專利名稱：一種強(qiáng)迫性障礙相關(guān)基因GalR1的多態(tài)性位點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)的基因領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種與強(qiáng)迫性障礙相關(guān)的基因GalRl及其多態(tài)性位點(diǎn)，本發(fā)明還涉及分析GalRl基因等位基因突變的方法，以及GalRl基因單核苷酸多態(tài)性在診斷強(qiáng)迫性障礙方面的用途。
背景技術(shù)：
強(qiáng)迫性障礙是一種常見的精神疾病，人群中患病率在1.8-3.0%。患者主要臨床表現(xiàn)為強(qiáng)迫觀念或強(qiáng)迫行為，這些強(qiáng)迫觀念或強(qiáng)迫行為引起患者的顯著苦惱，并花費(fèi)大量時間(每天花費(fèi)I小時以上)，或者嚴(yán)重地干擾了患者的日常生活、職業(yè)(學(xué)業(yè))功能、社交活動或人際關(guān)系。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，在世界范圍內(nèi)，強(qiáng)迫性障礙的致殘率列各種疾病的前10位。雙生子研究和家系研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素在強(qiáng)迫性障礙的發(fā)病機(jī)制中起重要作用(Pauls DL.Dialogues in Clinical Neuroscience.2010 ；Vol 12(2): 149-163) 單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)是疾病的易感性、外顯性、抵抗性以及藥物反應(yīng)性等生物學(xué)性狀差別的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)，很多疾病與基因突變或基因多態(tài)性有關(guān)。不同于傳統(tǒng)的單基因疾病的研究方式，目前對基因的相互作用、多個基因組合與疾病關(guān)系的研究日益受到關(guān)注。隨著SNPs的不斷發(fā)現(xiàn)與基因組多態(tài)性和基因突變有關(guān)的數(shù)據(jù)庫dbSNP、HGBASE等相繼建立，為從SNPs探討復(fù)雜性疾病的機(jī)制提供了可行性，因此對疾病家系病例進(jìn)行連鎖定位和選定區(qū)域的候選基因進(jìn)行SNPs的關(guān)聯(lián)研究，可能是多基因疾病遺傳學(xué)研究如強(qiáng)迫性障礙取得突破的希望(Ercan-Sencicek AG，Stillman AA, Ghosh AK, Bilguvar K, Mason CE, Abbott T, Gupta A, King RA, Pauls DL,State MW.L-histidine decarboxylase and Tourettej s syndrome.N Engl J Med.2010May 20 ；362(20): 1901-1908.)。甘丙妝(galanin) 受:體I (Galanin receptor I, GalRl)基因全長 2.1Κ,定位于染色體上18q23區(qū)域，共有3個外顯子，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，在不同物種之間有高度的保守性。GalRl的mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有區(qū)域均有表達(dá)，特別是在杏仁核、下丘腦、脊髓和背根有高表達(dá)，并與多種神經(jīng)遞質(zhì)共存，其中，GalRl與5-羥色胺IA受體(5_HT1A)形成共聚體，可能對情緒的調(diào)節(jié)起主要作用(Borroto-Escuela DO, Narvaez M, MarcellinoD, Parrado C, Narvaez JA, Tarakanov AO, Agnati LF, Diaz-Cabiale Z, Fuxe K.Galaninreceptor-1 modulates 5-hydroxtryptamine-lA signaling via heterodimerization.Biochem Biophys Res Commun.2010 Mar 19 ；393(4):767_772.)。激活 GalRl 可以活化其偶聯(lián)的G1/t)蛋白，使cAMP水平下降和打開內(nèi)向整流鉀離子通道。GalRl參與甘丙肽的鎮(zhèn)痛、抑制加壓素和醛固酮的活性、調(diào)節(jié)攝食和代謝行為、抗驚厥和抗焦慮等生理功能。由于GalRl與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有密切的關(guān)系，他們的表達(dá)異?？赡芘c強(qiáng)迫性障礙或抑郁癥等精神疾病的病理機(jī)制相關(guān)。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，至今未見有GalRl基因與強(qiáng)迫性障礙關(guān)聯(lián)的研究報告，也沒有GalRl基因多態(tài)性位點(diǎn)與強(qiáng)迫性障礙的相關(guān)性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于揭示與強(qiáng)迫性障礙密切相關(guān)的GalRl基因多態(tài)性位點(diǎn)和區(qū)域，及其在檢測強(qiáng)迫性障礙易感人群的方法。首先，本發(fā)明確定一種與強(qiáng)迫性障礙密切相關(guān)的易感基因GalRl，其特征在于GalRl基因的SEQ ID NO:1所示序列的第137位單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl944545為G，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，以及由位于該基因上SNP位點(diǎn)rs4621062、rsll662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和 rsl944545 組成的單倍型 AACTTG 的個體，即 GalRl 基因的SEQ ID NO:4所示序列的第30位SNP位點(diǎn)rs4621062為A，在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，第400位SNP位點(diǎn)rsl 1662010為A，在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)；GalRl基因的SEQID NO:3所示序列的第34位SNP位點(diǎn)rs5373為C，在其DNA互補(bǔ)鏈上為G等位位點(diǎn)，第368位SNP位點(diǎn)rs5374為T，在其DNA互補(bǔ)鏈上為A等位位點(diǎn)；GalRl基因的SEQ ID N0:2所示序列的第139位SNP位點(diǎn)rs4890921為T，在其DNA互補(bǔ)鏈上為A等位位點(diǎn)。其次，本發(fā)明提供一種檢測GalRl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括如下步驟:(I)基因組DNA提取，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA ；(2)PCR擴(kuò)增GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)的目的片段；(3)使用SAP堿性磷酸酶進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)完的dNTP等物質(zhì)；(4)使用根據(jù)GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)設(shè)計的UEP引物進(jìn)行SNP位點(diǎn)的單堿基延伸反應(yīng)；(5)使用飛行時間質(zhì)譜儀進(jìn)`行掃描，根據(jù)各單堿基延伸引物的分子量的不同判斷這些SNP位點(diǎn)的差異；(6)結(jié)果判定，GalRl基因SNP位點(diǎn)rsl944545為G，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，或 SNP 位點(diǎn) rs4621062、rsl 1662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和 rsl944545 組成的單倍型AACTTG的個體為強(qiáng)迫性障礙的易感人群。再次，本發(fā)明提供了一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為17-30bp，具有 SEQ ID NO:5、6、7 或 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 所示的序列，且特異性的擴(kuò)增出含GalRl基因的SEQ ID NO:1所示序列中第137位的SNP擴(kuò)增產(chǎn)物或SEQ ID NO:2所示序列中第139位擴(kuò)增產(chǎn)物，SEQ ID NO:3所示序列中第34位和368位的擴(kuò)增產(chǎn)物，SEQ ID NO:4所示序列中第30位和400位擴(kuò)增產(chǎn)物。最后，本發(fā)明提供了一種檢測強(qiáng)迫性障礙的診斷試劑盒。包括:(I)特異性擴(kuò)增GalRl基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的引物6組；(2)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的GalRl基因相比是否存在變化的所需的試劑。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀本發(fā)明的下述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本發(fā)明所限定的范圍內(nèi)。1、技術(shù)路線
(I)本實(shí)施例中首先進(jìn)行樣本的收集和基因組DNA提取:從山東青島地區(qū)收集到散發(fā)的強(qiáng)迫性障礙患者224例，平均年齡29.36±14.67歲(標(biāo)準(zhǔn)差)，其中女性85例；所有患者均符合強(qiáng)迫性障礙的DSM-1V(diagnostic andstatisticalmanual of mental disorders, fourth edition)診斷標(biāo)準(zhǔn)，每個病人的診斷均經(jīng)2位精神科專家確認(rèn)。同樣來自山東青島地區(qū)無血緣關(guān)系的健康自愿對照組419例，平均年齡37.44±10.58歲(標(biāo)準(zhǔn)差)，其中女性為163例。全體參與者均為漢族，并在正式知情同意書上簽字。用基因組DNA提取試劑盒從人血液中提取DNA，濃度校正至5ng/ul.
(2) PCR擴(kuò)增GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)的目的片段:本發(fā)明采用等位基因特異的實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(allele specific real timePCR)對GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)在強(qiáng)迫性障礙散發(fā)患者和正常對照組中的頻率分布情況進(jìn)行了檢測。PCR反應(yīng)在ABI PRISM 7900熒光定量PCR儀進(jìn)行，等位位點(diǎn)采用飛行時間質(zhì)譜儀檢測。SNP 位點(diǎn) rsl944545 擴(kuò)增引物:正向引物:5'-ACGTTGGATGTCAAATCCTACCCACTGTGC-3' (SEQ ID NO:5)反向引物:5'-ACGTTGGATGCTGTAAATCATCAGTGACGC-3' (SEQ ID NO:6)SNP 位點(diǎn) rs4890921 擴(kuò)增引物:正向引物:5'-ACGTTGGATGGTCGTCATACCCTATCATGG-3' (SEQ ID NO:8)反向引物:5'-ACGTTGGATGTATGATGCACCCCACTGAAG-3' (SEQ ID NO:9)SNP位點(diǎn)rs5374擴(kuò)增引物:
正向引物:5'-ACGTTGGATGTGGAGAACTTCGTCACGCTG-3' (SEQ ID NO:11)反向引物:5'-ACGTTGGATGGGTGATCACTAGGCTGTTGC-3' (SEQ ID NO: 12)SNP位點(diǎn)rs5373擴(kuò)增引物:正向引物:5'-ACGTTGGATGTCGAGATCACCGTCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 14)反向引物:5'-ACGTTGGATGTGCCTGGTGGCACCGTCTTT-3' (SEQ ID NO: 15)SNP 位點(diǎn) rsll662010 擴(kuò)增引物:正向引物:5'-ACGTTGGATGCCTTTCCCTTTGCACTTCTC-3' (SEQ ID NO: 17)反向引物:5'-ACGTTGGATGAAAATTGGCCGCCTAATCCC-3' (SEQ ID NO: 18)SNP 位點(diǎn) rs4621062 擴(kuò)增引物:正向引物:5'-ACGTTGGATGAAAAACACCGATGCGTTTCC-3' (SEQ ID NO:20)反向引物:5'-ACGTTGGATGTTTGGATTACCCATCCCCTC-3' (SEQ ID NO:21)單堿基延伸引物:rsl944545:5/ -TCAGTGACGCTGAATCC-3' (SEQ ID NO:7)rs4890921:5/ -GCAGCAAAGGAGGAAGA-3' (SEQ ID NO: 10)rs5374:5/ -TCACTAGGCTGTTGCCCAGCAC-3' (SEQ ID NO: 13)rs5373:5/ -GTGGCACCGTCTTTGCGCCG-3' (SEQ ID NO: 16)rsll662010:5/ -ACTTCTCTCCTCTGTAGC-3' (SEQ ID NO: 19)rs4621062:5/ -GATGCGTTTCCAGCATTC-3' (SEQ ID NO:22)PCR擴(kuò)增試劑:滅菌雙蒸水0.95ul，PCR 緩沖液(含 15mM MgCl2) 0.625ul, dNTP (2.5mM)lul,MgCl2 (25mM) 0.325ul, HotStar Taq 酶(Qiagen) 0.1ul，PCR 引物 Iul，DNA Iul (5ng/lul)。PCR反應(yīng)條件:94°C 15分鐘預(yù)變性；94°C 20秒變性，56°C 30秒退火，72°C I分鐘延伸共45個循環(huán)；最終72 °C 3分鐘延伸。(3)去磷酸消化剩余的dNTP:反應(yīng)體系:1.53ul水、0.17ul SAP緩沖液、0.3單位堿性磷酸酶(Sequenom)。去磷酸反應(yīng)條件:在37°C進(jìn)行40分鐘，然后85 °C 5分鐘使酶失活。(4)單堿基延伸反應(yīng):針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行:
0.755ul 水、0.2ul IOX iPLEX 緩沖液、0.2ul 終止混合物、0.041ul iPLEX 酶(Sequenom)，
0.804ul IOuM的延伸引物。單堿基延伸反應(yīng)條件:94°C 30秒預(yù)變性；94°C 5秒變性，52°C 5秒退火，80°C 5秒延伸5個循環(huán)，共40個循環(huán)；最后72°C 3分鐘延伸。在終止反應(yīng)物中加入6mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽,混合后加入25ul水懸浮。(5)最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的spectroCHIP (Sequenom)上，并用飛行時間質(zhì)譜進(jìn)行分析。2、GalRl基因SNP與強(qiáng)迫性障礙的相關(guān)性統(tǒng)計:利用CLUMP 1.9 Version 卡方分析(http://linkage.rockefeller, edu/soft/list, html)計算等位基因、基因型在強(qiáng)迫性障礙患者和正常對照組的頻率分布，使用Haploview程序計算出患者與正常對照之間的單倍型差異，統(tǒng)計學(xué)的顯著性水平設(shè)定為P< 0.05。結(jié)果:位于18q23區(qū)域的GalRl基因的多態(tài)性位點(diǎn)rsl944545(其等位位點(diǎn)對為A/G)等位位點(diǎn)和基因型在強(qiáng)迫性障礙患者和正常對照組的頻率分布(見表I)。GalRl基因的6 個多態(tài)性位點(diǎn)(rs4621062、rsll662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和 rsl944545)組成的單倍型AACTTG在年齡小于18歲的強(qiáng)迫性障礙患者和正常對照組中的頻率分布有顯著差異 P = 0.007 (X2 = 7.307)。從表I中可以看出，GalRl基因上的常見單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl944545的G等位位點(diǎn)，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，在患者群體中的分布頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常對照組(P = 0.006)，是產(chǎn)生強(qiáng)迫性障礙的一個危險等位位點(diǎn)。因此GalRl基因SNP位點(diǎn)rsl944545為G，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，或SNP 位點(diǎn) rs4621062、rsl 1662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和 rsl944545 組成的單倍型AACTTG的個體為強(qiáng)迫性障礙的易感人群。表1.GalRl基因多態(tài)性位點(diǎn)rsl944545基因型、等位位點(diǎn)數(shù)在強(qiáng)迫性障礙患者和正常對照組中的頻率分布
權(quán)利要求
1.一種與強(qiáng)迫性障礙密切相關(guān)的易感基因GalRl，其特征在于GalRl基因的SEQ IDNO: I所示序列的第137位單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rsl944545為G，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，以及由位于該基因上 SNP 位點(diǎn) rs4621062、rsll662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和rsl944545組成的單倍型AACTTG的個體，即GalRl基因的SEQID NO:4所示序列的第30位SNP位點(diǎn)rs4621062為A，在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)，第400位SNP位點(diǎn)rsl 1662010為A，在其DNA互補(bǔ)鏈上為T等位位點(diǎn)；GalRl基因的SEQ ID NO:3所示序列的第34位SNP位點(diǎn)rs5373為C，在其DNA互補(bǔ)鏈上為G等位位點(diǎn)，第368位SNP位點(diǎn)rs5374為T，在其DNA互補(bǔ)鏈上為A等位位點(diǎn)；GalRl基因的SEQ ID NO:2所示序列的第139位SNP位點(diǎn)rs4890921為T，在其DNA互補(bǔ)鏈上為A等位位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種檢測GalRl基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，它包括如下步驟: (I)基因組DNA提取，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA ； ⑵PCR擴(kuò)增GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)的目的片段； (3)使用SAP堿性磷酸酶進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)完的dNTP等物質(zhì)； (4)使用根據(jù)GalRl基因的6個SNP位點(diǎn)設(shè)計的UEP引物進(jìn)行SNP位點(diǎn)的單堿基延伸反應(yīng); (5)使用質(zhì)譜儀進(jìn)行掃描，根據(jù)各單堿基延伸引物的分子量的不同判斷這些SNP位點(diǎn)的差異； (6)結(jié)果判定，GalRl基因SNP位點(diǎn)rsl944545為G，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，或 SNP 位點(diǎn) rs462106 2、rsl 1662010、rs5373、rs5374、rs4890921 和 rsl944545 組成的單倍型AACTTG的個體為強(qiáng)迫性障礙的易感人群。
3.一種等位基因特異性的核酸引物，其特征在于，其長度為17-30bp，具有SEQ ID NO:5、6、7 或 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 所示的序列，且特異性的擴(kuò)增出含GalRl基因的SEQ ID NO:1所示序列中第137位的SNP擴(kuò)增產(chǎn)物或SEQ IDNO:2所示序列中第139位擴(kuò)增產(chǎn)物，SEQ ID NO:3所示序列中第34位和368位的擴(kuò)增產(chǎn)物以及SEQ IDNO:4所示序列中第30位和400位擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.一種檢測GalRl基因單核苷酸多態(tài)性用于輔助診斷強(qiáng)迫性障礙的試劑盒，其特征在于，它包括: (1)特異性擴(kuò)增GalRl基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的引物6組:SEQID NO:5、6、7 ;SEQIDN0:8、9、10 ;SEQ ID NO:11、12、13 ;SEQID NO: 14、15、16 ;SEQ ID NO: 17、18、19 和 SEQID NO:20、21、22。
(2)含有檢測擴(kuò)增產(chǎn)物與正常的GalRl基因相比是否存在變化所需的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種強(qiáng)迫性障礙相關(guān)基因GalR1的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的檢測方法以及在診斷強(qiáng)迫性障礙方面的應(yīng)用。本發(fā)明中GalR1基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs1944545為G等位位點(diǎn)，在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，以及由位于該基因上的SNP位點(diǎn)rs4621062、rs11662010、rs5373、rs5374、rs4890921和rs1944545組成的單倍型AACTTG；利用本發(fā)明提供的強(qiáng)迫性障礙相關(guān)基因及其多態(tài)性位點(diǎn)的核酸序列，構(gòu)建對強(qiáng)迫性障礙進(jìn)行遺傳學(xué)診斷的試劑盒，可應(yīng)用于對強(qiáng)迫性障礙的輔助診斷和對個體是否具有強(qiáng)迫性障礙的易感性進(jìn)行判別，有利于疾病的預(yù)防、早期診斷、治療和新藥開發(fā)。
文檔編號C12N15/12GK103173454SQ20111044468
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者張心華, 于春燕, 段妮 申請人:青島大學(xué)