本發(fā)明屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：華法林是一種間接作用的香豆素類口服抗凝藥，通過抑制維生素k在肝臟細胞內(nèi)合成幾種凝血因子而發(fā)揮抗凝作用。華法林可以改變血液的粘稠狀態(tài)，臨床上用于預防和治療血栓。正常劑量的華法林能夠抗凝，劑量不足，達不到防止血栓的治療效果；過量則又容易導致各種出血?；颊咭坏┌l(fā)生出血，就必須減量或停用華法林，而隨后引起的后果就是由于抗凝作用的減弱或停止，導致患者再次形成血栓。由于患者個體間藥物代謝能力存在差異，華法林對每個患者的有效劑量是不同的?？茖W研究顯示，個別基因的多態(tài)性與華法林體內(nèi)代謝吸收有密切關(guān)系。通過遺傳學檢測可改善對患者服用華法林劑量的預測準確度，并可用于優(yōu)化維持劑量，降低引發(fā)出血等并發(fā)癥的風險。華法林是臨床常用的預防血栓栓塞性疾病口服藥物，但存在明顯個體差異。其中，細胞色素p450酶2c9基因(cyp2c9)和維生素k環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1基因(vkorc1)多態(tài)性是華法林個體劑量差異的兩個主要影響因素，分別解釋約37％和6％的劑量差異。美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)于2007年8月修改華法林用藥標簽，提示基因型檢測有助于調(diào)整華法林給藥劑量。2009年美國fda再次修改華法林用藥標簽，并根據(jù)患者vkorc1和cyp2c9基因型確定華法林起始劑量。國際華法林藥物基因組聯(lián)合會(iwpc)收集了5700例來自4大洲9個國家的21個研究機構(gòu)使用華法林達到穩(wěn)定臨床療效的患者信息，并建立數(shù)據(jù)庫。通過對此數(shù)據(jù)庫的篩選和驗證，建立了iwpc模型，是目前涉及病例規(guī)模最大的模型，該模型可解釋華法林個體劑量差異47％。實踐證明，依據(jù)患者基因型并結(jié)合患者臨床信息進行華法林個體化給藥，可明顯提高華法林抗凝達標率，降低抗凝并發(fā)癥，減少患者再住院率。因此，建議在使用華法林前進行cyp2c9*3和vkorc1基因檢測，依據(jù)患者基因型指導華法林給藥劑量。人cyp2c9基因具有遺傳多態(tài)性，亞型分為*1、*2和*3，其中與亞洲人群最為密切的是cyp2c9基因的c.1075位核苷酸存在a/c多態(tài)性。多態(tài)性位點為c(cyp2c9*3型)時，酶活性比野生型降低了80％，而cyp2c9*2型等位基因在中國人中極少發(fā)現(xiàn)。研究表明，華法林由cyp2c9代謝，而其突變體使華法林代謝速率大大降低，用藥個體在使用初期就有較高的出血危險性。華法林是維生素k環(huán)氧化物還原酶vkorc1的特異性抑制劑。大量研究發(fā)現(xiàn)，vkorc1啟動子的基因多態(tài)性(-1639g/a)是影響華法林需求劑量中種族差異和個體差異的最主要因素。因此，cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性檢測對于華法林用藥有重要意義。而目前檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的核苷酸引物及方法準確性和特異性較低，難以在臨床廣泛應(yīng)用。所以探索一種檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性快速可靠的核苷酸引物組及方法已經(jīng)成為臨床實驗研究的熱點問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用，通過調(diào)整引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等，通過fam、hex、rox(修飾)三通道多重pcr反應(yīng)，并且將引物放置到一管內(nèi)分型檢測，提高檢測的簡便性和特異性，使得整個操作以及反應(yīng)過程簡單化。并在此基礎(chǔ)上，對探針進行鎖核酸修飾和二級結(jié)構(gòu)修飾，增加探針的tm值，進一步提高探針結(jié)合的特異性的，最后通過上述體系的調(diào)整，使得準確性和特異性均能夠達到100％，最低檢測濃度能夠達到1ng/μl，解決了以往檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性時準確性和特異性較低的問題。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物，包括針對用于檢測待檢樣品中分別與cyp2c9和vkorc1基因相關(guān)的特異性目的基因的引物對和探針，包括：cyp2c9*2引物：cyp2c9*2基因正向引物(cyp2c9*2-f):gacgctgcggaattttg(seqidno.1)；cyp2c9*2基因反向引物(cyp2c9*2-r):ggtttttctcaactcctcc(seqidno.2)；探針cyp2c9*2-cfp：fam-cctcattgaggaccgtgttcaagagg-bhq1(seqidno.3)；探針cyp2c9*2-tfp：rox-tcttggaggactgtgttcaaga-bhq2(seqidno.4)；cyp2c9*3引物對：cyp2c9*3基因正向引物(cyp2c9*3-f):acacagatgctgtggt(seqidno.5)；cyp2c9*3基因反向引物(cyp2c9*3-r):taatgtcacaggtcactg(seqidno.6)；探針cyp2c9*3-af：fam-agaagcagagatacattgaccttct-bhq1(seqidno.7)；探針cyp2c9*3-cfp：rox-ggagagagataccttgaccttctcc-bhq2(seqidno.8)；vkorc1引物對：vkorc1基因正向引物(vkorc1-f)：ctcctgacctcaagtgatcca(seqidno.9)；vkorc1基因反向引物(vkorc1-r)：caacagtaagggatccctc(seqidno.10)；探針vkorc1-gfp:fam-ccattcaccgcacccggccaatgg-bhq1(seqidno.11)；探針vkorc1-afp:rox-aacacgcacctggccaatggttgtt-bhq2(seqidno.12)；內(nèi)標引物對：her2-f:tgcttggatctggcgcttttggca(seqidno.13)；her2-r:ccaaacactgcctccagctcttgcc(seqidno.14)；探針her2-fp:hex-agggccaggtcctggggtgggc-bhq1(seqidno.15)；其中對cyp2c9*2-cfp、cyp2c9*3-af和vkorc1-gfp的5，端進行fam修飾，3，端進行bhq1修飾；對cyp2c9*2-tfp、cyp2c9*3-cfp和vkorc1-afp的5，端進行rox修飾，3，端進行bhq2修飾；對her2-fp的5，端進行hex修飾，3，端進行bhq1修飾；在cyp2c9*2-cfp序列的第14位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*2-tfp序列的第12位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*3-af序列的第15位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*3-cfp序列的第13位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在vkorc1-gfp序列的第15位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在vkorc1-afp序列的第11位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾。優(yōu)選地，一人份加入量為：cyp2c9*2-f加入量0.1-0.3μl，cyp2c9*3-f加入量0.1-0.3μl，vkorc1-f加入量0.1-0.3μl，cyp2c9*2-r加入量0.1-0.3μl，cyp2c9*3-r加入量0.1-0.3μl，vkorc1-r加入量0.1-0.3μl，cyp2c9*2-cfp加入量0.01-0.2μl，cyp2c9*3-afp加入量0.01-0.2μl，vkorc1-gfp加入量0.01-0.2μl，cyp2c9*2-tfp加入量0.01-0.2μl，cyp2c9*3-cfp加入量0.01-0.2μl，vkorc1-afp加入量0.01-0.2μl，her2-f加入量0.01-0.2μl，her2-r加入量0.01-0.2μl，her2-fp加入量0.01-0.2μl。本發(fā)明提供的一種用于檢測檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物。優(yōu)選地，所述試劑盒包括dna聚合酶(taq酶)、dntps、10×dna聚合酶buffer、udg酶和mg2+，一人份加入量為：dna聚合酶加入量0.1-0.4μl，dntps加入量1-3μl，10×dna聚合酶buffer加入量1-4μl，udg酶加入量0.01-0.2μl，mg2+加入量2-5μl。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的試劑盒的樣本處理方法，包括：(1)提取樣本中的基因組dna，其中樣本可以選用全血樣本；(2)將提取之后的基因組dna進行濃度測定，并將濃度稀釋至10-20ng/μl后，進行熒光定量pcr反應(yīng)；(3)根據(jù)pcr反應(yīng)之后的結(jié)果分析：根據(jù)pcr擴增的結(jié)果進行判讀，得出cyp2c9和vkorc1各個位點的具體型別。優(yōu)選地，步驟(3)中的位點包括cyp2c9*2(c＞t)、cyp2c9*3(a＞c)和vkorc1(g＞a)。優(yōu)選地，pcr反應(yīng)過程為：37℃下udg酶反應(yīng)2min，95℃預變性3min，94℃變性15s，60℃退火延伸35s，40個循環(huán)。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用，具有如下有益效果：本發(fā)明采用這種技術(shù)進行相關(guān)基因檢測，操作簡便、易于判讀，對儀器的要求不高，并且整個pcr過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，使結(jié)果更加精準。本發(fā)明通過探針分型的技術(shù)手段實現(xiàn)在一管內(nèi)對snp(單核苷酸多態(tài)性)位點進行同時檢測，提高檢測的簡便性，進而達到將目的位點精準有效的檢測。本發(fā)明通過設(shè)計鎖核酸和含有二級結(jié)構(gòu)的特異性探針和引物，能夠?qū)⒚總€位點的三個基因型別準確區(qū)分，并且檢測最低濃度能夠達到1ng/μl。本發(fā)明通過調(diào)整引物的配比、taq酶的用量和鎂離子的用量等，提高整個試劑盒的準確性和特異性，準確性和特異性均能夠達到100％。本發(fā)明主要包括采用特異性的多重pcr-熒光探針法檢測cyp2c9和vkorc1基因的單核苷酸多態(tài)性c430t、a1075c和g1639a，用于判斷cyp2c9和vkorc1基因中多態(tài)性位點的分布，進一步用于輔助華法林使用劑量的臨床診斷。附圖說明圖1為本實施例1中各檢測位點基因型的基因峰。具體實施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本發(fā)明方案，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明。本發(fā)明提供的一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物，包括針對用于檢測待檢樣品中分別與cyp2c9和vkorc1基因相關(guān)的特異性目的基因的引物對和探針，包括：cyp2c9*2引物：cyp2c9*2基因正向引物(cyp2c9*2-f):gacgctgcggaattttg；cyp2c9*2基因反向引物(cyp2c9*2-r):ggtttttctcaactcctcc；探針cyp2c9*2-cfp：fam-cctcattgaggaccgtgttcaagagg-bhq1；探針cyp2c9*2-tfp：rox-tcttggaggactgtgttcaaga-bhq2；cyp2c9*3引物對：cyp2c9*3基因正向引物(cyp2c9*3-f):acacagatgctgtggt；cyp2c9*3基因反向引物(cyp2c9*3-r):taatgtcacaggtcactg；探針cyp2c9*3-af：fam-agaagcagagatacattgaccttct-bhq1；探針cyp2c9*3-cfp：rox-ggagagagataccttgaccttctcc-bhq2；vkorc1引物對：vkorc1基因正向引物(vkorc1-f)：ctcctgacctcaagtgatcca；vkorc1基因反向引物(vkorc1-r)：caacagtaagggatccctc；探針vkorc1-gfp:fam-ccattcaccgcacccggccaatgg-bhq1；探針vkorc1-afp:rox-aacacgcacctggccaatggttgtt-bhq2；內(nèi)標引物對：her2-f:tgcttggatctggcgcttttggca；her2-r:ccaaacactgcctccagctcttgcc；探針her2-fp:hex-agggccaggtcctggggtgggc-bhq1；在cyp2c9*2-cfp序列的第14位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*2-tfp序列的第12位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*3-af序列的第15位堿基a上增加鎖核酸(lna)的修飾；在cyp2c9*3-cfp序列的第13位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在vkorc1-gfp序列的第15位堿基c上增加鎖核酸(lna)的修飾；在vkorc1-afp序列的第11位堿基t上增加鎖核酸(lna)的修飾。在引物合成的時候，按照合成單位的規(guī)定標記待修飾堿基即可，合成單位就會知道采用lna的方式修飾此位點。實施例1：本發(fā)明在多重熒光pcr的基礎(chǔ)上，配制成已經(jīng)預混好的檢測位點的引物組合物。直接可對提取完成的樣本進行檢測，這樣使檢測步驟更為簡便。具體步驟如下：1)提取全血樣本中的基因組dna(采用商業(yè)化的外周血基因組dna提取試劑盒)。2)將提取之后的基因組dna進行濃度測定，并將濃度稀釋至10-20ng/μl進行后續(xù)的pcr反應(yīng)過程。3)反應(yīng)體系的成分組成：dntps、mg2+、dna聚合酶buffer、反轉(zhuǎn)錄buffer、基因的引物對、dna聚合酶等。4)pcr反應(yīng)條件：37℃下udg酶反應(yīng)2min；95℃預變性3min；94℃變性15s，60℃下退火延伸35s，40個循環(huán)。5)pcr反應(yīng)體系的配制：pcr擴增mix(12.5μl，其余用純化水補齊)pcr引物混合液體系(6.5μl，其余用純化水補齊)pcr擴增體系pcr擴增程序如下：第一擴增階段：37℃udg酶反應(yīng)2min；第二擴增階段：95℃預變性3min；第三擴增階段：94℃變性15s，60℃退火延伸35s，40個循環(huán)。6)結(jié)果分析①每個樣本內(nèi)標通道(hex)ct值應(yīng)≤35，且靶基因通道兩個擴增反應(yīng)中至少其中一個ct＜38，(靶基因通道無擴增曲線，ct值按40計算)滿足此條件后按表1判讀：②若樣本內(nèi)標通道(hex)ct值＞35，建議重新提取標本，再做檢測；③若樣品內(nèi)標通道ct值≤35，且靶基因通道ct值均ct≥38，則檢測無效。表1結(jié)果判讀檢測名稱ct值結(jié)果判斷cyp2c9*2(c)ct＝ab-a≥5cc基因型cyp2c9*2(t)ct＝b|b-a|＜5ct基因型a-b≥5tt基因型cyp2c9*3(a)ct＝cd-c≥5aa基因型cyp2c9*3(c)ct＝d|d-c|＜5ac混合型c-d≥5cc基因型vkorc1(g)ct＝ef-e≥5gg基因型vkorc1(a)ct＝f|f-e|＜5ga基因型e-f≥5aa基因型7)成品試劑盒的性能驗證利用配置完成的成品試劑盒進行產(chǎn)品特異性、最低檢測限檢測，產(chǎn)品試劑盒的特異性能夠達到100％，最低檢測濃度能到達到1ng/μl。收集全血樣本40例，利用上述成品試劑盒進行特異性檢測，對照結(jié)果采用一代測序作比較，結(jié)果如下：從上述結(jié)果可以得出，本試劑盒的檢測準確性達到100％，特異性也達到100％。利用本試劑盒對50ng/μl，25ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.5ng/μl的不同濃度樣本進行檢測，本試劑盒最低檢測濃度能達到1ng/μl，因此，本試劑盒的檢測最低檢測濃度為1ng/μl。具體實施方式2：收集來自武漢同濟醫(yī)院的200例外周血對照樣本，利用上述的成品試劑盒進行檢測。具體操作步驟如實施案例1所述。本文中應(yīng)用了具體個例對發(fā)明構(gòu)思進行了詳細闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離該發(fā)明構(gòu)思的前提下，所做的任何顯而易見的修改、等同替換或其他改進，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司<120>一種用于檢測cyp2c9和vkorc1基因多態(tài)性的組合物及其應(yīng)用<130>p20170149<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列<400>1gacgctgcggaattttg17<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2ggtttttctcaactcctcc19<210>3<211>26<212>dna<213>人工序列<400>3cctcattgaggaccgtgttcaagagg26<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<400>4tcttggaggactgtgttcaaga22<210>5<211>16<212>dna<213>人工序列<400>5acacagatgctgtggt16<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6taatgtcacaggtcactg18<210>7<211>25<212>dna<213>人工序列<400>7agaagcagagatacattgaccttct25<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8ggagagagataccttgaccttctcc25<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9ctcctgacctcaagtgatcca21<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10caacagtaagggatccctc19<210>11<211>24<212>dna<213>人工序列<400>11ccattcaccgcacccggccaatgg24<210>12<211>25<212>dna<213>人工序列<400>12aacacgcacctggccaatggttgtt25<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<400>13tgcttggatctggcgcttttggca24<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14ccaaacactgcctccagctcttgcc25<210>15<211>25<212>dna<213>人工序列<400>15ccaaacactgcctccagctcttgcc25當前第1頁12