注射劑。給藥方式為局部給藥或瘤內(nèi)給藥。
[0090]所述的緩釋藥物組合物，還包括額外的抗腫瘤劑。所述的抗腫瘤劑包括化療藥、腫瘤抗體等。在另一優(yōu)選例中，所述的抗腫瘤劑包括(但并不限于):阿霉素、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、順鉬、卡鉬、5-FU或其組合。
[0091]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”或“有效劑量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。
[0092]“藥學(xué)上可以接受的載體”指的是:一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人或動(dòng)物使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能和藥物中的活性成分以及它們之間相互摻和，而不明顯降低藥效。
[0093]藥學(xué)上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤(rùn)滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫? )、潤(rùn)濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無(wú)熱原水等。
[0094]本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于):局部給藥，瘤旁，瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)、或靜脈內(nèi)等。
[0095]組合物中活性化合 物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟類物質(zhì)。必要時(shí)，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0096]除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。
[0097]除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑和香料。
[0098]除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。
[0099]一種優(yōu)選的劑型是注射劑。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無(wú)菌含水或無(wú)水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無(wú)菌的可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0100]一種優(yōu)選的劑型是緩釋劑型。用于本發(fā)明的緩釋劑沒(méi)有特別選擇，可以是本領(lǐng)域采用的各類緩釋劑或材料，尤其是生物可降解材料(如PLA等)。
[0101]藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約I微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，BMP4還可與其他治療劑(如抗腫瘤劑)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。
[0102]使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的藥物施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約I毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0103]藥盒及其應(yīng)用
[0104]本發(fā)明提供一種藥盒，所述藥盒包括:(a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑；(b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和((3)使用說(shuō)明書(shū)。
[0105]所述的含BMP4作為活性的藥物制劑為將BMP4在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水，醇類(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有機(jī)溶劑。
[0106]所述的抗腫瘤劑優(yōu)選為含有阿霉素和/或長(zhǎng)春新堿的制劑，將阿霉素和/或長(zhǎng)春新堿在溶劑中溶解獲得，所述的溶劑包括水，醇類(甲醇和乙醇)，乙酸乙酯，丙酮，氯仿，二氯甲烷，正己烷或石油醚等有機(jī)溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯和丙酮等中等極性溶劑。
[0107]所述的含有BMP4的制劑選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優(yōu)選針劑。
[0108]所述的含有阿霉素和/或長(zhǎng)春新堿的制劑選自針劑、片劑、膠囊、或栓劑等，優(yōu)選針劑。
[0109]所述含有B MP4的制劑可以是含有BMP4的單元?jiǎng)┬?，所述含有阿霉素?或長(zhǎng)春新堿的制劑可以是含有阿霉素和/或長(zhǎng)春新堿的單元?jiǎng)┬汀?br> [0110]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單元?jiǎng)┬汀笔侵笧榱朔梅奖?，將組合物制備成單次使用所需的劑型，包括但不限于各種液體劑、固體劑(如片劑)、膠囊劑、緩釋劑、靶向劑。
[0111]本發(fā)明提供的藥盒通過(guò)下述步驟制備得到:將含有BMP4的制劑和含有阿霉素和/或長(zhǎng)春新堿的制劑，以及說(shuō)明書(shū)一起放置，形成藥盒。
[0112]本發(fā)明提供的藥盒用于治療腫瘤，所述的腫瘤包括肝癌，肺癌，胃癌等；優(yōu)選肝癌。
[0113]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括:
[0114](I)外源BMP4可使肝癌細(xì)胞系中CD133蛋白表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)作用具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性；
[0115](2)BMP4促進(jìn)肝癌干細(xì)胞分化，抑制PLC/PRF/5細(xì)胞體外增殖，抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新；
[0116](3) BMP4抑制免疫缺陷小鼠體的成瘤能力；
[0117](4) BMP4通過(guò)下調(diào)ABCG2蛋白表達(dá)等途徑增強(qiáng)PLC/PRF/5和MHCC-97LCD133+腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；
[0118](5)BMP4激活⑶133+腫瘤干細(xì)胞中的BMP經(jīng)典信號(hào)通路，干擾經(jīng)典通路關(guān)鍵分子SMAD4，使BMP4失去促CD 133蛋白表達(dá)下降作用。
[0119]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0120]實(shí)驗(yàn)材料
[0121]1.蛋白電泳及免疫印跡實(shí)驗(yàn)材料
[0122]分子生物學(xué)級(jí)Tris base,丙烯酰胺及N, N-亞甲雙丙烯酰胺均購(gòu)Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞裂解用T-PER組織蛋白抽提試劑購(gòu)自Pierce公司；蛋白酶抑制劑Cocktail購(gòu)自Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。
[0123]5 X蛋白上樣緩沖液、20 X DTT還原劑和PageRuler?預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker購(gòu)自Fermentas公司。脫脂奶粉購(gòu)自Santa Cruz公司。
[0124]本研究所用抗體信息詳見(jiàn)表1 ;
[0125]化學(xué)發(fā)光顯色劑SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate 購(gòu)自Pierce公司；X_光醫(yī)用膠片購(gòu)自Kodak公司。
[0126]表1
【權(quán)利要求】
1.一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述用途為選自下組的一種或多種的用途: (a)用于制備治療肝癌的藥物； (b)用于制備促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的分化的組合物； (C)用于制備抑制肝癌體外增殖和/或自我更新的組合物； (d)用于制備抑制肝癌的成瘤能力的組合物； (e)用于制備提高肝癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑敏感性的組合物； (f)用于制備降低肝癌細(xì)胞耐藥性的組合物。
2.一種骨形成蛋白4即BMP4蛋白的用途，其特征在于，所述的用途為選自下組的一種或多種用途: (a)用于制備治療癌癥的藥物； (b)用于制備促進(jìn)癌癥干細(xì)胞的分化的組合物； (C)用于制備抑制癌癥的體外增殖和/或自我更新的組合物； (d)用于制備抑制癌癥的成瘤能力的組合物； (e)用于制備提高癌癥細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性的組合物； (f)用于制備降低癌癥細(xì)胞的耐藥性的組合物。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的癌癥是實(shí)體瘤，或所述的癌癥細(xì)胞來(lái)源于實(shí)體瘤。
4.一種體外非治療性的誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞，從而誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞的分化。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括步驟:在步驟(I)之前、之中、或之后，在培養(yǎng)體系中添加額外的抗腫瘤劑。
6.一種提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(I):在添加BMP4蛋白的條件下，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤劑的敏感性或降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
7.一種緩釋藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和作為活性成分的BMP4蛋白，且組合物為緩釋劑型。
8.如權(quán)利要求7所述的緩釋藥物組合物，其特征在于，所述的BMP4蛋白包括BMP4單體、或BMP4同二聚體，或BMP4異二聚體、或保留BMP4活性的BMP4融合蛋白。
9.如權(quán)利要求7所述的緩釋藥物組合物，其特征在于，還包括額外的抗腫瘤劑。
10.一種用于治療腫瘤的藥盒，其特征在于，所述藥盒包括: (a)第一治療劑，所述第一治療劑是含BMP4作為活性的藥物制劑； (b)第二治療劑，所述第二治療劑是抗腫瘤劑，所述的抗腫瘤劑含有不同于BMP4的活性成分；和 (c)使用說(shuō)明書(shū)。
11.一種治療腫瘤或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的方法，其特征在于，包括步驟:給需要的對(duì)象施用BMP4蛋白或權(quán)利要求7所述的緩釋藥物組合物。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK103463619SQ201210189643
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】李錦軍, 張立行 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所