專利名稱:一種提高粘紅酵母生物量的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域,具體地,涉及一種提高粘紅酵母生物量的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)是產(chǎn)油微生物種類之一,其含油量25 % 40%以上。近年來(lái),全球面臨應(yīng)對(duì)氣候變化、能源危機(jī)的挑戰(zhàn),生物燃料包括微生物油脂成為研究熱點(diǎn)之一,對(duì)于粘紅酵母的研究也倍受關(guān)注。粘紅酵母產(chǎn)油量的多少取決于兩個(gè)方面,一是粘紅酵母的含油量,二是其生物量。生物量的提高是粘紅酵母在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞快速增殖的結(jié)果,說(shuō)明培養(yǎng)基更適合其生長(zhǎng)。粘紅酵母在實(shí)際應(yīng)用中,如生產(chǎn)油脂或提取生理活性物質(zhì),只有高的生物量才有提取應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ),如何提高粘紅酵母的生物量是研究者和產(chǎn)業(yè)界追求的熱點(diǎn)。因此,研究提高粘紅酵母生物量的方法對(duì)研究其生物學(xué)特性和生產(chǎn)應(yīng)用均具有重要的價(jià)值。粘紅酵母?jìng)鹘y(tǒng)培養(yǎng)方法是應(yīng)用葡萄糖培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基。葡萄糖培養(yǎng)基配制比較復(fù)雜,需要有機(jī)物和無(wú)機(jī)物十余種,而麥芽汁培養(yǎng)基配制簡(jiǎn)單,即將麥芽浸粉水溶,離心后的上清液就是粘紅酵母培養(yǎng)基。以往將其離心沉淀部分廢棄,這不僅浪費(fèi)了資源而且也增加了培養(yǎng)成本。這兩者培養(yǎng)基的共同特點(diǎn)是細(xì)胞增殖速率較慢,難以適應(yīng)粘紅酵母的工業(yè)化生產(chǎn),因此,研究一種提高粘紅酵母生物量的方法勢(shì)在必行,具有重要的實(shí)際意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高粘紅酵母生物量的培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用;本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種提高粘紅酵母生物量的方法。粘紅酵母細(xì)胞圓形、卵形或長(zhǎng)形。多邊芽殖,有明顯的紅色或黃色色素,很多種因生莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落。在麥芽汁斜面上培養(yǎng)一個(gè)月以上,菌苔顏色呈現(xiàn)珊瑚紅到橙紅或微帶橘紅色。常因由莢膜而形成粘質(zhì)狀菌落,產(chǎn)胡蘿卜素和L-苯丙氨酸??諝?、水、 花、土壤、鱒魚腸道、泡菜水等處均可分離到粘紅酵母。本發(fā)明使用的粘紅酵母菌種購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)為 CGMCC 2.704。本發(fā)明提供的粘紅酵母培養(yǎng)基,通過(guò)以下步驟制備(1)將麥芽浸粉溶于蒸餾水中,離心,取上清液進(jìn)行高壓滅菌;(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過(guò)程中形成的沉淀物合并,用蒸流水?dāng)嚢杌虺暡ㄌ幚恚匐x心,取上清液與步驟(1)的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液PH值5. 0-5. 5,經(jīng)高壓再次滅菌,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。具體地,所述步驟(1)麥芽浸粉與蒸餾水的質(zhì)量體積比為100g/L。所述步驟(1)離心條件為3000 6000r/min離心15 20min。
所述步驟( 對(duì)合并的沉淀物用2-5倍體積量的蒸流水800 2600r/min攪拌 20min 60min 或 400 900W 超聲波處理 15_20min,3000 6000r/min 離心 15 20min
后的上清液與步驟(1)的上清液合并,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。所述步驟( 對(duì)合并的沉淀物用4倍體積量的蒸流水1500r/min攪拌30min或 800W超聲波處理15min,4000r/min離心20min后的上清液與步驟(1)的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液PH值5. 3,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所用的超聲波細(xì)胞粉碎儀額定頻率為18 22KHz,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)調(diào)節(jié)超聲波儀的功率來(lái)控制超聲處理的強(qiáng)度。本發(fā)明提供了一種提高粘紅酵母生物量的方法,是將粘紅酵母接種于本發(fā)明的粘紅酵母培養(yǎng)基上,置于搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。本發(fā)明提供的粘紅酵母培養(yǎng)基IL中接種濃度為50X IO6 80 X IO6個(gè)/ml的粘紅酵母50ml。本發(fā)明提供的粘紅酵母培養(yǎng)基IL中接種濃度為70X 106個(gè)/ml的粘紅酵母50ml。具體地,培養(yǎng)溫度為25 33°C ;搖床轉(zhuǎn)速為120 160r/min ;培養(yǎng)時(shí)間為96 192h。優(yōu)選地,培養(yǎng)溫度為30°C。優(yōu)選地,搖床轉(zhuǎn)速為140r/min。優(yōu)選地,培養(yǎng)時(shí)間為144h。本發(fā)明提供了上述培養(yǎng)基在提高粘紅酵母生物量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述發(fā)酵方法在提高粘紅酵母生物量中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法在生物發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明是將傳統(tǒng)的麥芽汁培養(yǎng)基配制過(guò)程中,廢棄沉淀的部分經(jīng)過(guò)高速攪拌和超聲波處理使其進(jìn)一步的溶解。高速攪拌和超聲波處理是廣泛應(yīng)用在化學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域常用的方法,本發(fā)明的本質(zhì)就是用最普通的方法處理傳統(tǒng)麥芽汁配制過(guò)程中廢棄的部分,使其培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組份更加全面,使原本沒(méi)有外力難以溶解的物質(zhì)從而溶解出來(lái),部分大分子轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì),更利于粘紅酵母的吸收和利用,獲得了粘紅酵母生長(zhǎng)因子,從而達(dá)到了大幅度提高了其生物量的效果。本發(fā)明提供的粘紅酵母培養(yǎng)基和發(fā)酵方法能夠大幅度降低粘紅酵母規(guī)?;囵B(yǎng)的成本,又能獲得大量的粘紅酵母生物量,利用本發(fā)明方法培養(yǎng)粘紅酵母的生物量比用傳統(tǒng)法方法培養(yǎng)的生物量增加70% 100%以上。
圖1為不同培養(yǎng)基對(duì)粘紅酵母生物量的影響圖,其中橫坐標(biāo)1為麥芽汁培養(yǎng)基,2 為葡萄糖培養(yǎng)基,3為實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基,4為實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基,5為實(shí)施例3制得的培養(yǎng)基,縱坐標(biāo)代表培養(yǎng)基發(fā)酵粘紅酵母結(jié)束后測(cè)得的粘紅酵母生物量。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容,但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下,對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換,均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1粘紅酵母培養(yǎng)基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中,4000r/min離心15min,濾紙過(guò)濾,將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌15min ;(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過(guò)程中形成的沉淀物合并,用4倍體積量的蒸流水進(jìn)行高速2600r/min攪拌30min,離心4000r/min 20min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液pH值5. 0,然后經(jīng)1 X IO5Pa高壓再次滅菌15min,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。實(shí)施例2粘紅酵母培養(yǎng)基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中,3000r/min離心15min,濾紙過(guò)濾,將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌30min ;(2)將步驟(1)中的離心沉淀物和滅菌過(guò)程中形成的沉淀物合并,用2倍體積量的蒸流水超聲波800W處理15min,3000r/min離心15min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液PH值5. 5,然后經(jīng)IX 105 高壓再次滅菌30min,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。實(shí)施例3粘紅酵母培養(yǎng)基制備(1)將IOOg麥芽浸粉溶于IL蒸餾水中,6000r/min離心15min,濾紙過(guò)濾,將上清液1 X IO5Pa高壓滅菌20min ;(2)將步驟1)中的離心沉淀物和滅菌過(guò)程中形成的沉淀物合并,用5倍體積量的蒸流水進(jìn)行高速800r/min攪拌60min,6000r/min離心15min后的上清液與步驟(1)離心的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液pH值5. 3,然后經(jīng)1 X IO5Pa高壓再次滅菌20min,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。實(shí)施例4粘紅酵母菌種的發(fā)酵培養(yǎng)1、從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的粘紅酵母菌種(編號(hào) CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中,處于凍干狀態(tài),在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中,用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管,將安瓿管頂端在火焰上加熱,向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端,加入0.3mL 0.9%的生理鹽水,振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. ImL菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中,33°C恒溫培養(yǎng)40h。2、粘紅酵母菌種擴(kuò)大培養(yǎng)在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實(shí)施例1制得的培養(yǎng)基,用接種針接種一環(huán)已恢復(fù)活性的粘紅酵母,約(1 X IO8 2 X IO8個(gè)/ml)個(gè)粘紅酵母菌,在溫度25°C,120r/min 條件下振蕩培養(yǎng)Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養(yǎng)方法取擴(kuò)大培養(yǎng)的粘紅酵母50X IO6個(gè)/ml,約為IOmL分別加入到實(shí)施例1制得的 200mL培養(yǎng)基中,在溫度25°C、pH值5. 0的培養(yǎng)基,在160r/min的搖床轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng) 192h。實(shí)施例5粘紅酵母菌種的發(fā)酵培養(yǎng)1、從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的粘紅酵母菌種(編號(hào) CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中,處于凍干狀態(tài),在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中,用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管,將安瓿管頂端在火焰上加熱,向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端,加入0.5mL 0.9%的生理鹽水,振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. 2mL菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中,30°C恒溫培養(yǎng)48h。2、粘紅酵母菌種擴(kuò)大培養(yǎng)在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基,用接種針接種一環(huán)已恢復(fù)活性的粘紅酵母,約(1 X IO8 2 X IO8個(gè)/ml)個(gè)粘紅酵母菌,在溫度30°C,140r/min 條件下振蕩培養(yǎng)Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養(yǎng)方法取擴(kuò)大培養(yǎng)的粘紅酵母70X IO6個(gè)/ml,約為IOmL分別加入到實(shí)施例2制得的 200mL培養(yǎng)基中,在溫度30°C、pH值5. 0的培養(yǎng)基,在140r/min的搖床轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng) 144h。實(shí)施例6粘紅酵母菌種的發(fā)酵培養(yǎng)1、從中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買的粘紅酵母菌種(編號(hào) CGMCC2. 704)保藏在安瓿管中,處于凍干狀態(tài),在實(shí)驗(yàn)之前需要恢復(fù)菌種活性。在超凈工作臺(tái)中,用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管,將安瓿管頂端在火焰上加熱,向加熱處滴幾滴無(wú)菌水使玻璃開裂。用鑷子敲下已開裂的安瓿管頂端,加入0.4mL 0.9%的生理鹽水,振蕩使凍干菌體溶解并呈懸浮狀。取0. 2mL菌體懸浮液加至斜面培養(yǎng)基中,30°C恒溫培養(yǎng)48h。2、粘紅酵母菌種擴(kuò)大培養(yǎng)在容量為250mL的三角瓶中裝200mL實(shí)施例3制得的培養(yǎng)基,用接種針接種一環(huán)已恢復(fù)活性的粘紅酵母,約(1 X IO8 2 X IO8個(gè)/ml)個(gè)粘紅酵母菌,在溫度,160r/min 條件下振蕩培養(yǎng)Mh。3、粘紅酵母菌種搖瓶培養(yǎng)方法取擴(kuò)大培養(yǎng)的粘紅酵母80X IO6個(gè)/ml,約為IOmL分別加入到實(shí)施例3制得的 200mL培養(yǎng)基中,在溫度33 °C、pH值5. 0的培養(yǎng)基,在120r/min的搖床轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)96h。實(shí)施例7粘紅酵母生物量測(cè)定對(duì)實(shí)施例4-6中分別采用實(shí)施例1-3制得的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵獲得的粘紅酵母進(jìn)行生物量測(cè)定。取實(shí)施例4-6發(fā)酵結(jié)束后的粘紅酵母菌液40mL,在4000r/min的條件下離心lOmin,除去上清液,將沉淀物在80°C的溫度下真空干燥至恒重,在干燥器中冷卻至室溫后稱重。即得單位體積菌液干物質(zhì)的重量為粘紅酵母的生物量。按著該生物量測(cè)定方法,測(cè)定結(jié)果見圖1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用實(shí)施例2制得的培養(yǎng)基比麥芽汁培養(yǎng)基的生物量增加約為100. 08%、實(shí)施例1、3制得的培養(yǎng)基比麥芽汁培養(yǎng)基的生物量增加約為83. 33%和 71. 43%,也比葡萄糖培養(yǎng)基發(fā)酵粘紅酵母的生物量增加明顯。選用本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制得的培養(yǎng)基進(jìn)行相同的粘紅酵母培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果說(shuō)明使用本發(fā)明提供的的粘紅酵母培養(yǎng)基進(jìn)行粘紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng),能夠有效提高粘紅酵母的生物量。
權(quán)利要求
1.一種提高粘紅酵母生物量的培養(yǎng)基,通過(guò)以下步驟制備1)將麥芽浸粉溶于蒸餾水中,離心,取上清液進(jìn)行高壓滅菌;2)將步驟1)中的離心沉淀物和滅菌過(guò)程中形成的沉淀物合并,用蒸流水?dāng)嚢杌虺暡ㄌ幚?,再離心,取上清液與步驟1)的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液PH值5. 0-5. 5,經(jīng)高壓再次滅菌,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述步驟1)麥芽浸粉與蒸餾水的質(zhì)量體積比為100g/L。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述步驟1)離心條件為3000 6000r/ min 離心 15 30min。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述步驟2)對(duì)合并的沉淀物用2-5倍體積量的蒸流水800 ^00r/min攪拌20min 60min或400 900W超聲波處理15_20min, 3000 6000r/min離心15 20min后的上清液與步驟1)的上清液合并,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述步驟2)對(duì)合并的沉淀物用4倍體積量的蒸流水1500r/min攪拌30min或800W超聲波處理15min,4000r/min離心20min后的上清液與步驟1)的上清液合并,調(diào)節(jié)溶液PH值5. 3,得到粘紅酵母培養(yǎng)基。
6.一種提高粘紅酵母生物量的方法,其特征在于,在權(quán)利要求1-5任一所述的粘紅酵母培養(yǎng)基上接種粘紅酵母,置于搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,IL權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基中接種濃度為50 X IO6 80 X IO6個(gè)/ml的粘紅酵母50ml。
8.如權(quán)利要求6所述的方法,其培養(yǎng)條件為溫度為25 33°C,搖床轉(zhuǎn)速為120 160r/min,培養(yǎng)時(shí)間為96 192h。
9.如權(quán)利要求6-8任一所述的方法,其培養(yǎng)溫度為30°C,搖床轉(zhuǎn)速為140r/min,培養(yǎng)時(shí)間為144h。
10.權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基在提高粘紅酵母生物量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高粘紅酵母生物量的培養(yǎng)基及其發(fā)酵粘紅酵母的方法,是將麥芽汁培養(yǎng)基離心后,保留上清液,再將沉淀部分重新溶解,將溶解部分與前一步離心后的上清液合并作為粘紅酵母的培養(yǎng)基,在溫度25-33℃、轉(zhuǎn)速120-160r/min條件下培養(yǎng)96-192h,發(fā)酵粘紅酵母,結(jié)果發(fā)現(xiàn)粘紅酵母的生物量比傳統(tǒng)方法的生物量增加70%~100%,本發(fā)明方法具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102559521SQ201110459378
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者李博生, 王政 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)