本實用新型涉及一種基因檢測試劑盒，特別是涉及一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)的感染已經(jīng)成為一個世界性的衛(wèi)生難題。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，全球HCV的感染人口接近3％，并且以每年300-400萬的病例遞增,是目前國際上慢性終末期肝病和肝癌的主要病因之一。由于缺乏有效的疫苗，因此及早發(fā)現(xiàn)并給予有效的抗HCV病毒治療，是丙型肝炎患者治療的關(guān)鍵。目前丙型肝炎的抗病毒治療的標準模式為長效干擾素-α(Pegylatedinterferon-α，PEG-IFN-α)和利巴韋林(ribavirin,RBV)的聯(lián)合治療。由于1型丙型肝炎患者的持續(xù)病毒應(yīng)答率低，長期服用相關(guān)藥物所帶來的嚴重不良反應(yīng)，使得丙型肝炎的抗病毒治療成為一大難題。2009-08/2010-01，世界上有4個獨立的研究小組,各自在不同種族的丙型肝炎患者中進行全基因關(guān)聯(lián)(Genome-WideAssociationStudy，GWAS)研究，證實IL-28B區(qū)域附近存在與長效干擾素-α與利巴韋林標準方案療效相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點(SNP)。美國杜克大學(xué)Ge等報道，19號染色體上IL-28B基因上游3kb的一個單核苷酸多態(tài)位點rs12979860，與1型丙型肝炎治療的持續(xù)病毒反應(yīng)率、標準方案SVR預(yù)測的特異性及敏感性密切相關(guān)，可作為預(yù)測1型HCV患者標準方案療效的重要獨立指標。研究表明，具有CC基因型的患者，標準方案治療所帶來的持續(xù)病毒反應(yīng)率比TT型人群要高2倍左右。有研究證實,rs12979860位點CC型對標準方案SVR預(yù)測的特異性及敏感性分別達到了78％和65％,其作為對1型丙型肝炎患者標準治療方案的持續(xù)病毒反應(yīng)率(SVR)所具有獨特的預(yù)測作用,CC型對非CC型的優(yōu)勢比達到了5.79。有研究則進一步證實了該位點的多態(tài)性對非1型慢性丙型肝炎患者，特別是對具有早期病毒學(xué)反應(yīng)(rapidvirologicalresponse,RVR)的這部分患者標準方案的療效具有同樣的預(yù)測作用。澳大利亞悉尼大學(xué)的Suppiah等、日本名古屋城市大學(xué)Tanaka等以及瑞士伯爾尼大學(xué)Rauch等人通過在不同種族的丙型肝炎中所進行全基因關(guān)聯(lián)研究中，一致證實了另1個與持續(xù)病毒反應(yīng)率密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點的存在——即位于IL-28B基因上游8kb的位點rs8099917。研究表明，相對于其他與1型HCV患者抗病毒方案療效相關(guān)的因素，如年齡、病毒載量等，rs8099917基因型對持續(xù)病毒反應(yīng)及無病毒反應(yīng)(NVR)的預(yù)測最為重要。常見的rs8099917位點TT型基因與SVR密切相關(guān),可達到50％,NVR僅為12％,GG型患者中，SVR接近于0％,NVR則可高達80％，GT型的SVR及NVR則介于TT型與GG型之間，這充分說明rs8099917基因型可以作為預(yù)測1型HCV患者標準方案抗病毒治療的另一個指標，特別是針對NVR的預(yù)測。有研究進一步證實，rs8099917對其他非1型HCV患者聯(lián)合治療方案療效同樣具有預(yù)測作用。其中rs8099917位點TT型患者的SVR要高于非TT型患者(SVR為76％vs51％)，特別是對于其中的2a型HCV患者,經(jīng)單變量分析可知rs8099917位點TT型可以作為一個預(yù)測持續(xù)病毒反應(yīng)的獨立指標。Tanaka等研究中同時還證實了在日本人中還存在第三個與持續(xù)病毒反應(yīng)率密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)位點的存在——即位于IL-28B基因下游3kb的位點rs12980275。在其報告中，該位點AA型和AG型患者的持續(xù)病毒反應(yīng)率與位點rs8099917十分相似，分別為63.6％和17.5％。同時，國內(nèi)學(xué)者研究中也顯示rs12980275的基因型在SVR、NVR組中的相關(guān)性分析r均大于0，呈正相關(guān)。rs12980275基因型AA型與AG型，在SVR和NVR患者中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。rs12980275多態(tài)性可有效地預(yù)測干擾素抗病毒治療應(yīng)答效果，具有獨立預(yù)測抗病毒治療的特征。除上述對治療效果的預(yù)測作用外，IL28B基因還與HCV感染流行特點、HCV的自發(fā)清除率、標準治療相關(guān)的不良反應(yīng)也存在著一定的關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn),HCV慢性感染患者中,非1型HCV患者，rs12979860位點CC型的概率明顯高于1型患者(66.7％vs39.1％)，CC型的非1型HCV感染率顯著高于其他基因型的患者。還有研究表明，無論是歐洲還是非洲人群中,rs12979860位點CC別的患者發(fā)生的病毒自發(fā)清除率，要遠遠高于非CC患者(歐洲人80.3％vs66.7％；非洲人56.2％vs37.0％)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，rs12979860位點TT型患者食欲不振、乏力等常見不良反應(yīng)的發(fā)生率明顯低于非TT型患者，其嚴重不良反應(yīng)發(fā)生率僅為3.1％，而在CT型、CC型患者中則分別達到了10.1％、8.9％。因此，IL-28B基因型不僅與SVR存在著很大的相關(guān)性，而且在一定程度上也與HCV感染的流行病學(xué)分布、自發(fā)清除及治療中所帶來的各種不良反應(yīng)相關(guān)。目前已有多個全基因關(guān)聯(lián)研究證實，IL-28B基因區(qū)域附近的SNP位點rs8099917，rs12979860和rs12980275基因型與當前標準方案抗病毒療效密切相關(guān)。通過該位點基因型的檢測，可以達到對丙型肝炎標準方案療效的預(yù)測,從而對不同基因型的患者采取區(qū)別對待及治療的原則,從而改變當前丙型肝炎治療策略,提高整個丙型肝炎診療水平。因此,2011年美國肝臟病研究協(xié)會(AmericanAssociationfortheStudyofLiverDiseases,AASLD)和歐洲肝臟病學(xué)會(EuropeanAssociationForTheStudyOfTheLiver,EASL)在更新的HCV感染防治指南已將IL-28B基因多態(tài)性列為預(yù)測慢性HCV感染療效的重要的因素。目前關(guān)于SNP的檢測包括根據(jù)DNA列陣的微測序法、動態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特異的連接、DNA芯片以及TaqMan系統(tǒng)等，但在所有SNP的檢測方法中，對待檢測片段進行直接擴增、測序是最為準確的方法，也是SNP分析的金標準。而IL-28Brs12979860，rs8099917和rs12980275多態(tài)性的研究多采用芯片的方法，但該方法準確度不高，并且成本較高。本實驗室采用采用的基于PCR擴增后進行直接測序分析的檢測方法，具有準確度高，特異性和重復(fù)性好等特點，可直接對IL-28Brs12979860，rs8099917和rs12980275進行序列比對分析，能準確對SNP位點的基因型進行直觀的判斷，是IL-28Brs12979860、rs8099917和rs12980275SNP分析的金標準。技術(shù)實現(xiàn)要素：本實用新型所要解決的技術(shù)問題是提供一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒，本實用新型將IL28B基因多態(tài)性檢測所需要的試劑進行預(yù)混、整合，操作靈活，使用便捷，易于保存。本實用新型解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒。一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和設(shè)置在盒體內(nèi)的兩塊襯墊3，襯墊3上設(shè)有小孔，左側(cè)小孔中設(shè)有裝有PCR擴增試劑的試劑管4和裝有擴增引物的試劑管5，右側(cè)小孔中設(shè)有裝有PCR產(chǎn)物純化試劑的試劑管6、裝有DNA測序試劑的試劑管(7)和裝有測序正反向引物的八聯(lián)管8；盒蓋2內(nèi)側(cè)設(shè)有條碼區(qū)9。所述兩塊襯墊3將PCR擴增所需試劑和測序純化所需試劑分開放置。擴增引物為測序正反引物預(yù)混成的引物。所述小孔在襯墊3上平行排列。所述條碼區(qū)9內(nèi)含試劑盒中試劑保存、配制信息。有益效果由于采用了上述的技術(shù)方案，本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點和積極效果：本實用新型將IL28B基因多態(tài)性檢測所需要的試劑進行預(yù)混、整合，操作靈活，使用便捷，易于保存；本實用新型采用基于PCR擴增后進行直接測序分析的檢測方法，具有準確度高，特異性和重復(fù)性好等特點，可直接對IL-28Brs12979860，rs8099917和rs12980275進行序列比對分析，能準確對SNP位點的基因型進行直觀的判斷，是IL-28Brs12979860、rs8099917和rs12980275SNP分析的金標準。附圖說明圖1是本實用新型的一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實用新型的IL-28Brs12979860C/T雜合型(b)和C/C純合型(a)的測序峰圖；圖3是本實用新型的IL-28Brs8099917T/G雜合型(b)和T/T純合型(a)的測序峰圖；圖4是本實用新型的IL-28Brs12980275A/G雜合型(b)和A/A純合型(a)的測序峰圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本實用新型講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所使用的實驗材料如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本實用新型的實施方式涉及一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒。如圖1所示，為本實用新型提供的一種IL28B基因多態(tài)性檢測試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖，包括盒體1)盒蓋2和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊3，所述襯墊3將盒體分為左右兩部分，襯墊上設(shè)有小孔，左側(cè)小孔中設(shè)有裝有PCR擴增試劑的試劑管4和裝有擴增引物的試劑管5，右側(cè)設(shè)有裝有PCR產(chǎn)物純化試劑的試劑管6、裝有DNA測序試劑的試劑管7和裝有測序正反向引物的八聯(lián)管8，盒蓋2內(nèi)側(cè)設(shè)有條碼區(qū)9，條碼區(qū)9內(nèi)含試劑盒中試劑保存、配制信息。各試劑排列如圖1所示。操作步驟如下：1.DNA提?。?使用天根公司人類基因組DNA提取試劑盒，貨號：DP331)，按照試劑盒說明書提取DNA，使用50ul去離子水洗脫DNA，若當天不使用，則要-20℃保存。2.PCR：將PCR擴增試劑(成分包括：0.05U/μLTaqDNA聚合酶、400μMdNTPs、4mMMgCl2、20mMTris-HCLPH8.0和50mMKCL)、去離子水及IL-28Brs12979860、rs8099917和rs12980275SNP擴增引物，室溫解凍并混勻，瞬時離心。3.本試劑盒包含3對PCR引物，860F/RPCR擴增產(chǎn)物檢測rs12979860突變；917F/RPCR擴增產(chǎn)物檢測rs8099917突變；275F/RPCR擴增產(chǎn)物檢測rs12980275突變，測序引物與PCR引物共用，如下表：引物濃度均為5umol/L。4.PCR反應(yīng)體系：每個樣本需要做三管PCR擴增(使用不同的PCR引物)，體系配制如下表，每一個PCR擴增總體積20uL。PCR擴增試劑10μL去離子水6μLPCR引物(上游)1μLPCR引物(下游)1μLDNA2μL5.PCR反應(yīng)條件：6.PCR產(chǎn)物純化：每一個反應(yīng)孔體系總體積為11uL，由PCR產(chǎn)物純化試劑2uL和PCR產(chǎn)物9uL組成。反應(yīng)條件為：37℃、50分鐘；95℃、5分鐘；4℃保存。7.DNA測序反應(yīng)：每一個反應(yīng)孔體系總體積為5uL，有去離子水2uL、測序引物1uL、PCR純化產(chǎn)物1uL和DNA測序試劑1uL組成。反應(yīng)條件為：95℃、4分鐘；95℃、15秒；56℃、20秒、60℃、2分鐘，共25個循環(huán)；4℃保存。8.反應(yīng)結(jié)束后，每管加入2uL125MM乙二胺四乙酸二鈉EDTA-2Na和15uL無水乙醇，震蕩混勻，3700轉(zhuǎn)/分，4℃離心30分鐘，輕輕倒去上清液體；每管加入50uL75％的乙醇，3700轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘，輕輕倒去上清液體；室溫放置10～15分鐘后，每管加入10ul去離子甲酰胺HIDI溶液，震蕩混勻，靜置10分鐘，上測序儀。9.結(jié)果分析：將測序儀上的結(jié)果拷貝下來，使用Chromas分析測序結(jié)果。IL-28Brs12979860C/T雜合型(b)和C/C純合型(a)的測序峰圖見圖2；IL-28Brs8099917T/G雜合型(b)和T/T純合型(a)的測序峰圖見圖3；IL-28Brs12980275A/G雜合型(b)和A/A純合型(a)的測序峰圖見圖4。當前第1頁1 2 3