專利名稱：使用用于癌癥的輔佐治療的李斯特菌屬的方法和組合物的制作方法
使用用于癌癥的輔佐治療的李斯特菌屬的方法和組合物本發(fā)明要求2010年5月23日提交的美國臨時專利申請61/347，447的優(yōu)先權(quán)，包括所有表格、附圖
和權(quán)利要求的其全部內(nèi)容特此并入。關(guān)于聯(lián)邦政府贊助研究的聲明美國政府具有本發(fā)明的全額支付許可證以及在限制的情況下具有在根據(jù)美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute)授予號NHI 1K23CA104160-01所提供的合適的條款下要求專利權(quán)人許可其他人的權(quán)利。
背景技術(shù)：
據(jù)認為，建立對特異性病原體的強細胞免疫是所需的。已經(jīng)證明，使用相同疫苗的重復(fù)施用(同源性加強)對于加強體液應(yīng)答是有效的。然而，因為之前對載體的免疫傾向于損壞強抗原呈遞和合適炎癥信號的生成，所以該方法對加強細胞免疫相對無效。規(guī)避該 問題的一種方法為連續(xù)施用使用不同抗原依賴性系統(tǒng)(異源性加強)的疫苗。該方法稱為“初免-加強(prime-boosting) ”。以下是異源性初免-加強方案的例子。涉及DNA初免的那些包括DNA初免針對病毒抗原的DNA初免/細菌加強(李斯特菌屬)(Boyer等(2005) Virology 333:88-101)；DNA初免/細菌載體(芽孢桿菌屬)加強，針對細菌抗原(Ferraz等(2004) InfectionImmunity72:6945-6950) ;DNA初免/病毒載體加強，針對腫瘤抗原(Goldberg等(2005)Clin. Cancer Res. 11:8114-8121 ； Smith 等(2005) Int. J. Cancer 113:259-266);針對病毒抗原的 DNA 初免 / 病毒加強(Toussaint 等(2005)Vaccine 23:5073-5081 ;Cebere 等(2006)Vaccine 24:417-425 ;Coupar 等(2006)Vaccine 24:1378-1388);針對病毒抗原的DNA 初免/ 蛋白加強(Cristillo 等(2006) Virology 346:151-168 ;Rasmussen 等(2006)Vaccine 24:2324-2332) ;DNA初免/病毒加強，針對寄生蟲的抗原(Gilbert等(2006)Vaccine 24:4554-4561 ;Webster 等(2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:4836-4841)；DNA初免/輔佐的蛋白加強，針對腫瘤抗原(Prud' homme (2005) J. Gene Med. 7:3-17) ；DNA初免/病毒加強以及蛋白加強，針對病毒抗原(Stambas等(2005) Vaccine23:2454-2464)；以及DNA初免(納米顆粒)/蛋白加強，針對病毒抗原(Castaldello等(2006)Vaccine24:5655-5669)。以下異源性初免-加強方案利用不涉及DNA的初免組合物樹狀細胞(DC)初免/細菌(李斯特菌屬)加強、以及DC初免/病毒加強，針對細菌抗原(Badovinac等(2005) Nat. Med. 11:748-756);細菌載體初免(沙門氏菌屬)/蛋白加強，針對細菌抗原(Vindurampulle 等(2004)Vaccine 22:3744-3750 ；Lasaro 等(2005)Vaccine23:2430-2438);輔佐的蛋白初免/DNA加強，針對病毒抗原(Sugauchi等(2006) J. Infect.Dis. 193:563-572 ;Pal 等(2006) Virology 348:341-353);蛋白初免 / 細菌載體(沙門氏菌屬)加強，針對病毒抗原(Liu等(2006)Vaccine24:5852-5861);蛋白初免/病毒載體加強，針對病毒抗原(Peacock等(2004) J. Virol. 78:13163-13172);異源性病毒初免/病毒加強，使用不同病毒載體，針對病毒抗原或腫瘤抗原(Ranasinghe等(2006)Vaccine24:5881-5895 ；Kaufman 等(2004)J. Clin. Oncol. 22:2122-2132 ；Grosenbach 等(2001) Cancer Res. 61:4497-4505)。使用脂囊泡的異源性初免/加強，針對細菌抗原(Luijkx 等(2006)Vaccine 24:1569-1577)。用于調(diào)控免疫系統(tǒng)的試劑是李斯特菌屬以及特別地為單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。單核細胞增生性李斯特菌具有對肝臟和脾臟以及一定程度對諸如小腸的其他組織的天然向性(參見，例如，Dussurget等(2004)Ann. Rev.Microbiol. 58:587-610 ；Gouin 等(2005) Curr· Opin. Microbiol. 8:35-45 ；Cossart (2002)Int.J. Med.Microbiol.291:401-409 ;Vazquez-Boland 等(2001)Clin.Microbiol.Rev. 14:584-640 ;Schluter 等(1999) Tmmunobi ol. 201:188-195) 對于細菌位于腸道，則通過諸如ActA和internalin A的李斯特菌屬蛋白來介導(dǎo)至血流的通道(參見,例如,Manohar等(2001)Infection Immunity69:3542-3549 ；Lecuit 等(2004)Proc. Natl. Acad. Sci.USAlOl: 6152-6157 ；Lecuit 和 Cossart (2002) Trends Mol. Med. 8:537-542)。一旦細菌進入宿主細胞，單核細胞增生性李斯特菌的生命周期包括從吞噬溶酶體脫逸至胞質(zhì)溶膠。該生命周期對比于分枝桿菌屬(Mycobacterium),其仍舊在吞曬溶酶體內(nèi)(參見,例如,Clemens等(2002)Infection Immunity 70:5800-5807 ;Schluter 等(1998)Infect. Immunity66:5930-5938 ;Gutierrez等(2004) Cell 119:753-766)。單核細胞增生性李斯特菌從吞噬 溶酶體中的脫逸通過諸如豬單核細胞增生李斯特菌素(Iysteriolysin) (LLO)、PI-PLC和PC-PLC 的李斯特菌屬蛋白介導(dǎo)(參見 Portnoy 等(2002) J. Cell Biol. 158:409-414)。對比以上所討論的免疫治療方法，其中免疫療法用作主要治療；輔助療法是指在主要療法之前(“新輔助療法”)或者之后(“輔佐”)使用次要治療，例如手術(shù)或輻射，其中主要療法旨在去除或者破壞主要腫瘤。例如，在手術(shù)之后可提供輔助療法，其中已經(jīng)去除可檢測的疾病，但是由于隱藏疾病還存在復(fù)發(fā)的統(tǒng)計學(xué)風(fēng)險。對于包括結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和一些婦科癌癥的許多類型的癌癥，手術(shù)之后提供輔助系統(tǒng)療法和輻射療法。
發(fā)明概要本發(fā)明提供采用李斯特菌屬細菌用于癌癥的次級治療的輔助療法方案。在已經(jīng)向受試者施用一次或者多次初級治療之前或之后，施用表達癌癥相關(guān)抗原的有效量的李斯特菌屬疫苗。本發(fā)明包括包裝在合適的容器中的含有基于李斯特菌屬的疫苗的試劑盒，以及可包括說明書。在第一方面，本發(fā)明涉及罹患癌癥的哺乳動物的輔佐治療的方法，該方法包括在向所述哺乳動物施用主要療法之前或之后向所述哺乳動物施用有效量的組合物作為輔佐治療以去除或者殺死表達癌癥抗原的癌癥細胞，所述組合物包含減毒的、代謝活性李斯特菌屬，所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬編碼所述癌癥抗原的可表達的、免疫活性部分。如上所述，可將本發(fā)明的組合物提供作為新輔助療法；然而在優(yōu)選的實施方案中，在主要療法之后施用本發(fā)明的組合物。在各個實施方案中，所述主要療法包括去除所述哺乳動物的所述癌癥細胞的手術(shù)；殺死在所述哺乳動物中所述癌癥細胞的輻射療法；或者所述手術(shù)以及所述輻射療法。因為李斯特菌屬可以為病原生物，以及特別是在免疫功能不全的情況下，優(yōu)選所述施用步驟包括以多劑量施用所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬，所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬編碼所述癌癥抗原的可表達的、免疫活性部分?！皽p毒”是指藉此修飾細菌以減輕或者消除它的病原性但是仍保留用作目標疾病的預(yù)防或治療的能力的方法。通過不同機制可獲得細菌減毒。一種是引入突變至一種或者多種代謝途徑內(nèi)，其功能對于細菌體內(nèi)生存和生長以致病是關(guān)鍵的。在李斯特菌屬的情況下，在某些實施方案中，使細菌突變以減輕或者預(yù)防細胞內(nèi)生長和擴散的能力。優(yōu)選的李斯特菌屬可包括使ActA失活的突變；使InlB失活的突變；或者兩者。最優(yōu)選地，在本發(fā)明中采用缺失它的天然ActA和inlB基因(AactAAinlB)的減毒的、代謝活性李斯特菌屬。在某些實施方案中，本方法采用被殺死但具代謝活性的李斯特菌屬("KBMA")。通過本發(fā)明的組合物提供編碼各種癌癥抗原的任意類型的一種或多種核酸的重組表達。在某些實施方案中，癌癥抗原全部或者一部分是間皮素。其他合適抗原詳細描述如下，以及可取決于待治療的癌癥類型以及通過癌癥待表達的抗原。在各個實施方案中，待治療的癌癥選自胰腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌和間皮瘤。該清單并非旨在限制。
除了優(yōu)選為如所述的手術(shù)或輻射的主要療法之外，可將本發(fā)明的組合物遞送作為初免-加強方案的一部分。例如，在施用本發(fā)明的李斯特菌屬組合物之間，已經(jīng)預(yù)先向哺乳動物施用表達目標癌癥抗原的來自人細胞系的細胞，其中所述細胞已經(jīng)被重組修飾以生成和分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，以及其中已通過輻射修飾所述細胞以防細胞分裂(SP’GVAX 疫苗，Cell Genesys, Inc.)。應(yīng)理解，本發(fā)明在其應(yīng)用時并不限于構(gòu)造細節(jié)以及在以下描述中闡述或者附圖中所圖示的組分的布置。本發(fā)明能夠具有實施方案(除了描述的那些實施方案之外)以及能夠以各種方法實施和進行。而且，應(yīng)理解，本文所采用的措辭和術(shù)語以及摘要用于描述的目的以及不應(yīng)當視為限制。就其本身而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可容易地利用該公開基于的概念作為設(shè)計進行本發(fā)明的多種目的的其他結(jié)構(gòu)、方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。因此，重要的是，只要它們未偏離本發(fā)明的精神和范圍，權(quán)利要求就應(yīng)被視為包括在這些等同構(gòu)造內(nèi)。附圖簡述圖IA是顯示使用表達抗原的單核細胞增生性李斯特菌和牛痘病毒的初免-加強方案所致的對靶抗原(OVA)的OVA特異性細胞免疫應(yīng)答的圖。顯示在ICS測定中使用0VA257-264 肽(SIINFEKL(SEQ IDNO: I))接種的 C57BL/6 小鼠中的 OVA 特異性應(yīng)答。圖IB是顯示由使用表達靶抗原(人間皮素)的單核細胞增生性李斯特菌和腺病毒的初免-加強方案所致的人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答的圖。圖2是顯示由使用單核細胞增生性李斯特菌、腺病毒和牛痘病毒的初免-加強方案所致的在Balb/c小鼠中人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答的圖。也圖示初免-加強方案。圖3A是顯示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的單核細胞增生性李斯特菌加強的初免-加強方案所致的在C57BL/6 (HLA-A2轉(zhuǎn)基因)小鼠中人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答的圖(使用間皮素肽池(peptide pool)來刺激脾細胞)。圖3B顯示由使用增加水平的腺病毒初免和恒定水平的單核細胞增生性李斯特菌加強的初免-加強方案所致的在Balb/c小鼠中人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答(使用間皮素肽池來刺激脾細胞)。也圖示初免-加強方案。圖4A顯示在圖的左側(cè)，其顯示由具有預(yù)先存在的對腺病毒的免疫的小鼠中腺病毒初免所致的人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答。也在圖4A中顯示如使用類型I Hex3表位(腺病毒特異性表位)測定的腺病毒特異性應(yīng)答。也圖示初免-加強方案。圖4B是顯示在具有預(yù)先存在的對腺病毒的免疫的小鼠中由腺病毒初免和單核細胞增生性李斯特菌加強所致的人間皮素特異性細胞免疫應(yīng)答和中和腺病毒特異性抗體的滴度的圖。也圖示初免-加強方案。圖5是顯示由使用GVAX (CELL GENESYS, INC.)或者編碼AHl的單核細胞增生性李斯特菌的初免以及使用GVAX (CELLGENESYS, INC.)或者編碼AHl的單核細胞增生性李斯特菌的加強所致的AHl特異性細胞免疫應(yīng)答的圖。圖6A是顯示由使用經(jīng)間皮素肽131-139脈沖的樹狀細胞或者編碼人間皮素的腺病毒的初免以及使用編碼人間皮素的單核細胞增生性李斯特菌的加強所致的在CD8+T細胞中的間皮素131_139特異性應(yīng)答的百分率的圖。初免發(fā)生在第O天；加強發(fā)生在第8天；以及在第13天收獲脾細胞?！?br> 圖6B是顯示由使用經(jīng)間皮素肽131-139脈沖的樹狀細胞或者編碼人間皮素的腺病毒的初免以及使用編碼人間皮素的單核細胞增生性李斯特菌的加強所致的每個脾臟中間皮素131-139特異性⑶8+T細胞的絕對數(shù)的圖。初免發(fā)生在第O天；加強發(fā)生在第8天；以及在第13天收獲脾細胞。圖6C是顯示由使用經(jīng)間皮素肽131-139脈沖的樹狀細胞的初免以及使用以下編碼間皮素試劑的加強所致的在CD8+T細胞中間皮素131-139特異性應(yīng)答的百分率的圖單核細胞增生性李斯特菌、腺病毒或牛痘病毒。圖7A是顯不在脾細胞中小鼠間皮素特異性免疫應(yīng)答的圖,其中評估在小鼠間皮素肽文庫中各肽的免疫應(yīng)答。Balb/c小鼠接受使用編碼小鼠間皮素的裸DNA載體的初免以及使用編碼小鼠間皮素的單核細胞增生性李斯特菌的加強。圖7B是顯不在脾細胞中小鼠間皮素特異性免疫應(yīng)答的圖,其中評估在小鼠間皮素肽文庫中各肽的免疫應(yīng)答。Balb/c小鼠接受使用編碼小鼠間皮素的腺病毒的初免以及使用編碼小鼠間皮素的單核細胞增生性李斯特菌的加強。也圖示初免-加強方案。圖7C是顯示酶聯(lián)免疫斑點法(elispot)測定的結(jié)果的孔相片的半色調(diào)再現(xiàn)(hali-tone reproduction),其中從小鼠(其研究結(jié)果顯示在圖7B中)獲得的脾細胞暴露于間皮素肽編號 278 (SEQ ID NO: 2) ,279 (SEQ ID NO: 3)或者 280 (SEQ ID NO: 4)。圖8是顯示由使用編碼OVA的KBMA單核細胞增生性李斯特菌作為初免以及KBMA單核細胞增生性李斯特菌、牛痘病毒或“活”單核細胞增生性李斯特菌作為加強的初免-加強方案所致的OVA特異性細胞免疫應(yīng)答的圖。所有“加強”載體編碼0VA。圖9A顯示在接種小鼠中AH-和AH 1/A5-特異性T細胞應(yīng)答。圖9B顯示在接種小鼠中間皮素特異性T細胞應(yīng)答。圖9C顯示在CT26腫瘤激發(fā)(tumor challenge)之后接種的小鼠的生存數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于引起對作為非李斯特菌屬抗原的靶抗原的免疫應(yīng)答的材料和方法。靶抗原優(yōu)選為與疾病相關(guān)的靶抗原，使得對靶抗原的免疫應(yīng)答提供治療作用。本發(fā)明提供癌癥的輔佐治療的疫苗組，其中基于李斯特菌屬的疫苗是代謝活性李斯特菌屬，該代謝活性李斯特菌屬編碼其被施用的宿主中表達的靶抗原的免疫活性部分。
本發(fā)明部分基于施用疫苗的輔助使用可增強大量原發(fā)癌治療的發(fā)現(xiàn)，該疫苗由編碼癌癥相關(guān)的抗原(例如間皮素)的活的減毒的單核細胞增生性李斯特菌組成。除非另有說明，否則本發(fā)明的實施采用包括分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和藥物規(guī)程的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)完整解釋在文獻中，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，(Sambrook 等)；Methods inEnzymology(Academic Press, Inc. ) ；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel 等編輯)；Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc. , N.Y. ) ；Handbook of Pharmaceutical Excipients (Rowe 等編輯)；Vaccine(Plotkinand Orenstein, 2003)；以及 Vaccine Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Robinsin, Cranage 和 Hudson, 2003)。定義 用于表示在基因中突變或者在包含基因的細菌中突變的縮寫如下。例如，縮寫“李斯特菌屬AactA”是指缺失部分或者所有actA基因。三角形符號(Λ)表示缺失。包括上標負號(李斯特菌屬actA_)的縮寫是指該actA基因突變，例如缺失、點突變或者移碼突變，但不限于這些類型的突變?？蓪⒅笖?shù)縮寫，例如〃3e7〃是指3xl07。如包括所附權(quán)利要求的本文所使用，除文本另有明確說明外，諸如“一個”、“一種”、“所述”的詞匯的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)指示物。本文所引用的參考資料通過引用整體并入，并入的程度如同明確且單獨地指出各單獨的公開、通過GenBank登錄號所登記的序列、專利申請、專利、序列表、在序列表中的核苷酸或者寡肽或多肽序列、以及在所述公開和專利文獻中的圖片和照片通過引用并入。當應(yīng)用至人、哺乳動物、哺乳類受試者、動物、獸類受試者、安慰劑受試者、研究受試者、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體，“施用”是指(但不限于)使受試者、細胞、組織、器官或生物流體等接觸外源性脂質(zhì)、試劑、安慰劑、小分子、藥物試劑、治療劑、診斷劑或者組合物?！笆┯谩笨杀硎纠缰委?、預(yù)防、藥代動力學(xué)、研究、安慰劑和實驗方法。對細胞的“施用”涵蓋使試劑接觸細胞；以及試劑接觸流體，其中該流體接觸細胞?！笆┯谩币埠w通過試劑、結(jié)合組合物或者通過另一細胞的細胞的體外和離體方法。如與使用安慰劑施用或者不施用的相比較，可通過例如增加的生存時間(例如，對危及生命的增殖性疾患)；減小腫瘤尺寸；減少腫瘤數(shù)目；降低特異性組織的代謝；降低特異性組織的代謝；降低傳染物的滴度等來評估施用的結(jié)果。“治療”涵蓋有預(yù)期功效的施用?！爸委煛卑A(yù)防性(預(yù)防疾病)以及治療施用?！翱乖蔬f細胞”是用于呈遞抗原至T細胞的免疫系統(tǒng)的細胞。APC包括樹狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、邊緣區(qū)庫弗氏細胞、小膠質(zhì)細胞、朗氏細胞、T細胞、以及B細胞(參見，例如，Rodriguez-Pinto 和 Moreno(2OO5)Eur. J. Immunol. 35:1097-1105)。樹狀細胞出現(xiàn)在至少兩個譜系中。第一譜系包括pre-DCl、骨髓DCl和成熟DC1。第二譜系包括 CD34++CD45RiT 早期多功能 T 祖細胞、CD34++CD45RA+ 細胞、CD34++CD45RA++CD4+IL-3Ralpha++pro-DC2細胞、CD4+CDllc_類漿細胞pre_DC2細胞、淋巴人DC2類漿細胞源性DC2、以及成熟 DC2(參見，例如，Gilliet 和 Liu (2002) J. Exp. Med. 195:695-704 ;Bauer 等(2001)J. Immunol. 166:5000-5007 ；Arpinati 等(2000)Blood95:2484-2490 ；Kadowaki 等(2001)J. Exp. Med. 194:863-869 ；Liu(2002)Human Immunology 63:1067-1071 ;McKenna 等(2005)J. Virol. 79:17-27 ；0' Neill 等(2004)Blood 104:2235-2246 ;Rossi 和 Young(2005)J. Immunol. 175:1373-1381 ；Banchereau 和 Palucka(2005)Nat. Rev. Tmmunol. 5:296-306)。“減毒”和“減毒的”涵蓋經(jīng)修飾以降低對宿主的毒性的細菌、病毒、寄生蟲、感染生物、腫瘤細胞、感染生物中的基因等。宿主可以為人或動物宿主或者器官、組織或細胞。給出非限制性例子，可使細菌減毒以降低與宿主細胞的結(jié)合；以降低從一種宿主細胞擴散至另一宿主細胞；以降低宿主細胞中的細胞外生長；或者以降低在宿主細胞的細胞內(nèi)生長。通過測定諸如毒性指標、LD5tl、從器官中清除速率或者競爭系數(shù)可評估減毒(參見，例如，Auerbuch 等(2001) Infect. Immunity 69:5953-5957)。通常，減毒導(dǎo)致 LD5tl 增加至少 25% ;更通常至少50% ;最通常至少100% (2倍);常規(guī)至少5倍；更常規(guī)至少10倍；最常規(guī)至少50倍；經(jīng)常至少100倍； 更經(jīng)常至少500倍；以及最經(jīng)常至少1000倍；一般至少5000倍；更一般至少10，000倍；以及最一般至少50，000倍；并且最通常至少100，000倍?！皽p毒的基因”包括介導(dǎo)對宿主的毒性、病理或毒力；在宿主內(nèi)生長；或者在宿主內(nèi)存活的基因，其中基因以減輕、降低或者消除毒性、病理或毒力的方式來突變?！巴蛔兊幕颉卑ㄔ诨虻恼{(diào)控區(qū)、基因的編碼區(qū)、基因的非編碼區(qū)或其任何組合中的缺失、點突變、插入突變和移碼突變。“癌病癥”和“癌疾患”包括但不限于癌癥；腫瘤；腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成；以及諸如發(fā)育異常的癌癥前疾患。具有癌癥、腫瘤、癌癥前病癥、癌癥前疾患或者癌疾患等的哺乳類受試者涵蓋不僅包括癌癥、癌癥前疾患或腫瘤的哺乳類受試者，而且涵蓋已經(jīng)去除腫瘤、明顯消除癌癥(例如，通過化學(xué)療法或者手術(shù)或者單獨針對受試者免疫系統(tǒng))的哺乳類受試者。如在治療中使用的“有效量”包括但不限于可改善、逆轉(zhuǎn)、緩和或者預(yù)防醫(yī)學(xué)病癥或疾患的癥狀或跡象的量。除非另有明確或者以其他方式說明，“有效量”不限于足夠改善病癥的最小量；或者導(dǎo)致病癥的最佳或者最大改善的量。在初免和/或加強的施用的文本內(nèi)“有效量”是導(dǎo)致哺乳動物中免疫應(yīng)答的量?！凹毎饬黧w”涵蓋例如血清、血漿、血液、間質(zhì)液、腦脊液、分泌的流體、淋巴液、膽汁、汗液、糞便物和尿液?！凹毎饬黧w”可包括膠體或者混懸物，例如全血。李斯特菌屬細菌的“生長”是李斯特菌屬領(lǐng)域的術(shù)語，其涵蓋在諸如哺乳動物細胞的宿主細胞內(nèi)生長的李斯特菌屬細菌的細胞內(nèi)生長。盡管可通過光學(xué)顯微術(shù)、熒光顯微術(shù)或菌落形成單位(CFU)測定法來測定李斯特菌屬細菌的細胞內(nèi)生長(“生長”)，但是生長不受測量的任何技術(shù)限制。諸如李斯特菌屬抗原的量、李斯特菌屬核酸序列或者李斯特菌屬細菌脂質(zhì)特異性的生化參數(shù)可用于評估生長。介導(dǎo)生長的基因是特異性介導(dǎo)細胞內(nèi)生長的基因。特異性介導(dǎo)細胞內(nèi)生長的基因包括但不限于其中基因失活降低細胞內(nèi)生長速率但未可檢測地降低細胞外生長速率(例如，肉湯中的生長)的基因；或者其中基因失活降低細胞內(nèi)生長的速率的程度比對其降低細胞外生長的速率的程度更大的基因。為了提供非限制性例子，介導(dǎo)細胞內(nèi)生長的基因是其中它的缺失降低細胞內(nèi)生長至小于50%、小于40%、小于30%、小于20%或者小于10%的由野生型李斯特菌屬表現(xiàn)出的細胞內(nèi)生長的基因。為了提供進一步的非限制性例子，介導(dǎo)細胞內(nèi)生長的基因涵蓋其中它的缺失不僅降低細胞內(nèi)生長至小于50%的野生型李斯特菌屬的細胞內(nèi)生長，而且降低細胞外生長至約95%、90%、85%或80%的使用野生型李斯特菌屬所檢測的細胞外生長的基因。在該文本中，術(shù)語“約”是指±5%。
“殺死但具代謝活性” (KBMA)涵蓋任何含有修飾的基因組的細菌，例如其中基因組修飾足以預(yù)防菌落形成，但其中基因組修飾不足以基本上阻止或者破壞代謝。KBMA細菌不能形成如在瓊脂上或者宿主細胞體內(nèi)可檢測的菌落。為了提供非限制性例子，可使用諸如補骨脂素的交聯(lián)劑來修飾基因組。為了提供非限制性例子，在代謝中未被全部破壞的KBMA細菌是其中基因組僅在沒有調(diào)控、編碼、結(jié)構(gòu)或者生物功能的基因間區(qū)中含有交聯(lián)的一種。這對比于“活”細菌，其可形成菌落，盡管在一些實施方案中活細菌可以為減毒的?！皹悠贰笔侵竵碜匀?、動物、安慰劑或者研究樣品的樣品，例如，細胞、組織、器官、流體、氣體、氣溶膠、漿料、膠體或者凝結(jié)的材料?！皹悠贰币仓咐绨黧w或者組織樣品的細胞或者從流體或者組織樣品中分離的細胞。“樣品”也可表示從人或動物中新鮮取樣的細胞、組織、器官或流體；或者經(jīng)處理或儲存的細胞、組織、器官或者流體。細菌的“擴散”涵蓋“細胞至細胞擴散”，其是部分被囊泡介導(dǎo)的來自第一宿主細胞的細菌傳輸至第二宿主細胞。與擴散相關(guān)的功能包括但不限于例如，肌動蛋白尾的形成；偽足樣延長的形成；以及雙膜液泡的形成。·
“初免劑量”或者“初免用量”的“有效量”是指如與在沒有施用抗原的哺乳類受試者中免疫應(yīng)答相比較在哺乳類受試者中引起可測定免疫應(yīng)答的靶抗原的量。如本文所使用的“疫苗”是指由異源性蛋白組成或者由編碼異源性蛋白的核酸組成的組合物，使得當向哺乳動物施用疫苗時，異源性蛋白在哺乳動物中表達以用于引起免疫應(yīng)答的目的。免疫應(yīng)答可以為體液、細胞介導(dǎo)的或者兩者。如本文所使用的“初免疫苗(priming vaccine) ”是指包含以引起對目標抗原的免疫應(yīng)答的有效量向受試者或者宿主施用的試劑的疫苗。初免疫苗可編碼抗原，以及也可編碼諸如GM-CSF的各種免疫刺激細胞因子，其用于補充和激活抗原呈遞細胞。如本文所使用的“加強疫苗(boosting vaccine) ”是指包含編碼具有祀抗原的免疫活性部分的抗原的試劑的疫苗，以及該試劑可包含靶抗原、其片段和/或含有接合在靶抗原中通常不存在的區(qū)域的靶抗原的至少免疫活性部分的融合多肽?！凹訌妱┝俊被蛘摺凹訌娪昧俊钡摹坝行Я俊笔侵敢坏┫蛑耙呀?jīng)施用初免劑量的靶抗原的哺乳動物施用則引起對靶抗原的免疫應(yīng)答的抗原的量。如本文所使用的“載體組”或“疫苗組”包含初免載體或初免疫苗以及加強載體或加強疫苗，其中各自編碼共享免疫決定簇、交叉反應(yīng)免疫決定簇、共享抗原、免疫蛋白或肽或其片段之一?！翱乖笔侵负写碳ぶT如哺乳動物免疫系統(tǒng)的宿主免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生體液和/或細胞抗原特異性應(yīng)答的一種或者多種表位(線性、構(gòu)象或者兩者)或者免疫決定簇的分子。該術(shù)語與術(shù)語“免疫原”可交換使用。抗原可以是全蛋白、截短蛋白或者蛋白或肽的片段?？乖梢詾榈鞍椎奶烊淮嬖诘摹⑦z傳工程化的變體；或者可以為用于特別是在哺乳類受試者或者宿主中表達的最佳化密碼子。通常，B細胞表位至少包括約5個氨基酸，但也可少至3-4個氨基酸。諸如CTL表位的T細胞表位包括至少約7-9個氨基酸，并且輔助T細胞表位包括至少約12-20個氨基酸。通常，表位包括約7和15個氨基酸，例如，9、10、12或15個氨基酸。術(shù)語“抗原”表示兩個亞單位抗原(即，從完整生物體中分離和離散的抗原以及與天然抗原相關(guān)的抗原)。諸如抗獨特型抗體或其片段、以及可模擬抗原或抗原決定簇的合成肽模擬表位的抗體也涵蓋在如本文所使用的抗原的定義下。為了本發(fā)明，抗原可來自多種已知病原性病毒、細菌、寄生蟲和真菌的任意一種。它們也可來自癌癥。而且，為了本發(fā)明，“抗原”是指只要蛋白維持引起免疫應(yīng)答的能力則包括對天然存在的序列的通常在自然界中保守的諸如缺失、添加和取代的修飾的如本文所定義的蛋白。這些修飾可以為有意的，例如通過定點誘變；或者可以為偶然的，例如通過產(chǎn)生抗原的宿主的突變。本發(fā)明的抗原也可以為通過本領(lǐng)域已知方法最佳化的密碼子以改善在宿主中的它們的表達或者免疫原性。如本文所使用，“交叉反應(yīng)”免疫決定簇是指能夠引起對相關(guān)但并不相同抗原決定簇的免疫應(yīng)答的決定簇、表位或者抗原，例如HIV的交叉反應(yīng)決定簇是能夠引起對分化枝中HIV抗原的所有成員中兩個或者多個的免疫應(yīng)答的抗原。對抗原、載體或疫苗或者包含抗原的組合物的“免疫性應(yīng)答”或“免疫應(yīng)答”是在哺乳類受試者中對抗原或者存在于載體組中的抗原的體液和/或細胞免疫應(yīng)答的發(fā)展。“細胞免疫應(yīng)答”是通過T-淋巴母細胞和/或包括但不限于NK細胞和巨噬細胞的其他白血細胞介導(dǎo)的。本發(fā)明的T淋巴母細胞包括表達α βT細胞受體亞單位的T細胞或者表達Y δ受體的T細胞以及效應(yīng)子或者抑制子T細胞?！唉沉馨湍讣毎被蛘摺唉臣毎笔欠强贵w生成淋巴母細胞，其構(gòu)成免疫系統(tǒng)的細胞介導(dǎo)的臂的一部分。T細胞源于不成熟淋巴母細胞，該成熟淋巴母細胞由骨髓遷移至胸腺，其中它們經(jīng)歷在胸腺激素的定向下的成熟過程。基于它們識別和結(jié)合特異性抗原的能力，成熟T細胞變得具有免疫能力。當抗原結(jié)合淋巴母細 胞的表面受體時，觸發(fā)具有免疫能力的T細胞的激活。已知，為了產(chǎn)生T細胞應(yīng)答，必須在細胞內(nèi)合成抗原或者必須將抗原引入細胞內(nèi)，隨后通過蛋白酶體復(fù)合物將其處理為小肽，并且移位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/Golgi復(fù)合物分泌途徑以用于最后與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)級別I蛋白締合。功能細胞免疫包括抗原特異性細胞毒性T細胞(CTL)。當?shù)鞍讈碜匀祟愔袝r，如本文所使用的抗原特異性T細胞、CTL或者細胞毒性T細胞是指對與通過主要組織相容性復(fù)合物(MHC)或者人白細胞抗原(HLA)編碼的蛋白締合存在的肽抗原具有特異性的細胞。本發(fā)明的CTL包括激活的CTL，其在MHC的環(huán)境中被特異性抗原觸發(fā)；以及稱為由于再暴露于抗原以及可交叉反應(yīng)CTL中而變得再激活的T細胞的記憶CTL或者恢復(fù)CTL。本發(fā)明的CTL包括CD4+和CD8+T細胞。本發(fā)明的激活的抗原特異性CTL通過以下各項促進CTL對其特異的病原體或癌癥細胞感染的受試者的細胞的破壞和/或裂解尤其是趨化因子和細胞因子(包括但不限于巨噬細胞炎癥蛋白Ia(MIP-Ia)、MIP-IB和RANTES)的分泌；以及抑制疾病狀態(tài)的可溶性因子的分泌。本發(fā)明的細胞免疫是指通過T細胞的T輔助亞單位產(chǎn)生的抗原特異性應(yīng)答。輔助T細胞用于幫助刺激功能，以及集中針對顯示在它們的表面上與MHC分子締合的肽的T細胞的非特異性效應(yīng)細胞的活性。細胞免疫應(yīng)答也指細胞因子、趨化因子和通過激活的T細胞和/或包括由CD4和CD8 T細胞以及NK細胞衍生的那些的其他白血細胞生成的其他這些分子的生成。引起細胞免疫應(yīng)答的初免劑量或加強劑量或者包含初免劑量或加強劑量的組合物或疫苗通過呈遞在細胞表面處與MHC分子締合的抗原可用于敏化哺乳類受試者。將細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答定向在或者靠近在它們的表面處呈遞抗原的細胞。此外，抗原特異性T-淋巴母細胞使得可進一步保護免疫的宿主。通過諸如淋巴組織增生(淋巴母細胞激活)測定法、CTL細胞毒性細胞測定法或者通過測定在敏化的受試者中抗原的T-淋巴母細胞特異性的本領(lǐng)域已知的多種測定法可測定特定抗原刺激細胞介導(dǎo)的免疫性應(yīng)答的能力。這些測定法是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Erickson等,J. Immunol. (1993) 151:4189-4199 ；Doe 等；Eur. J. Immunol. (1994)24:2369-2376。測定細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法包括通過T-細胞群體來測定細胞內(nèi)細胞因子或細胞因子分泌；或者通過測定表位特異性T細胞(例如，通過四聚體技術(shù))(由McMichael，A.J.，和 O’ Callaghan, C. A.，J. Exp. Med. 187 (9) 1367-1371，1998 ；Mcheyzer-ffilliams, M.G.等,Immunol. Rev. 150:5-21, 1996 ；Lalvani, A.等，J. Exp. Med. 186:859-865，1997 綜述)。如本文所使用的免疫性應(yīng)答或者免疫應(yīng)答涵蓋刺激CTL的生成和/或輔助T細胞和/或抗體介導(dǎo)的免 疫應(yīng)答的生成或者激活的免疫性應(yīng)答或者免疫應(yīng)答。如本文所使用的“免疫性應(yīng)答”或者“免疫應(yīng)答”涵蓋以下效應(yīng)的至少一種或者多種通過B細胞生成抗體；和/或抑制T細胞和/或特異性定向抗原或者存在于目標載體、組合物或者疫苗中的抗原的T細胞的激活。在一些實施方案中，“免疫性應(yīng)答”或者“免疫應(yīng)答”涵蓋抑制T細胞的失活。如本文所使用，“增強的加強免疫應(yīng)答”是指通過加強劑量的引起如與通過初免劑量的單次施用引起的應(yīng)答相比較更大的可測定的免疫應(yīng)答的疫苗的施用。所謂“藥學(xué)上可接受的”或者“藥理上可接受的”是指不是生物學(xué)上期望或者另外期望的材料。如本文所使用，術(shù)語“試劑盒”是指包裝和/或標記的盡管并不必要同時但共同使用的組分。試劑盒可在單獨的容器中包括初免疫苗和加強疫苗。試劑盒也可在單獨的容器中包括初免疫苗和/或加強疫苗的組分。試劑盒可包括用于合并組分以配制適合于向哺乳動物使用的免疫原性組合物的組分?！爸委熥饔谩笔菧p緩與待施用疫苗的疾病相關(guān)的一種或多種癥狀?！邦A(yù)防作用”是對與待施用疫苗相關(guān)的疾病的一種或多種癥狀的抑制。如本文所使用“哺乳類受試者”或者“宿主”是指亞門脊索動物門的任意成員，包括但不限于人和包括諸如黑猩猩和其他猿類以及猴類的非人靈長類的其他靈長類；家畜，例如牛、羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)哺乳動物，例如狗和貓；包括嚙齒類動物的實驗室動物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。術(shù)語不表示特定的年齡。因此，旨在包括成年和新生個體。如本文所使用“輻射療法”或“放射療法”是指作為癌癥治療的一部分的電離輻射的醫(yī)學(xué)用途以控制惡性細胞。放射療法可用于治愈性、輔助性或緩和性治療。放射療法的合適類型包括常規(guī)外粒子束放射療法；立體定位的輻射療法(例如，Axesse,身寸波刀(Cyberknife) > 伽瑪?shù)?、Novalis、Primatom、Synergy> X-Knife、TomoTherapy或者Trilogy)，；強度調(diào)制的輻射療法；粒子療法(例如，質(zhì)子療法)；短程治療(brachytherapy);遞送放射性同位素等。該清單并非旨在限制。弓I起對靶抗原的免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明涵蓋用于在哺乳動物中引起免疫應(yīng)答的方法。靶抗原可以為與疾病狀態(tài)相關(guān)的那些，例如，如在癌細胞或者病原體上存在被識別的那些。在原發(fā)癌治療之后，施用包含編碼和表達靶抗原的免疫活性部分的減毒的代謝活性李斯特菌屬的疫苗。I.靶抗原可在本發(fā)明的治療方案中使用的靶抗原的例子列于下表中。靶抗原也可以為包含在表中列出的抗原的免疫活性部分的片段或者融合多肽。表I.抗原ImI參考文獻
_胂瘤抗原_
間皮素GenBank登錄號NM-005823; U40434; NM-O
13404; BC003512 (也參見例如Hassan等(2004)Clin. Cancer Res. 10:3937-3942; Muminova等(2004) BMC Cancer 4: 19; Iacotmzio-Donaluie 等
(2003)Cancer Res. 63:8614-8622), 維爾姆斯腫瘤-I相關(guān)的蛋WT-I同種型A(GenBank登錄號NM 000378~白(Wt-I),包括同種型A; NP 000369)。WT-I同種型B(GenBank登錄號同種型B;同種型C；同NM 024424 ; NP—077742) 。 WT-I同種型種型 D。C(GenBank 登錄號 NM 024425: NP—077743)。·
WT-I 同種型 EKGenBank 登錄號 NM 024426;
__NP—077744)。_
角質(zhì)層糜蛋白酶(SCCE)及GenBank登錄號NM 005046 ; NM_139277; 其變體 AF332583。也參見例如，Bondurant 等(2005) Clin. __Cancer Res. 11:3446-3454: Santin 辛(2004) Gynecol.
權(quán)利要求
1.一種用于罹患癌癥的哺乳動物的輔佐治療的方法，所述方法包括在向所述哺乳動物施用主要療法之前或之后向所述哺乳動物施用有效量的組合物作為輔佐治療以去除或者殺死表達癌癥抗原的癌癥細胞，所述組合物包含減毒的、代謝活性李斯特菌屬，所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬編碼所述癌癥抗原的可表達的、免疫活性部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述主要療法之后施用所述組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2中任一項所述的方法，其中所述主要療法包括從所述哺乳動物中去除所述癌癥細胞的手術(shù)；殺死所述哺乳動物中的所述癌癥細胞的輻射療法；或者所述手術(shù)以及所述輻射療法二者。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述施用步驟包括以多劑量施用所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬，所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬編碼所述癌癥抗原的可表達的、免疫活性部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬具有使ActA失活的突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬具有使InlB失活的突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述減毒的、代謝活性李斯特菌屬是 ΔactAΔinlB。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述李斯特菌屬被殺死但具代謝活性 ("KMA")。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述癌癥抗原是全部或者一部分間皮素。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中在所述施用步驟之前，已經(jīng)預(yù)先向所述哺乳動物施用表達全部或者一部分所述癌癥抗原的來自人細胞系的細胞，其中所述細胞已經(jīng)被重組修飾以生成和分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，以及其中所述細胞已經(jīng)被修飾以防細胞分裂。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述癌癥選自胰腺癌、非小細胞肺癌、卵巢癌和間皮瘤。
全文摘要
本文提供初免-加強方案以及本文所使用的材料。初免-加強方案增強對靶抗原的免疫應(yīng)答。用于加強的疫苗由編碼可表達的抗原的重組減毒的代謝活性李斯特菌屬(Listeria)組成，該可表達的抗原與靶抗原交叉反應(yīng)。在一些例子中，免疫應(yīng)答是細胞免疫應(yīng)答。
文檔編號C12N15/75GK102947452SQ201180030420
公開日2013年2月27日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月23日
發(fā)明者T·W·杜本斯蓋, D·G·布洛克斯泰德, M·梁, K·S·巴哈賈特 申請人:艾杜羅生物科技公司