專利名稱：一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置，屬于生物技術(shù)與組織工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Inducedpluripotent stem cell, iPS cells)技術(shù)是近年來干細(xì)胞領(lǐng)域最令人矚目的一項(xiàng)新興干細(xì)胞制造技術(shù)。該技術(shù)通過病毒載體或構(gòu)建的特異載體將特定轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入被誘導(dǎo)細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)已分化的體細(xì)胞重編程為未分化的多能細(xì)胞(ffernigm et al.，Nature，2007，448 :318-324.)。iPS 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞極為類似，具有多能性和自我更新的能力(YU et al.，Science, 2007, 318 (5858) : 1917-1920.)。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景，iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞具有類似的功能，在醫(yī)療領(lǐng)域具有多種應(yīng)用，并且解決了 ES細(xì)胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多問題，這使得其受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，并給人類多種疑難雜癥的治療帶來了福音(Park et al. , Cell, 2008,134(5) :877-886.)。然而，制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞仍存在很多問題1)獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞常用的載體為整合到基因組的載體，存在生物安全風(fēng)險。許多研究通過慢病毒等得到老鼠或人類的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞。這種已建立的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在基因組上包含多個病毒整合位點(diǎn)。iPS細(xì)胞產(chǎn)生過程中逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的使用引發(fā)了安全問題。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為RNA病毒。慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-I (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。雖然目前慢病毒已發(fā)展為四質(zhì)粒的系統(tǒng)，大大降低了同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力病毒(RCR)的可能性，但涉及慢病毒的操作仍需要在二級生物安全柜中進(jìn)行操作。2)制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的過程是相對時間較長，一般在20-30天左右有克隆產(chǎn)生，操作程序較多，污染機(jī)率大。目前，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究大多集中于誘導(dǎo)效率的提高、誘導(dǎo)方式的改變和應(yīng)用干細(xì)胞治療的基礎(chǔ)性研究，關(guān)于利用灌流系統(tǒng)制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置。本發(fā)明提供的一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置包括灌流瓶、廢液瓶和灌流反應(yīng)器；所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口 ；所述進(jìn)液口通過輸入管路與所述灌流瓶相連通，所述出液口通過輸出管路與所述廢液瓶相連通；所述灌流反應(yīng)器包括封閉的腔體和設(shè)于所述腔體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的底部為半透膜；所述細(xì)胞培養(yǎng)板的入口與所述進(jìn)液口相連通，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的出口與所述出液口相連通；所述輸入管路和所述輸出管路上均設(shè)有至少一個蠕動泵。上述的自動灌流裝置中，所述半透膜能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過且能使細(xì)胞培養(yǎng)液通過，從而培養(yǎng)液能在所述裝置中流動。上述的自動灌流裝置中，所述灌流瓶和所述廢液瓶的瓶蓋上均設(shè)有氣體濾頭，所述氣體濾頭可以使所述罐流瓶和所述廢液瓶內(nèi)的壓強(qiáng)與外界相同，并且可以隔絕外界空氣中的細(xì)菌污染。上述的自動灌流裝置中，所述進(jìn)液口與所述輸入管路通過管道夾相連接；所述出液口與所述輸出管路通過管道夾相連接，從而可以加固連接。上述的自動灌流裝置中，所述輸入管路和所述輸出管路上均設(shè)有一個蠕動泵，可以控制培養(yǎng)基液體在所述裝置中的流速以適應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)需求。
本發(fā)明提供的用于制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置，可以降低制備過程中的生物安全風(fēng)險，縮減操作步驟，減少污染機(jī)率，提高誘導(dǎo)效率。


圖I為本發(fā)明制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中各標(biāo)記如下1灌流瓶、2，3氣體濾頭、4輸入管路、5輸出管路、6灌流反應(yīng)器、7進(jìn)液口、8出液口、9，10蠕動泵、11廢液瓶。
具體實(shí)施例方式下述結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。本發(fā)明提供的制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置包括灌流瓶I、廢液瓶11和灌流反應(yīng)器6 ;灌流反應(yīng)器6的一端設(shè)有進(jìn)液口 7，另一端設(shè)有出液口 8，灌流反應(yīng)器6的進(jìn)液口 7通過輸入管路4與灌流瓶I相連通，該連通處設(shè)有管道夾(圖中未示出)，用于加固該連接；灌流反應(yīng)器6的出液口 8通過輸出管路5與廢液瓶11相連通，該連通處設(shè)有管道夾(圖中未示出)，用于加固該連接；灌流瓶I的瓶蓋上設(shè)有氣體濾頭1，廢液瓶11的瓶蓋上設(shè)有氣體濾頭3，從而可以使罐流瓶I和廢液瓶11內(nèi)的壓強(qiáng)與外界相同，并且可以隔絕外界空氣中的細(xì)菌污染；灌流反應(yīng)器6包括一個封閉的腔體和設(shè)于該腔體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板(圖中未示出)；該細(xì)胞培養(yǎng)板的底部為能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過且能使細(xì)胞培養(yǎng)液通過的半透膜；該細(xì)胞培養(yǎng)板的入口與灌流反應(yīng)器6的進(jìn)液口 7相連通，該細(xì)胞培養(yǎng)板的出口與灌流反應(yīng)器6的出液口 8相連通；輸入管路4上設(shè)有一個蠕動泵9，輸出管路5上設(shè)有一個蠕動泵10，用于控制培養(yǎng)基液體在該裝置中的流速以適應(yīng)細(xì)胞的營養(yǎng)需求。上述的制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的裝置中，輸入管路4和輸出管路5上的蠕動泵的個數(shù)可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)節(jié)；輸入管路4與進(jìn)液口 7之間和輸出管路5與出液口 8之間均還可通過其它方式進(jìn)行加固連接。使用上述裝置時，先將誘導(dǎo)細(xì)胞接種到灌流反應(yīng)器6的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入培養(yǎng)基與特定病毒載體后，放入37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48小時后開啟蠕動泵9和10，并控制液體的流速為O. 45ml/h ;將培養(yǎng)液置于灌流瓶I中，通過蠕動泵9的運(yùn)動將培養(yǎng)液在從輸入管路4內(nèi)輸送到灌流反應(yīng)器6內(nèi)，流經(jīng)反應(yīng)器6內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，由輸出管路5輸送到廢液瓶11中收集，廢液瓶11中可預(yù)先加入I %的SDS溶液用以去除慢病毒毒性，此過程用于沖洗殘留慢病毒載體等，并更換含有特定細(xì)胞因子的培養(yǎng)基，省略人工吸出多余慢病毒載體步驟，并對廢液直接進(jìn)行消毒；在培養(yǎng)基液體流速的控制過程中，液體的流速由輸入管路4和輸出管路5上的蠕動泵9和10控制，可隨時根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的需求調(diào)整培養(yǎng)基液體的流速；此灌流系統(tǒng)運(yùn)行大約18-20天時，取細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行觀察與鑒定；此灌流系統(tǒng)一方面可以使新鮮培養(yǎng)液不斷泵入，另一方面含有代謝廢產(chǎn)物(乳酸、氨等)的廢液不斷排出，通過調(diào)節(jié)灌注速率，可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢產(chǎn)物與細(xì)胞之間的質(zhì)量傳遞 ，降低有害代謝廢物濃度積累。
權(quán)利要求
1.一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置，其特征在于所述裝置包括灌流瓶、廢液瓶和灌流反應(yīng)器；所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口 ；所述進(jìn)液口通過輸入管路與所述灌流瓶相連通，所述出液口通過輸出管路與所述廢液瓶相連通；所述灌流反應(yīng)器包括封閉的腔體和設(shè)于所述腔體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的底部為半透膜；所述細(xì)胞培養(yǎng)板的入口與所述進(jìn)液口相連通，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的出口與所述出液口相連通；所述輸入管路和所述輸出管路上均設(shè)有至少一個蠕動泵。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的自動灌流裝置，其特征在于所述灌流瓶和所述廢液瓶的瓶蓋上均設(shè)有氣體濾頭。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的自動灌流裝置，其特征在于所述進(jìn)液口與所述輸入管路通過管道夾相連接；所述出液口與所述輸出管路通過管道夾相連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的自動灌流裝置，其特征在于所述輸入管路和所述輸出管路上均設(shè)有一個蠕動泵。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的自動灌流裝置。所述裝置包括灌流瓶、廢液瓶和灌流反應(yīng)器；所述灌流反應(yīng)器的一端設(shè)有進(jìn)液口，另一端設(shè)有出液口；所述進(jìn)液口通過輸入管路與所述灌流瓶相連通，所述出液口通過輸出管路與所述廢液瓶相連通；所述灌流反應(yīng)器包括封閉的腔體和設(shè)于所述腔體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)板，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的底部為能阻止待培養(yǎng)細(xì)胞穿過且能使細(xì)胞培養(yǎng)液通過的半透膜；所述細(xì)胞培養(yǎng)板的入口與所述進(jìn)液口相連通，所述細(xì)胞培養(yǎng)板的出口與所述出液口相連通；所述輸入管路和所述輸出管路上均設(shè)有至少一個蠕動泵。本發(fā)明提供的自動灌流裝置，可以降低制備過程中的生物安全風(fēng)險，縮減操作步驟，減少污染機(jī)率，提高誘導(dǎo)效率。
文檔編號C12M3/06GK102952753SQ20111025036
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月29日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細(xì)胞科技有限公司