專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)魏思?xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌的制作方法
單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌本發(fā)明涉及單核細(xì)胞增生李斯特菌(Zi1Sieria monocytogenes)物種的遺傳修飾細(xì)菌，其中轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，其特征在于，它在基因組水平包含起內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物作用的人工序列，本發(fā)明也涉及該細(xì)菌的用途、以及用于定性地和/或定量地檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的樣品中的存在的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
單核細(xì)胞增生李斯特菌是一種致病性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。因?yàn)樵斐衫固鼐?，它是最致命的食物傳播的病原體之一。諸如食物樣品或臨床樣品(如血液、組織或糞便)等樣品中的病原體的檢測(cè)，日益變得重要。但是，為了清楚地鑒別和任選地定量在樣品中包含的細(xì)胞，必須提供用于它們的檢測(cè)和定量的可靠方法。·自聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的首次實(shí)現(xiàn)以來(lái)，該分子生物學(xué)工具已經(jīng)發(fā)展成為改進(jìn)的微生物檢測(cè)提供許多機(jī)會(huì)的方法?；赑CR的方法要變成國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)重要的必要條件是，內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物(IAC)。IAC是存在于同一樣品試管中的非靶物DNA序列，其與靶序列同時(shí)共同擴(kuò)增。在沒(méi)有IAC的PCR中，陰性結(jié)果是不確定的，因?yàn)樗梢员硎荆瑳](méi)有靶序列存在，但是也可以表示，擴(kuò)增反應(yīng)被各種因素抑制。因此，歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(European StandardizationCommittee)協(xié)同國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織(International Standard Organisation, ISO)提出了診斷性PCR的一般指南，該指南要求IAC的存在(IS0/DIS 22174)。IAC應(yīng)當(dāng)能夠競(jìng)爭(zhēng)使用相同的引物結(jié)合位點(diǎn)作為靶PCR，并在實(shí)時(shí)PCR中借助于使用的探針染料的長(zhǎng)度和熒光波長(zhǎng)可清楚地與靶DNA擴(kuò)增子辨別開(kāi)?？傊鰧?duì)照物的特征應(yīng)當(dāng)接近靶物的特征，盡管如此，還會(huì)確保對(duì)靶物檢測(cè)的可忽略不計(jì)的干擾。IAC在PCR試驗(yàn)中的應(yīng)用，會(huì)確保陰性結(jié)果的可靠性；但是，僅僅對(duì)于在PCR中促進(jìn)靶物擴(kuò)增的酶反應(yīng)而言，和對(duì)于以在實(shí)時(shí)PCR中使用熒光探針為基礎(chǔ)的定量和確認(rèn)檢測(cè)反應(yīng)而言，確實(shí)如此。但是，這類(lèi)對(duì)照物沒(méi)有覆蓋最初的方法步驟(諸如樣品制備和從樣品基體中分離/純化DNA)，如果要覆蓋的話，通過(guò)外部對(duì)照物進(jìn)行檢查。這沒(méi)有考慮到單個(gè)樣品的對(duì)照物，因而陰性結(jié)果暗示研究的樣品(例如食物)的病原體狀態(tài)的假驗(yàn)證的可能性。因此，內(nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物(ISPC)是必要的，其應(yīng)當(dāng)覆蓋使用常規(guī)或?qū)崟r(shí)PCR對(duì)病原體進(jìn)行可靠定量檢測(cè)所必需的所有方法步驟。就食物和水傳播的RNA病毒的檢測(cè)而言，已經(jīng)報(bào)道了貓嵌杯樣病毒和噬菌體MS2 作為內(nèi)部對(duì)照物的用途(Mattison 等人(2009) Int. J. Food Microbiol. 132，73-77; Di 等人(2010) J. Virol. Methods 165，57-63; Dreier 等人(2005) J. Clin.Microbiol. 43， 4551-4557)。Murphy 等人(2007，Int. J. Food Microbiol. 120, 110-119)公開(kāi)了一種細(xì)菌內(nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物，其用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌和腸道沙門(mén)氏菌(Salmonellaenterica)。該對(duì)照物是基于包括腸道沙門(mén)氏菌的綠熒光基因(gfp)片段和iroB基因片段的重組大腸桿菌菌株。所述對(duì)照物沒(méi)有用于定量目的，作為基礎(chǔ)的革蘭氏陰性的大腸桿菌菌株在樣品制備過(guò)程中會(huì)表現(xiàn)出與單核細(xì)胞增生李斯特菌相比不同的特征。結(jié)果，需要新的可靠方法，所述方法允許通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)檢測(cè)和定量被污染樣品中的病原體單核細(xì)胞增生李斯特菌。已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用IAC+、Δ -prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe菌株作為覆蓋整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的內(nèi)部過(guò)程對(duì)照物，可以解決該問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面是單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌，其中轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，其特征在于，它在基因組水平包含起內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物(IAC)作用的人工序列?！?br> 單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌是指，使用基因工程技術(shù)改變它的遺傳物質(zhì)而產(chǎn)生的單核細(xì)胞增生李斯特菌物種。遺傳修飾包括插入和/或刪除基因。例如，可以如在 BSckmann 等人(1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653 中所公開(kāi)地,刪除 prfA 基因。轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座是指，編碼蛋白PrfA的核酸序列。這是705堿基對(duì)的序列(Leimeister-Wjichter 等人，1990; Proc Natl Acad Sci USA, 87, 8336-40;Glaser等人，2001; Science, 294，849-52)。該基因位于在單核細(xì)胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素基因(IisA) (GeneID: 987031; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/98703l#pageTop)周?chē)娜旧w區(qū)域內(nèi)。關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子PrfA的信息也參見(jiàn)Scortti等人(2007) Microbes and Infection 9, 1196-1207,它通過(guò)引用并入本文。PrfA 控制單核細(xì)胞增生李斯特菌的關(guān)鍵毒力決定簇的表達(dá)。PrfA是27 kDa的237殘基蛋白。從基因組基因座中刪除轉(zhuǎn)錄因子PrfA，會(huì)使該突變體成為非病原體。根據(jù)本發(fā)明，內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物(IAC)是指，在PCR反應(yīng)過(guò)程中存在于樣品試管中并與某些祀序列一起共擴(kuò)增的人工核酸序列，正如Hoorfar等人(2003) Lett. Appl.Microbiol. 38，79-80所定義的。IAC的存在，允許測(cè)定假陰性結(jié)果。所述IAC序列可以是任意多核苷酸序列。該序列的大小可以變化，這取決于具體的PCR試驗(yàn)及其反應(yīng)條件。所述IAC序列優(yōu)選地是單拷貝核苷酸序列，即在單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的單倍體基因組中僅出現(xiàn)I次的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述IAC序列是這樣的序列所述序列不存在于單核細(xì)胞增生李斯特菌或預(yù)期天然存在于待測(cè)樣品中的任何其它物種中，也不存在于樣品基體本身中。優(yōu)選地，所述IAC序列包括在5’和3’末端處的引物結(jié)合序列。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述IAC是競(jìng)爭(zhēng)性IAC，即在相同條件下，在同一PCR管中，在實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中，遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC和野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶序列prfA用一組共同的引物進(jìn)行擴(kuò)增。因此，所述IAC的引物結(jié)合序列特別優(yōu)選地與野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組PrfA基因座的引物結(jié)合序列相同。在本發(fā)明的一個(gè)非常特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人工IAC序列是根據(jù)SEQ IDNO: I 的 100 bp 序歹Ij
5Λ-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGAAGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3^。該IAC 序列公開(kāi)在 Rossmanith 等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771 中。根據(jù)本發(fā)明，可以使用與SEQ ID NO: I具有超過(guò)80%同源性的IAC序列。優(yōu)選地，所述序列同源性超過(guò)90%，更優(yōu)選地超過(guò)95%。根據(jù)本發(fā)明，如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe菌株是優(yōu)選的。所述單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe菌株是單核細(xì)胞增生李斯特菌血清變型l/2a臨床制備物。該菌株是在科學(xué)應(yīng)用中最普遍的模型生物體(GenBank: AL591978; Glaser等人(2001) Science 294 (5543)， 849-52)。本發(fā)明的另一個(gè)方面是遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe菌株，其中轉(zhuǎn)錄 因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，所述菌株包括SEQ ID N0:1的內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照序列(IAC)，并于2010年5月20日在DSM 23639下作為單核細(xì)胞增生李斯特菌AprfA/+IAC保藏在 DSMZ (德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Braunschweig))。根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌滿(mǎn)足對(duì)可靠?jī)?nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物提出的要求。它與野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌盡可能密切地相關(guān)。它不會(huì)干擾借助于實(shí)時(shí)PCR的主檢測(cè)反應(yīng)，用于檢測(cè)所述對(duì)照物的基礎(chǔ)化學(xué)反應(yīng)的性能與所述主反應(yīng)相同。另外，使用單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞作為ISPC，允許覆蓋在食物病原體檢測(cè)中包括的必需方法的從樣品制備至使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行檢測(cè)的整個(gè)進(jìn)程。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，如上指出的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌用于定性地和/或定量地檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的樣品中的存在的用途。優(yōu)選地，所述樣品是食物樣品、體液(尤其是血液、血漿或血清)、水或組織樣品。示例性的樣品包括、但不限于食物(例如母牛、母羊、雌山羊、母馬、驢、駱駝、牦牛、水牛和馴鹿的奶，乳制品，肉牛、山羊、羔羊的肉，羊肉，豬肉，蛙腿，小牛肉，嚙齒動(dòng)物，馬，袋鼠，禽類(lèi)包括雞、火雞、鴨、鵝、家鴿或野鴿、鴕鳥(niǎo)、鴯鹋，海鮮包括魚(yú)類(lèi)如鮭魚(yú)和羅非魚(yú)和貝類(lèi)如軟體動(dòng)物和甲殼類(lèi)動(dòng)物和蝸牛，肉制品，植物產(chǎn)品，種子，來(lái)自禾本科植物的谷物包括玉米、小麥、大米、大麥、高粱和小米，來(lái)自非禾本科植物的谷物包括蕎麥、莧菜紅和奎藜籽，豆科植物包括豆類(lèi)、花生、豌豆和扁豆，堅(jiān)果包括杏仁、核桃、松子，油料種子包括向日葵、油菜和芝麻，蔬菜，如根菜類(lèi)包括馬鈴薯、木薯和蕪菁，葉菜類(lèi)包括莧菜紅、菠菜和羽衣甘藍(lán)，海蔬菜類(lèi)包括掌狀紅皮藻、昆布和dabberlocks，莖蔬菜包括竹筍、nopales和蘆筍，開(kāi)花蔬菜包括洋薊、綠花椰菜、黃花萊，果實(shí)蔬菜類(lèi)包括西葫蘆、秋葵和茄子，水果，草藥和香料)，全血，尿，痰，唾液，羊水，血漿，血清，肺灌洗液和組織(包括、但不限于肝、脾、腎、肺、腸、腦、心臟、肌肉、胰腺等)。技術(shù)人員會(huì)明白，從上述示例性樣品中的任一種或所述示例性樣品的混合物或包含一種或多種所述示例性樣品的組合物得到的裂解物、提取物或(均質(zhì)化的)材料，也是在本發(fā)明范圍內(nèi)的樣品。特別優(yōu)選的是食物樣品。所述食物樣品優(yōu)選地是乳制品，優(yōu)選奶，特別是生奶、奶粉、酸奶、奶酪或冰淇淋，魚(yú)制品，優(yōu)選生魚(yú)，肉制品，優(yōu)選生肉，肉灌制品或香腸，沙拉灌制品，巧克力，蛋或蛋制品如
蛋黃醫(yī)。在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的特別優(yōu)選的食物樣品是，通常已知會(huì)包含潛在致病性的單核細(xì)胞增生李斯特菌的樣品，例如奶酪。優(yōu)選地，如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌被用作基于實(shí)時(shí)PCR的試驗(yàn)的內(nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物(ISPC)。根據(jù)本發(fā)明，ISPC是在樣品制備之前加入原始樣品中的模型生物體。ISPC會(huì)提供從樣品制備至靶分子檢測(cè)的整個(gè)分析鏈的有效性的量度，并覆蓋使用常規(guī)或?qū)崟r(shí)PCR可靠地定量檢測(cè)病原體所需的所有方法步驟。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，一種用于檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑 似被所述致病性微生物污染的樣品中的存在的方法，所述方法包括下述步驟
(a)向所述樣品中加入預(yù)定量的如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的細(xì)胞，
(b)用提取溶液溫育所述樣品，
(c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，分離DNA;
(d)應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR，其中使用(i)對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組prfA基因座和如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC序列特異性的引物；和(ii)能夠與所述prfA基因座特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，和能夠與所述IAC序列特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，
(e)定性地和/或定量地測(cè)定通過(guò)步驟(d)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，和
(f)從步驟(e)確定和/或計(jì)算野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞在疑似被所述微生物污染的原始樣品中的存在和/或量。在步驟(a)中，將預(yù)定量的如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的細(xì)胞加入樣品中。加入樣品中的量取決于樣品大小。優(yōu)選地，將25-100000 CFU (菌落形成單位)的量的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌加入例如25 g樣品中。特別優(yōu)選的是，100-5000 CFU/25 g 的量。菌落形成單位(CFU)是樣品中的活細(xì)胞的量度。它可以通過(guò)培養(yǎng)方法來(lái)測(cè)定，例如通過(guò)將樣品均勻地鋪展在細(xì)菌培養(yǎng)凝膠上。在適當(dāng)培養(yǎng)條件下溫育，會(huì)導(dǎo)致菌落形成。菌落的數(shù)目代表樣品中的菌落形成單位的數(shù)目?；蛘撸ㄟ^(guò)熒光染色的細(xì)胞的顯微鏡計(jì)數(shù)法，例如使用 Live/Dead BacLight 細(xì)菌生存力試劑盒(Molecular Probes, Willow Creek,OR,美國(guó))或相當(dāng)?shù)纳虡I(yè)方法，可以測(cè)定細(xì)胞數(shù)。在步驟(b)中使用的提取溶液是水溶液或緩沖溶液。它通常具有大于5且小于9、優(yōu)選大于6且小于8、更優(yōu)選在6. 5至7. 5之間的pH值。所述提取溶液可以額外包含最多20%的一種或多種水可混溶的有機(jī)溶劑?？梢栽诒景l(fā)明方法中使用的緩沖液優(yōu)選地選自磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液(PBS)、2_氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(TRIS)緩沖液、TRIS緩沖鹽水緩沖液(TBS)和 TRIS/EDTA (TE)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取溶液另外包含MgCl2和/或離子液體。所述MgCl2如果存在的話，通常以O(shè). 05-3 M、優(yōu)選O. 1-2 M、更優(yōu)選0.3-1 M的濃度存在。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述提取溶液另外包含至少一種離液劑和至少一種去污劑。所述離子液體如果存在的話，通常以O(shè). 5-20重量％、優(yōu)選1-10重量％的濃度存在，這基于混合物的重量。所述離子液體可以是一種離子液體或2種或更多種離子液體的混合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述提取溶液包含MgCl2或離子液體。在本發(fā)明中使用的離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和通常無(wú)機(jī)的陰離子組成的離子物質(zhì)。它們不含有任何中性分子，且通常具有低于373 K的熔點(diǎn)。關(guān)于離子液體的綜述是，例如，R. Sheldon “Catalytic reactions in ionic liquids，，，Chem. Commun.,2001, 2399-2407; M. J. Earle, K. R. Seddon “Ionic liquids. Green solvent forthe future”，Pure AppI. Chem. , 72 (2000), 1391-1398; P. ffasserscheid, ff.Keim^Ionische Fliissigkeiten - neue Losungen fiir dieObergangsmetallkatalyse，，[離子液體-過(guò)渡金屬催化的新穎溶液]，Angew. Chem. , 112 (2000), 3926-3945; T.Welton“Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis，，，Chem. Rev. , 92 (1999), 2071-2083 或 R. Hagiwara, Ya. ItoiiRoom temperature ionic liquids of alkylimidazoIium cations and fluoroanions”，J. Fluorine Chem. , 105(2000)， 221-227)。一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的通式1(1_的所有離子液體，尤其是可與水混溶的那些，適用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。如果離子液體或MgCl2存在的話，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述提取溶液不包含去污劑，這意味著，不向所述提取溶液中加入陰離子型去污劑、兩性離子型去污劑或非離子型去污劑，如十二烷基硫酸鈉、CHAPS、Lutensol A0-7。本文使用的術(shù)語(yǔ)“離液劑”表示這樣的物質(zhì)所述物質(zhì)造成蛋白或核酸的無(wú)序，例如，但不限于，在保持一級(jí)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)，改變蛋白或核酸的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。示例性的離液劑包括、但不限于鹽酸胍(GuHCl)、硫氰酸胍(GuSCN)、硫氰酸鈉(KSCN)、碘化鈉、高氯酸鈉、脲等等。離液劑和離液鹽的描述可以參見(jiàn)，例如，K. Hamaguchi等人(Proc.Natl. Acad. Sci. (1962) 62:1129-1136)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“去污劑”表示，具有親脂以及親水(即兩親)特征的分子。根據(jù)本發(fā)明的去污劑可以包含，例如，脂肪酸殘基和親水的(例如陰離子的或陽(yáng)離子的)部分。此外，可能向所述提取溶液中加入一種或多種其它物質(zhì)如去穩(wěn)定劑或生物聚合物降解酶，所述酶有助于降解在特定樣品中存在的物質(zhì)。一個(gè)實(shí)例是，向包含大量膠原和/或淀粉的食物樣品中加入淀粉降解酶。所述溫育通常在18°C至50°C之間、優(yōu)選25°C至45°C之間、更優(yōu)選30V至42°C之間的溫度進(jìn)行。通常用所述提取溶液溫育樣品10分鐘至6小時(shí)、優(yōu)選20分鐘至I小時(shí)的時(shí)間。為了促進(jìn)樣品的溶解，例如可以在用提取溶液溫育之前，使用stomacher將所述樣品勻漿化。當(dāng)在溫育過(guò)程中攪拌混合物時(shí)，會(huì)進(jìn)一步支持和/或加速溶解。其它提取方法可以參見(jiàn)例如Brehm_Stecher等人(2009) Journal of FoodProtection 72: 1774-1789。根據(jù)本發(fā)明，在步驟(c)中分離出細(xì)菌材料的DNA。本領(lǐng)域已知的各種方法可以用于提取DNA,例如在下述文獻(xiàn)中公開(kāi)的方法Sambrook等人(1989) Molecular cloning:a laboratory manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y0一般而言，DNA提取包括細(xì)胞裂解和DNA純化，所述純化通過(guò)沉淀或?qū)Σ煌孜?例如二氧化硅)的特異性結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞裂解可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)酶促方法、珠方法、聲處理、去污劑方法或它們的組合。優(yōu)選地，采用去污劑方法。適用于酶促細(xì)胞裂解的酶是,例如,溶菌酶、溶葡萄球菌酶、消解酶、纖維素酶、變?nèi)芫?、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶。適用于細(xì)胞破碎的珠子是由玻璃、陶瓷、鋯或鋼制成。在將珠子加給細(xì)胞以后，攪拌或搖動(dòng)所述混合物。例如可以用普通的實(shí)驗(yàn)室渦旋攪拌器進(jìn)行攪拌，或在特殊設(shè)計(jì)的夾子中攪拌。·根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞裂解的另一種方法是聲處理。該方法包括將超聲(通常20-50kHz)應(yīng)用在樣品上?；谌ノ蹌┑募?xì)胞裂解會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞周?chē)念?lèi)脂屏障的破壞。合適的去污劑可以選自非離子型去污劑、兩性離子型去污劑和離子型去污劑，例如CHAPS、Triton X或TWEEN ο優(yōu)選地，使用離子型去污劑。合適的離子型去污劑的一個(gè)實(shí)例是SDS。除了去污劑的選擇以外，最佳細(xì)胞裂解的其它重要考慮因素包括緩沖液、pH、離子強(qiáng)度和溫度
裂解溶液通常具有大于5且小于9、優(yōu)選大于6且小于8、更優(yōu)選6. 5和7. 5的pH值?？梢允褂玫木彌_液優(yōu)選地選自磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水緩沖液(PBS)、
2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(TRIS)緩沖液、TRIS緩沖鹽水緩沖液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。任選地，可以將一種或多種螯合劑加入裂解溶液中，以隔離二價(jià)陽(yáng)離子。合適的螯合劑是，例如，EDTA (乙二胺四乙酸)、EGTA (乙二醇四乙酸)或乙二胺。優(yōu)選地，使用EDTA。上述的細(xì)胞裂解方法之后通常進(jìn)行離心，以便從細(xì)胞物質(zhì)中分離出DNA。技術(shù)人員可以容易地確定離心參數(shù)。通常，如在Sambrook等人(1989) Molecular cloning: alaboratory manual,第 2 版· Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y.中所公開(kāi)地,進(jìn)行離心。在細(xì)胞裂解以后，通常通過(guò)加入醇(優(yōu)選地乙醇或異丙醇)來(lái)沉淀DNA。另外，所述DNA可以以下述形式提供所述形式適合使用可商業(yè)得到的DNA分離試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，所述試劑盒諸如NucleoSpin 組織試劑盒和支持方案(用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)(Machery-NageI，Diiren,德國(guó))或Nexttec 試劑盒(用于來(lái)自細(xì)菌的基因組DNA)(Nexttec GmbH Biotechnologie, Leverkusen,德國(guó))。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(C)中，在DNA分離之前，分離細(xì)菌材料。該額外步驟是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗试S在得到的PCR樣品中實(shí)現(xiàn)更高的DNA濃度。細(xì)菌材料的分離，可以通過(guò)任意已知的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，如離心、過(guò)濾、介電電泳和超聲或親和結(jié)合，例如使用抗體、凝集素、病毒結(jié)合蛋白、適體或抗微生物肽(AMP)，它們優(yōu)選地固定化在珠子上。優(yōu)選地通過(guò)過(guò)濾或離心，最優(yōu)選地通過(guò)離心，分離細(xì)胞。當(dāng)復(fù)雜的樣品包含用本發(fā)明方法難以或不能提取的物質(zhì)時(shí)，特別地需要過(guò)濾提取的樣品。通常，這些物質(zhì)包括淀粉和/或纖維。但是，從提取混合物中分離細(xì)胞的優(yōu)選方法是離心。根據(jù)樣品基體，可以重復(fù)溫育步驟I次或幾次，例如2次、3次、4次、5次或10次。在這些溫育步驟之間，可以通過(guò)例如離心，從上清液中分離細(xì)菌材料和殘留的樣品基體。在分離細(xì)菌材料以后，優(yōu)選地用水、緩沖溶液和/或含有去污劑的溶液洗滌細(xì)胞。所述洗滌步驟可以重復(fù)數(shù)次。在步驟(d)中，應(yīng)用PCR，優(yōu)選實(shí)時(shí)PCR。實(shí)時(shí)PCR是一種用于檢測(cè)和測(cè)量在每個(gè)PCR循環(huán)過(guò)程中產(chǎn)生的產(chǎn)物的方法，所述產(chǎn)物與PCR開(kāi)始之前的模板核酸的量成比例。得到的信息，諸如擴(kuò)增曲線，可以用于定量模板核酸序列的初始量。所述檢測(cè)優(yōu)選地基于，在設(shè)定的溫度，在每個(gè)循環(huán)中監(jiān)測(cè)熒光。通常，使用光學(xué)裝 置來(lái)收集存在于樣品中的特定熒光染料的特定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)，從而監(jiān)測(cè)熒光。來(lái)自樣品的熒光穿過(guò)用于檢測(cè)在背景以上的熒光的閾值時(shí)的循環(huán)，稱(chēng)作循環(huán)閾值Ct，并允許定量起始模板。PCR條件沒(méi)有特別限制，但是可以為每個(gè)PCR裝置選擇最佳條件。例如，可以使用下述條件
-雙鏈DNA向單鏈DNA的熱變性通常在約90-98 °C、優(yōu)選地在約92-96 °C進(jìn)行加熱，通常持續(xù)約3秒至I分鐘，優(yōu)選地約30秒至I分鐘。-退火通常在約40-70°C、優(yōu)選地在55_65°C進(jìn)行加熱，通常持續(xù)約5秒至2分鐘，優(yōu)選地約30秒至90秒。- DNA延伸反應(yīng)通常在約60_75°C、優(yōu)選地在約70_74°C進(jìn)行加熱，通常持續(xù)約10秒至3分鐘，優(yōu)選地約30秒至2分鐘。-反應(yīng)液中的Mg離子濃度通常約1-5mM,優(yōu)選約I. 5-3. 5 mM。該反應(yīng)通常在約20-50個(gè)循環(huán)中、優(yōu)選地在約45個(gè)循環(huán)中進(jìn)行，由此可以將靶DNA擴(kuò)增至可檢測(cè)的水平?？梢允褂萌我馍虡I(yè)的實(shí)時(shí)PCR裝置。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d) (i)，使用對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組prfA基因座和如上定義的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC序列特異性的引物。一般而言，術(shù)語(yǔ)“引物”表示短核酸分子，諸如長(zhǎng)度為9個(gè)或更多個(gè)核苷酸的DNA寡核苷酸，其與沿著靶核酸(即基因組prfA基因座和IAC序列)的一條鏈的一個(gè)區(qū)段互補(bǔ)，其中引物的目的是啟動(dòng)沿著所述鏈的更長(zhǎng)核酸的核酸復(fù)制。根據(jù)本發(fā)明，15-40個(gè)核苷酸的引物是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“引物”用于表示側(cè)接要擴(kuò)增的靶序列的引物對(duì)。優(yōu)選地，在步驟(d) (i)中使用的引物是Lipl和Lip2。Lipl 的序列是:5,-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC-3, (SEQ ID NO: 2)，Lip2 的序列是:5,-GTG TAA TCT TGA TGC CAT CAG G_3, (SEQ ID NO: 3)。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d) (ii)，使用能夠與所述prfA基因座特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，和能夠與所述IAC序列特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“特異性地雜交”是指，可檢測(cè)地且特異性地結(jié)合。在使與非特異性核酸的可檢測(cè)結(jié)合的可察覺(jué)量最小化的雜交條件下，多核苷酸、寡核苷酸及其片段會(huì)與核酸鏈選擇性地雜交。熒光標(biāo)記的寡核苷酸是，表現(xiàn)出通常共價(jià)連接的熒光體的寡核苷酸。熒光體是一種化學(xué)化合物，當(dāng)通過(guò)暴露于特定波長(zhǎng)的光而被激發(fā)時(shí)，其會(huì)發(fā)射光(熒光)，例如在不同的光波長(zhǎng)。優(yōu)選地，能夠與所述prfA基因座和所述IAC序列特異性地雜交的寡核苷酸探針會(huì)表現(xiàn)出不同的熒光體，所述熒光體發(fā)射不同波長(zhǎng)的光。這允許一個(gè)探針獨(dú)立于其它探針的檢測(cè)。
通常用于實(shí)時(shí)PCR的突光標(biāo)記的探針是例如LightCycler (雜交)探針、分子信標(biāo)或水解探針(也稱(chēng)作TaqMan 探針)。優(yōu)選地,使用水解探針。LightCycler探針利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)。就該方法而言，為每個(gè)靶序列使用2種分別與FRET供體和FRET受體結(jié)合的不同寡核苷酸探針。這些探針肩并肩地結(jié)合靶序列，使熒光體靠近。分子信標(biāo)(Tyagi等人，Nat. Biotechnol. 14:303-8，1996)是與報(bào)告突光體和猝滅劑結(jié)合的寡核苷酸探針。在5’末端上的核苷酸與在3’末端上的核苷酸互補(bǔ)，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因?yàn)闊晒怏w和猝滅劑的靠近，不會(huì)觀察到熒光。在實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中，所述探針與靶序列的雜交，會(huì)導(dǎo)致報(bào)告物-猝滅劑距離的增加，從而產(chǎn)生報(bào)告物的熒光。優(yōu)選地，使用水解探針(TaqMan 探針)(Lee等人，NucleicAcidsRes.21:3761-6, 1993)。這些探針也利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)。所述探針表現(xiàn)出在一端的熒光報(bào)告物和在相反一端的熒光猝滅劑。因?yàn)閳?bào)告物與猝滅劑的緊密靠近，報(bào)告物熒光的檢測(cè)被抑制。在PCR的退火階段，引物和探針都會(huì)與DNA靶物對(duì)合。新DNA鏈的聚合會(huì)導(dǎo)致探針的降解(通過(guò)聚合酶的5’ -3’外切核酸酶活性)和熒光報(bào)告物與猝滅劑的物理分離，從而導(dǎo)致熒光的增加?？梢栽趯?shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀中檢測(cè)和測(cè)量熒光，且使用與產(chǎn)物指數(shù)增加相對(duì)應(yīng)的它的幾何增加來(lái)確定在每個(gè)反應(yīng)中的閾值循環(huán)(Ct)(參見(jiàn)下面)。示例性的報(bào)告物包括，但不限于6_羧基熒光素；羧基熒光素(FAM) ;二吡咯亞甲基二氟化硼(BODIPY);吖啶、均二苯乙烯、6-羧基-熒光素(HEX)、TET (四甲基熒光素)、6-羧基-X-羅丹明(R0X)、羅丹明-6G、德克薩斯紅、2' ,V -二甲氧基-4'，5' -二氯-6-羧基熒光素(JOE)、Cy 3、Cy 5、VIC (Applied Biosystems)、LC Red 640、LC Red705、德克薩斯紅、Yakima Yellow 、以及它們的衍生物。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用選自FAM和HEX的報(bào)告物。示例性的猝滅劑包括，但不限于黑洞猝滅劑(W0 01/86001 Al)如BHQ1 和BHQ2 , MGB (小溝結(jié)合劑，EP 0819133 BI)、N, N，V ,N' _四甲基_6_羧基羅丹明(TAMRA)、Eclipse Dark 猝滅劑、DABCYL, DABSYL, DDQ I 和 DDQ II。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用的猝滅劑是MGB或BHQ1 。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇合適的報(bào)告物-猝滅劑組合。通常，猝滅劑的吸收譜需要與報(bào)告物的發(fā)射譜具有良好重疊，以便允許最佳猝滅。優(yōu)選地,步驟(d) (ii)的與所述IAC序列雜交的突光標(biāo)記的探針是,在Rossmanith等人(2006) Res. Microbiol. 157，763-771 中公開(kāi)的 pLucLm4 (SEQ ID NO:4)。與 prfA基因座雜交的熒光標(biāo)記的探針優(yōu)選地是LipProbe (SEQ ID N0:5)。所述熒光標(biāo)記的探針PLucLm4優(yōu)選地表現(xiàn)出HEX (作為報(bào)告熒光體)和BHQ1 (作為猝滅劑)。所述熒光標(biāo)記的探針LipPiObe優(yōu)選地表現(xiàn)出FAM (作為報(bào)告物)和MGB (作為猝滅劑)。根據(jù)本發(fā)明，在步驟(e)中定性地和/或定量地測(cè)定通過(guò)步驟(d)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。所述檢測(cè)優(yōu)選地基于，在設(shè)定的溫度，在每個(gè)循環(huán)中監(jiān)測(cè)熒光。通常，使用光學(xué)裝置來(lái)收集存在于樣品中的特定r熒光體的特定激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的數(shù)據(jù)，從而監(jiān)測(cè)熒光。在步驟(f)中，從步驟(e)確定和/或計(jì)算野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞在·疑似被所述微生物污染的原始樣品中的存在和/或量。通常，通過(guò)在步驟(e)中定性地測(cè)定熒光信號(hào)，來(lái)測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特囷細(xì)胞在原始樣品中的存在。通常通過(guò)包括下述步驟的方法，計(jì)算在原始樣品中的野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞的量
-使用Ct方法(閾值方法)，基于在實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增以后的各種突光信號(hào),借助于遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌和野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的DNA拷貝，計(jì)算DNA的初始量。所述閾值方法是基于研究的樣品的各種信號(hào)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比(Kaltenb0ck等人(2005), Advances in 臨床 Chemistry 40: 219-259)。-基于已知的樣品內(nèi)最初的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞的值和在實(shí)時(shí)PCR以后通過(guò)Ct方法得到的細(xì)胞的值，計(jì)算在分析操作(包括根據(jù)本發(fā)明方法的步驟
(b)、(c)和(d)的樣品制備、DNA純化和分離和實(shí)時(shí)PCR)過(guò)程中的損失。-基于計(jì)算的在分析操作過(guò)程中的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞的損失，計(jì)算存在于疑似被所述微生物污染的樣品中的野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞的數(shù)目。本發(fā)明方法是有利的，因?yàn)槭褂脝魏思?xì)胞增生李斯特菌作為分子生物學(xué)病原體檢測(cè)的內(nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物(ISPC)，會(huì)提供與靶生物體的最大相似性，并因此提供用于細(xì)菌病原體檢測(cè)的最大適用性。甚至密切相關(guān)的物種諸如無(wú)害李斯特菌(listeria innocua)會(huì)導(dǎo)致非競(jìng)爭(zhēng)性的內(nèi)部對(duì)照物，這在實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中需要第二個(gè)引物對(duì)。單純地使用從現(xiàn)有IAC衍生出的基于DNA的ISPC，從檢測(cè)過(guò)程的最開(kāi)始，就不會(huì)滿(mǎn)足對(duì)照物和靶物的最大相似性的必要條件。此外,大多數(shù)DNA會(huì)在PCR檢測(cè)之前的各個(gè)方法步驟過(guò)程中損失。本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種試劑盒，所述試劑盒用于這樣的試驗(yàn)所述試驗(yàn)用于檢測(cè)和測(cè)定在疑似被野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的樣品中的所述微生物，所述試劑盒至少包括在一個(gè)或多個(gè)包中的
(i)如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌；
(ii)對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組prfA基因座和如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC序列特異性的引物；和
(iii)能夠與所述PrfA基因座特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，和能夠與所述IAC序列特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。
優(yōu)選地，所述試劑盒的引物是Lipl (SEQ ID NO:2)和Lip2 (SEQ ID N0:3)。所述熒光標(biāo)記的探針優(yōu)選地是PLucLm4 (SEQ ID NO :4)(用于檢測(cè)IAC序列)和LipProbe (SEQ ID NO: 5)(用于檢測(cè) prfA 基因座)。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒可以另外包含提取溶液。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，一種用于生產(chǎn)如上所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的方法，所述方法包括下述步驟
(a)刪除單核細(xì)胞增生李斯特菌物種細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座，
(b)克隆包含IAC的載體，
(c)將步驟(b)的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)步驟(a)的細(xì)菌物種中。
通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)根據(jù)步驟(a)的PrfA的基因組基因座的刪除，且可以例如如在下述文獻(xiàn)中公開(kāi)的那樣實(shí)現(xiàn)B5ckmann等人(1996) Mol. Microbiol. 22,643-653。大體而言，構(gòu)建敲除的質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞中。交換會(huì)導(dǎo)致PrfA基因的切除。得到的生物體也稱(chēng)作A-ZTiU單核細(xì)胞增生李斯特菌。技術(shù)人員可以容易地確定單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的最佳培養(yǎng)條件。通常，在通氣下，在37°C，在TSB-Y (含有酵母提取物的Trypton大豆培養(yǎng)基)中培養(yǎng)所述細(xì)菌。在步驟(b)中，生產(chǎn)包含IAC的載體。通常，通過(guò)常規(guī)PCR (Rossmanith 等人(2006) Res. Microbiol. 157，763-771)擴(kuò)增所述序列，從而生產(chǎn)足夠用于克隆的量的IAC序列。用于PCR的引物通常包含特殊限制性酶的限制位點(diǎn)，從而允許以后整合進(jìn)載體中。就根據(jù)SEQ ID NO: I的IAC序列而言，優(yōu)選地使用修飾的引物L(fēng)ipBam (SEQ ID N0:6)和LipSal (SEQ ID NO:7)，它們分別包含限制位點(diǎn) BamHI 和 Sail。LipBam 的序列是5'GCG CGG ATC CGA TAC AGA AAC ATC GGT TGG (T 3 (SEQ IDNO :6)。LipSal 的序列是5lCG CGT CGA CGT GTA ATC TTG ATG CCA TCA GG^ (SEQ IDNO :7)。在純化擴(kuò)增產(chǎn)物以后，進(jìn)行限制酶切消化、去磷酸化和與合適的整合載體的連接。通常通過(guò)與可商業(yè)得到的限制性酶(其與用于PCR的引物的限制位點(diǎn)相對(duì)應(yīng))一起溫育擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行限制酶切消化。優(yōu)選地，使用BamHI和Sail。通過(guò)與合適的磷酸酶(例如Fast AP 熱敏感的堿性磷酸酶(Fermentas))—起溫育，實(shí)現(xiàn)IAC片段的去磷酸化。技術(shù)人員可以容易地選擇合適的整合載體。所述載體包含會(huì)產(chǎn)生目標(biāo)受體細(xì)菌株對(duì)其敏感的抗生素(例如氯霉素)抗性的基因序列，以便允許在以后選擇陽(yáng)性克隆。優(yōu)選地，使用曬菌體插入載體，例如在Lauer等人(2002) J. Bacteriol.184，4177-4186中公開(kāi)的pPLl或pPL2。噬菌體插入載體pPL2 (6123 bp)是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼤?huì)提供向單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組中的穩(wěn)定單拷貝插入?？梢匀缦律a(chǎn)足夠量的插入載體在細(xì)菌(例如大腸桿菌T0P10F’)中擴(kuò)增載體，隨后進(jìn)行如上所述的分離、限制酶切消化和去磷酸化。通常，限制位點(diǎn)可以存在于所述載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)中。通常,通過(guò)加入DNA連接酶,例如可從Fermentas得到的T4 DNA連接酶,進(jìn)行連接。將得到的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的細(xì)菌(例如大腸桿菌T0P10F’)中，用于擴(kuò)增和用于選擇陽(yáng)性克隆。該選擇通常如下實(shí)現(xiàn)將所述細(xì)菌鋪板在含有上述抗生素的培養(yǎng)基上。在步驟(c)中，將步驟(b)的載體轉(zhuǎn)移進(jìn)步驟(a)的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞中。使用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。實(shí)例是通過(guò)熱激或電穿孔進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，通過(guò)電穿孔實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。熱激轉(zhuǎn)化如下進(jìn)行在有諸如Ca2+ (在CaCl2中)或Rb2+ (RbCl2)等二價(jià)陽(yáng)離子存在下，冷凍細(xì)胞，使得細(xì)胞膜變成可透過(guò)質(zhì)粒DNA。與DNA —起在冰上溫育細(xì)胞，然后短暫地?zé)峒?通常在41-43°C維持30-120秒)。就電穿孔而言，用10-25 kV/cm的電場(chǎng)短暫地電擊細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)Park等人(1990) Gene 94，129-132，進(jìn)行電穿孔。在成功的克隆以后，可以測(cè)試得到的生物體。通過(guò)PCR擴(kuò)增499 bp片段(根據(jù)Lauer等人(2002) J. Bacteriol. 184, 4177-4186),和通過(guò)測(cè)序,可以測(cè)試所述載體在 Δ-prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組中的成功插入?？梢匀缦买?yàn)證IAC在N-prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組中的單拷貝插入基于已知的李斯特菌基因組的大小(Nelson等人(2004) Nucleic Acids Res. 32，2386-2395)，與野生型數(shù)據(jù)相比，對(duì)比使用在實(shí)時(shí)PCR以后的數(shù)據(jù)通過(guò)UV/VIS光譜法測(cè)得的轉(zhuǎn)化的單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組DNA量。下述附圖
和實(shí)施例進(jìn)一步例證了本發(fā)明，但是，本發(fā)明不限于此。圖I. pPL2-IAC大腸桿菌和IAC+、Δ -prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe的確認(rèn)(根據(jù)實(shí)施例I. 4和I. 6)。(A)在轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒分離以后，PPL2-IAC大腸桿菌克隆的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，其靶向所述質(zhì)粒內(nèi)的人工IAC。在左側(cè)的擴(kuò)增圖包括質(zhì)粒制品作為靶物。在右側(cè)的擴(kuò)增圖(ss IAC)代表校準(zhǔn)函數(shù)(有效率96· 8%; Rsq: 0.999)。(B) IAC+,單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe克隆的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，其靶向所述基因組內(nèi)的人工IAC，用于證實(shí)載體pPL2-IAC在李斯特菌基因組中的整合(有效率96. 0%; Rsq. : O. 999)。在左側(cè)的擴(kuò)增圖包括4個(gè)IAC+、^-prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe克隆的基因組DNA作為靶物。圖2. PPL2-IAC在李斯特菌基因組中的陽(yáng)性整合的確認(rèn)，和通過(guò)常規(guī)PCR對(duì)得到的IAC+、Δ -prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe菌株的確認(rèn)(根據(jù)實(shí)施例I. 6.)。(A)克隆的菌株(被證實(shí)為單核細(xì)胞增生李斯特菌)的瓊脂糖凝膠。M，標(biāo)志物；1，伊凡諾夫李斯特菌CL. iraflOFii )、西利堅(jiān)李斯特菌(Z.)和威爾遜李斯特菌(Z. welshimeri ) ；2,無(wú)害李斯特菌單核細(xì)胞增生李斯特菌；4，格氏李斯特菌(Z. gray
4個(gè)IAC+、Λ單核細(xì)胞增生李斯特菌E⑶e克隆。(B) IAC+、Λ單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe的確認(rèn)，所述EGDe擴(kuò)增所有李斯特菌屬物種特有的16S rRNA基因和單核細(xì)胞增生李斯特菌特有的基因。9，李斯特菌屬物種；10，單核細(xì)胞增生李斯特菌；11-14，4個(gè)IAC+、Δ -prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe克隆。(C) pPL2_IAC在Λ -prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe菌株的基因組中的整合的確認(rèn)。1-4，4個(gè)IkC+、N-prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe克隆。在PCR以后得到的499 bp片段指示整合。在1%瓊脂糖凝膠中分離PCR產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色。在上面和在下面引用的所有申請(qǐng)、專(zhuān)利和出版物的整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容，通過(guò)引用并入本文。I.實(shí)施例下述實(shí)施例描述了本發(fā)明的實(shí)際用途。1.1.細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件。單核細(xì)胞增生李斯特菌EOTe (l/2a，內(nèi)部編號(hào)2964)是在下述地方的細(xì)菌菌株保藏物的一部分！Institute of Milk Hygiene, MilkTechnology and Food Science, Department of Veterinary Public Health and FoodScience, University of Veterinary Medicine, Vienna, Austria (IMML)0 &-prfA 專(zhuān)核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe (l/2a)是在下述地方的細(xì)菌菌株保藏物的一部分！Departmentof Microbiology, Theodor Boveri Institute, University of Wiirzburgj WiirzburgjGermany。電感受態(tài)的大腸桿菌TOPlOF可在Invitrogen (Carlsbad, CA，美國(guó))得到。使用 MicroBank 技術(shù)(Pro-Lab Diagnostics, Richmont Hillj 加拿大)，在-8(TC維持所有細(xì)菌菌株。使用HP 8452 分光光度計(jì)(Hewlett Packard, Paolo Alto, CA，美國(guó))，在 600nm —式兩份地測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度(0D_)。通過(guò)將ΙΟΟμΙ細(xì)菌培養(yǎng)物在平板上劃線，或通過(guò)環(huán)技術(shù)，在 RAPID'L· mono (Bio-Rad laboratories GmbH, Miinchenj 德國(guó))、OCLA (Oxoid 產(chǎn)色李斯特菌瓊脂；Oxoid，Hampshire,英國(guó))、PALCAM (Solabia Biokar Diagnostics, Pantin Cedexj 法國(guó))和血瓊月旨(Biomerieux， Marcy V Etoilej 法國(guó))上，選擇性地鋪板單核細(xì)胞增生李斯特菌E⑶e野生型和IAC+、A-prfA單核細(xì)胞增生李斯特菌E( e。使用平板計(jì)數(shù)方法或Live/Dead BacLight 細(xì)菌生存力試劑盒(MolecularProbes, Willow Creek, OR,美國(guó))(根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū))，進(jìn)行細(xì)菌懸浮液的計(jì)數(shù)。1.2.寡核苷酸、質(zhì)粒和酶反應(yīng)。寡核苷酸和質(zhì)粒的序列如表I所示。用于常規(guī)和實(shí)時(shí)PCR的引物以及HEX-標(biāo)記的探針pLuclm4可從MWG Biotech (Ebersberg，德國(guó))得到；MGB-修飾的 Lip-probe 可從 Applied Biosystems (Foster City, CA，美國(guó))得到。IAC的人工100 bp革巴物由VBC Genomics (Vienna,奧地利)合成。pPL2嗷菌體插入載體是根據(jù) Lauer 等人(2002) J. Bacteriol. 184，4177-4186。
權(quán)利要求
1.單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌，其中轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，其特征在于，它在基因組水平包含起內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物(IAC)作用的人工序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌，其中起IAC作用的人工序列包含在5’和3’末端處的引物結(jié)合序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌，其中所述引物結(jié)合序列與野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組PrfA基因座的引物結(jié)合序列相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求I- 3中任一項(xiàng)所述的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌，其中起IAC作用的人工序列是根據(jù)SEQ ID NO: I的100 bp序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I- 4中任一項(xiàng)所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe菌株。
6.遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌EGDe菌株，其中轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，所述菌株包括SEQ ID NO: I的內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照序列(IAC)，并于2010年5月20日在DSM 23639下作為單核細(xì)胞增生李斯特菌Λ prfA/+IAC保藏在DSMZ。
7.在權(quán)利要求I- 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌用于定性地和/或定量地檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的樣品中的存在的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述樣品是食物。
9.在權(quán)利要求I- 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌作為用于基于實(shí)時(shí)PCR的試驗(yàn)的內(nèi)部樣品過(guò)程對(duì)照物(ISPC)的用途。
10.一種用于檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑似被所述致病性微生物污染的樣品中的存在的方法，所述方法包括下述步驟 (a)向所述樣品中加入預(yù)定量的在權(quán)利要求I- 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的細(xì)胞， (b)用提取溶液溫育所述樣品， (c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，分離DNA; (d)應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR，其中使用(i)對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組prfA基因座和在權(quán)利要求I - 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC序列特異性的引物；和(ii)能夠與所述PrfA基因座特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，和能夠與所述IAC序列特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針， (e)定性地和/或定量地測(cè)定通過(guò)步驟(d)產(chǎn)生的熒光信號(hào)，和 (f)從步驟(e)確定和/或計(jì)算野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)胞在疑似被所述微生物污染的原始樣品中的存在和/或量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在步驟(d)(i)中使用的引物是Lipl(SEQ IDNO: 2)和 Lip2 (SEQ ID NO: 3)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中在步驟(d)(ii)中使用的熒光標(biāo)記的探針是用于檢測(cè)IAC序列的pLucLm4 (SEQ ID N0:4)，和用于檢測(cè)prfA基因座的LipProbe(SEQ ID NO:5)ο
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中的任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)的提取溶液至少包含MgCl2和/或離子液體。
14.一種試劑盒，所述試劑盒用于這樣的試驗(yàn)所述試驗(yàn)用于檢測(cè)和測(cè)定在疑似被野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的樣品中的所述微生物，所述試劑盒至少包括在一個(gè)或多個(gè)包中的 (i)在權(quán)利要求I- 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌； (ii)對(duì)野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌的基因組prfA基因座和在權(quán)利要求I- 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌的IAC序列特異性的引物；和 (iii)能夠與所述PrfA基因座特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，和能夠與所述IAC序列特異性地雜交的熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的試劑盒，其中所述引物是Lipl(SEQ ID N0:2)和Lip2(SEQ ID NO:3)ο
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的試劑盒，其中所述熒光標(biāo)記的探針是用于檢測(cè)IAC序列的 pLucLm4 (SEQ ID N0:4)，和用于檢測(cè) prfA 基因座的 LipProbe (SEQ ID NO:5)
17.一種用于生產(chǎn)在權(quán)利要求I - 6的任一項(xiàng)中所述的遺傳修飾的單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌的方法，所述方法包括下述步驟 (a)刪除單核細(xì)胞增生李斯特菌細(xì)菌物種的轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座， (b)克隆包含IAC的載體， (c)將步驟(b)的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)步驟(a)的細(xì)菌物種中。
全文摘要
本發(fā)明涉及單核細(xì)胞增生李斯特菌物種的遺傳修飾細(xì)菌，其中轉(zhuǎn)錄因子PrfA的基因組基因座已經(jīng)被刪除，其特征在于，它在基因組水平包含起內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照物作用的人工序列，本發(fā)明也涉及該細(xì)菌的用途、以及用于定性地和/或定量地檢測(cè)和測(cè)定野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的樣品中的存在的方法和試劑盒。
文檔編號(hào)C07K14/195GK102906106SQ201180027020
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者P.羅斯馬尼特, K.弗呂維爾特, M.瓦格納, S.富克斯 申請(qǐng)人:默克專(zhuān)利股份公司