本發(fā)明屬于分子生物學領域，應用于基因遺傳風險評估，具體地說是一種能夠從基因水平評估高脂血癥患病風險的高脂血癥風險關聯基因多態(tài)性檢測方法。

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背景技術：
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隨著人們生活水平的不斷提高，日常膳食結構有了很大變化，與營養(yǎng)失衡相關的慢性疾病逐漸成為我國居民死亡的主要疾病，特別是心腦血管疾病，心腦血管疾病主要由動脈粥樣硬化引起，而高脂血癥(hyperlipidemia；HLP)則是導致動脈粥樣硬化的首要危險因素，高脂血癥的發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多因素影響。現有研究發(fā)現多個基因與血脂代謝相關，APOE(載脂蛋白E)基因上的C112R位點多態(tài)性(rs429358)和R158C位點多態(tài)性(rs7412)、LPL(脂蛋白脂酶)基因HindⅢ位點多態(tài)性(rs320)和MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)基因C677T位點多態(tài)性(rs1801133)與HLP密切相關，其多態(tài)性檢測可作為受檢者患高脂血癥風險的預測依據。

APOE(載脂蛋白E)參與乳糜微粒和中間密度脂蛋白代謝。APOE基因主要有三個等位基因APOE2、APOE3和APOE4，這三種等位基因的差別在于第112位和第158位氨基酸殘基是半胱氨酸還是精氨酸。APOE4基因相比于APOE3和APOE2對膽固醇有更好的代謝能力，而APOE2的蛋白代謝膽固醇的效率是這三種等位基因中最低的，所以APOE2純合子的人患血管疾病和Ⅲ型高脂血癥的概率要遠高于其他人。因此檢測APOE基因型可以預測患高脂血癥的風險。

LPL(脂蛋白脂酶)是血漿甘油三脂代謝的限速酶，在脂質代謝中發(fā)揮極其重要的作用，有研究表明LPL基因內含子8區(qū)的HindⅢ酶切位點多態(tài)性與高脂血癥的發(fā)生密切相關，是由495位的T突變?yōu)镚引起的HindⅢ酶切位點缺失導致，將無HindⅢ酶切位點定義為H^-，有HindⅢ酶切位點定義為H⁺，目前的研究表明，跟H^-等位基因相比，H⁺等位基因與低LPL活性有關，即LPL Hind Ⅲ酶切位點T等位基因是高脂血癥的風險因子。

MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)編碼葉酸代謝通路中的關鍵酶，把同型半胱氨酸(HCY)甲基化為甲硫氨酸，MTHFR基因在677位點上的C突變?yōu)門導致其編碼酶活性的降低，抑制HCY轉化為甲硫氨酸，導致高HCY血癥和低甲硫氨酸血癥，而HCY水平的升高是導致高脂血癥重要、獨立的危險因素。

鑒于APOE、LPL和MTHFR基因在血脂代謝過程中的重要作用，將上述基因多態(tài)性作為易感因素來篩查易患高脂血癥的人群，盡早采取預防措施，對于降低高脂血癥的發(fā)病率具有重要意義。

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技術實現要素：
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本發(fā)明的目的就是要解決上述的不足而提供一種高脂血癥風險關聯基因多態(tài)性檢測方法，能夠將前述基因多態(tài)性作為易感因素來篩查易患高脂血癥的人群，進而可盡早采取預防措施，降低高脂血癥的發(fā)病率。

為實現上述目的設計一種高脂血癥風險關聯基因多態(tài)性檢測方法，包括以下步驟：

1)提取DNA模板。采用DNA提取試劑盒抽提DNA，該試劑盒包括：檢測APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)以及MTHFR基因上C677T(rs1801133)的4個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物及測序引物；

2)PCR擴增反應。使用試劑盒中的PCR反應體系，該PCR反應體系包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR buffer和ddH₂O；反應條件為：94℃預變性3min，94℃變性30秒，退火30秒，72℃延伸1min，擴增35個循環(huán)，72℃最后延伸10min，保存于4℃；

3)PCR擴增產物純化。使用試劑盒中的PCR產物純化體系，該PCR產物純化體系包括SAP酶、Exo I酶和ddH₂O；在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為37℃15min，72℃20min；

4)DNA測序。測序反應體系包含PCR純化產物、25％BigDye mix、3.2uM DNA測序引物、去離子水；在PCR擴增儀上進行反應：98℃2min，進行25個循環(huán)的96℃30秒，55℃30秒，60℃4min；反應結束后加入125mM EDTA溶液和100％乙醇溶液于室溫下沉淀15min；在4℃下，3600rpm/min離心30min，輕輕倒去上清液，加入70％乙醇溶液，3600rpm/min離心15min，倒去上清液，室溫放置20min后，加入HIDI溶液，放入測序儀中；

5)基因型分析：通過測序圖譜即可直接讀出SNP位點基因型。

進一步地，步驟2)中，PCR反應體系的體積以25μL計，其組分及含量為：5×PCR buffer5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，2.5mM dNTP混合液2μL，ddH₂O 10.75μL，10μM上下游引物各2.5μL，DNA模板2μL。

進一步地，步驟2)中，APOE基因上C112R和R158C的退火溫度為63℃，LPL基因上HindⅢ的退火溫度為57℃，MTHFR基因上C677T的退火溫度為57℃。

進一步地，步驟3)中，PCR產物純化體系的體積以25μL計，其組分及含量為：20μLPCR產物，1U/μL SAP酶0.75μL，10U/μL Exo I酶0.375U/μL，ddH₂O 3.875μL。

進一步地，步驟4)中，測序反應體系的總體積以5μL計，其組分及含量為：PCR純化產物1μL、25％BigDye mix1μL，3.2uM DNA測序引物1μL，去離子水2μL，125mM EDTA溶液1μL，100％乙醇溶液15μL，70％乙醇溶液30μL，HIDI溶液8μL。

進一步地，步驟4)中，各基因測序引物為：

APOE(C112R/R158C)：5′-CACTGTGCGACACCCTCCCC-3′；

LPL(HindⅢ)：5′-TCATTTGGCACTGTTTCTTGC-3′；

MTHFR(C677T)：5′-TCAAGGCAGGACAGTGTGGGAGTTC-3′。

本發(fā)明同現有技術相比，提供了一種高脂血癥風險關聯基因多態(tài)性檢測方法，該方法首先采用DNA提取試劑盒抽提DNA，試劑盒包括檢測APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)和MTHFR上C677T(rs1801133)的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點基因型的特異性引物及測序引物，同時使用試劑盒中的PCR反應體系、PCR產物純化體系、DNA測序體系，以及配合使用各體系合理的組分和含量，最終通過測序圖譜直接讀出SNP位點基因型，根據檢測結果，結合APOE、LPL和MTHFR基因在血脂代謝過程中的作用，將上述基因多態(tài)性作為易感因素來篩查易患高脂血癥的人群，進而可盡早采取預防措施，降低高脂血癥的發(fā)病率。

[附圖說明]

圖1是本發(fā)明實施例APOE基因上(C112R)的檢測結果示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例APOE基因上(R158C)的檢測結果示意圖。

[具體實施方式]

本發(fā)明提供了一種高脂血癥風險關聯基因多態(tài)性檢測方法，方法中所使用到的DNA提取試劑盒包括：檢測APOE基因上C112R(rs429358)和R158C(rs7412)、LPL基因上HindⅢ(rs320)和MTHFR上C677T(rs1801133)的4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點基因型的特異性引物及測序引物。試劑盒中的PCR反應體系、PCR產物純化體系、DNA測序體系分別為：PCR反應體系包括Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR buffer和ddH₂O等；PCR產物純化體系包括SAP酶、Exo I酶和ddH₂O等；DNA測序體系包括Big Dye Mix、EDTA溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、HIDI溶液和ddH₂O等。

該試劑盒的具體組分和含量為：25μLPCR反應體系：5×PCR buffer 5μL；5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL；2.5mM dNTP混合液2μL；ddH₂O 10.75μL；10μM上下游引物各2.5μL；DNA模板2μL。25μLPCR純化體系：20μLPCR產物；1U/μL SAP酶0.75μL；10U/μL Exo I酶0.375U/μL；ddH₂O 3.875μL。測序反應體系：25％BigDye mix 1μL；3.2μM DNA測序引物1μL；125mM EDTA溶液1μL；100％的乙醇溶液15μL；70％乙醇溶液30μL；HIDI溶液8μL；ddH₂O 2μL。

下面結合具體實施例對本發(fā)明作以下進一步說明：

1.提取DNA模板

刮取口腔黏膜上皮細胞，用康為DNA提取試劑盒抽提DNA。

2.PCR擴增反應

使用試劑盒中PCR反應組件，其中各基因引物序列分別如下表：

PCR反應體系：5×PCR buffer 5μL；5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL；2.5mM dNTP混合液2μL；ddH₂O 10.75μL；10μM上下游引物各2.5μL；DNA模板2μL。

反應條件：94℃預變性3min，94℃變性30秒，退火30秒(不同基因按相應的退火溫度)，72℃延伸1min，擴增35個循環(huán)，72℃最后延伸10min，保存于4℃。

3.PCR擴增產物純化

使用試劑盒中的PCR產物純化組件：20μLPCR產物；1U/μL SAP酶0.75μL；10U/μL Exo I酶0.375U/μL；ddH₂O 3.875μL。

在PCR擴增儀上進行反應：反應條件為37℃15min，72℃20min。

4.DNA測序：

各基因測序引物如下：

APOE(C112R/R158C)：5′-CACTGTGCGACACCCTCCCC-3′

LPL(HindⅢ)：5′-TCATTTGGCACTGTTTCTTGC-3′

MTHFR(C677T)：5′-TCAAGGCAGGACAGTGTGGGAGTTC-3′

反應的體系為總體積5μL，包含PCR純化產物1μL，25％BigDye mix1μL，3.2uM DNA測序引物1μL，去離子水2μL。

在PCR擴增儀上進行反應：98℃2min,進行25個循環(huán)的96℃30秒，55℃30秒，60℃4min。

反應結束后加入125mM EDTA溶液1μL和100％乙醇溶液15μL于室溫下沉淀15min；在4℃下，3600rpm/min離心30min，輕輕倒去上清液，加入70％乙醇溶液30μL，3600rpm/min離心15min，倒去上清液，室溫放置20min后，加入HIDI溶液8μL，放入測序儀中。

5.基因型分析

通過測序圖譜可直接讀出SNP位點基因型。例如對APOE(C112R/R158C)的檢測結果如附圖1和附圖2所示，其中，附圖1是C112R(466T>C)示意圖，附圖2是R158C(604C>T)示意圖，由于112和158位點均未發(fā)生突變，故該檢測者攜帶APOE3等位基因，無患老年癡呆風險。

本發(fā)明并不受上述實施方式的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。