專利名稱：Xbp1s，一種新型促進軟骨修復的轉(zhuǎn)錄因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明專利涉及一種新型的誘導軟骨細胞分化，促進軟骨修復的轉(zhuǎn)錄因子剪接型 X盒結(jié)合蛋白l(X_box binding protein 1 spliced，XBP1S)，此發(fā)明屬于醫(yī)藥衛(wèi)生領域，可以直接應用于骨外科或創(chuàng)傷修復等臨床和基礎醫(yī)學領域。轉(zhuǎn)錄因子XBPlS作為環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合蛋白/激活轉(zhuǎn)錄因子(cyclic-AMP response element binding protein/activating transcription factor, CREB/ATF)家族的一個重要成員，結(jié)構(gòu)上屬于亮氨酸拉鏈蛋白家族?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示XBPlS是一個序列特異的DNA結(jié)合蛋白，具有DNA識別結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域和結(jié)合其它蛋白結(jié)構(gòu)域三個功能域。XBPlS是真核細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER Stress, ERS)狀態(tài)下激活的一種轉(zhuǎn)錄因子， ERS介導的未折疊蛋白反應(Unfolded Protein Response,UPR)直接指導和參與ERS狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中異常蛋白質(zhì)的降解和再折疊，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，實現(xiàn)對細胞的保護。其中轉(zhuǎn)錄因子 XBPlS 介導的一條 UPR 信號通路 inositol-requiring enzymel (IREl)-XBPl 是決定細胞最終命運的關鍵通路，也是促進細胞分化的關鍵途徑。我們首先在軟骨細胞分化的不同時相檢測了 XBPlS的轉(zhuǎn)錄與表達，同時運用免疫組織化學技術在不同胎齡小鼠骨生長板軟骨細胞內(nèi)檢測了 XBPlS的表達，我們發(fā)現(xiàn)XBPlS 在軟骨細胞分化的增殖期和肥大期均有表達。同時，我們利用基因芯片技術，在軟骨細胞中篩選出XBPlS反式激活的一系列差異表達基因。在得到的2，986個差異表達基因中(篩選標準實驗組與對照組熒光信號強弱的比值fold change 2 fold為差異表達基因)，包括1701個表達明顯上調(diào)的基因；979個表達明顯下調(diào)的基因。在這些XBPlS反式激活表達上調(diào)的基因中，包括誘導軟骨細胞分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和生長因子GEP，軟骨細胞中XBPlS可以明顯上調(diào)BMP2和GEP的表達，XBPlS上調(diào)BMP2和GEP表達的倍數(shù)分別是 3. 39和3. 17 ；同時，我們利用realtime PCR和免疫印跡等研究方法也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBPlS 在軟骨細胞中可以明顯上調(diào)BMP2和GEP的轉(zhuǎn)錄與表達(基金編號No. 31040019,2011年 12月結(jié)題)。GEP，又名Progranulin (PGRN)，屬于自分泌生長因子，分子量68. 5KD，在合成之后要進行糖基化修飾，通過分泌到細胞外，與靶細胞表面特異受體結(jié)合發(fā)揮其生物學作用。我們研究結(jié)果顯示BMP2可以明顯上調(diào)GEP的轉(zhuǎn)錄和表達(見說明書附圖Fig. 1A)； 重組GEP蛋白可以明顯促進軟骨細胞的分化(見說明書附圖Fig. 1B,1C)；而運用RNAi技術抑制GEP的表達可以顯著抑制ΒΜΡ2誘導的軟骨細胞分化(見說明書附圖Fig. ID, IE)， 因此，GEP是BMP2誘導產(chǎn)生的一種可以促進軟骨細胞分化的生長因子，并且BMP2誘導的軟骨細胞分化依賴于GEP的存在。2011年3月10日，我們在《SCIENCE》上率先公布了生長因子Progranulin(PGRN)的受體，這一令人振奮的研究成果很好的解釋了 PGRN在軟骨發(fā)育中的多項生物學功能誘導分化、促進修復和抗炎。PGRN，又名Granulin-Epithelin Precursor(GEP)，作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 (Bone Morphogenetic Protein2, BMP2)的下游分子參與誘導軟骨細胞的分化；而轉(zhuǎn)錄因子XBPlS在軟骨細胞中明顯上調(diào)BMP2和GEP，我們的研究結(jié)果顯示XBPlS可以通過上調(diào)GEP、BMP2誘導軟骨細胞分化，促進軟骨的修復。這一發(fā)明可以直接應用于骨外科或創(chuàng)傷修復等臨床和基礎醫(yī)學領域，有助于探索與解析軟骨發(fā)育新的調(diào)控機制、為開發(fā)參與軟骨生成與修復的生物制劑提供靶分子。
背景技術：
目前，臨床使用的大多數(shù)藥物治療不能有效促進關節(jié)軟骨缺損的愈合；自體軟骨來源又非常有限，軟骨移植手術也相應受到限制。因此，研發(fā)促進軟骨修復的生物制劑是非常有意義的。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBPlS可以誘導軟骨細胞的分化，促進軟骨修復。正對XBPlS的這一生物學功能，同時也為了后續(xù)的進一步深入研究，我們進一步對其基因序列進行改造，在XBPlS起始密碼子ATG后面增加信號肽(singal peptide)序列，以確保XBPlS的真核表達與蛋白質(zhì)的分離純化。相關背景技術如下
首先，進入互聯(lián)網(wǎng)美國國家圖書館網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov,根據(jù)GenBank 提供的XBPlS mRNA全序列XBPlS (AB076384)，用引物設計軟件NTI vector設計引物，上游引物加入BamH I酶切位點，下游引物加入HindIII酶切位點，目的基因擴增長度lU8bp，構(gòu)建XBPlS腺病毒載體Ad-XBPlS。同樣的方法設計內(nèi)參GAPDH引物，擴增長度M2bp。酶切電泳與測序結(jié)果顯示構(gòu)建正確，免疫印跡檢測所構(gòu)建病毒可以正確表達(見說明書附圖1、 2)。其次，我們利用基因芯片技術，在軟骨細胞中篩選出XBPlS反式激活的一系列差異表達基因。在得到的2，986個差異表達基因中(篩選標準實驗組與對照組熒光信號強弱的比值fold change 2 fold為差異表達基因)，包括1701個表達明顯上調(diào)的基因；979 個表達明顯下調(diào)的基因。在這些XBPlS反式激活表達上調(diào)的基因中，包括誘導軟骨細胞分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP2和生長因子GEP，軟骨細胞中XBPlS可以明顯上調(diào)BMP2和GEP 的表達，XBPlS上調(diào)BMP2和GEP表達的倍數(shù)分別是3. 39和3. 17 ；同時，我們利用realtime PCR和免疫印跡等研究方法也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBPlS在軟骨細胞中可以明顯上調(diào)BMP2和GEP 的轉(zhuǎn)錄與表達(相應結(jié)果見說明書附圖3)。第三，我們運用不同類型干細胞(C3H10T1/2，ATDC5)的體外微團培養(yǎng)，在軟骨細胞分化的不同時期，采用real-time PCR及免疫印跡等方法檢測了 XBPlS的轉(zhuǎn)錄與表達；同時運用免疫組織化學技術在不同胎齡小鼠骨生長板軟骨細胞內(nèi)檢測了 XBPlS的表達，我們發(fā)現(xiàn)XBPlS在軟骨細胞分化的增殖期和肥大期均有表達，并且隨著軟骨發(fā)育的不斷成熟， XBPlS表達逐漸增加，在新生小鼠軟骨發(fā)育的肥大期XBPlS表達達到峰值(相應結(jié)果見說明書附圖4)。第四，構(gòu)建si-XBPIS腺病毒載體，與前面構(gòu)建好的XBPlS腺病毒載體Ad-XBPlS分別轉(zhuǎn)染干細胞C3H10T1/2和ATDC5，結(jié)合干細胞微團培養(yǎng)、小鼠趾骨體外誘導培養(yǎng)等方法， 檢測XBPlS與軟骨細胞分化的關系，結(jié)果顯示，XBPlS參與誘導軟骨細胞的分化，通過上調(diào)軟骨細胞肥大期標志基因X型膠原(Collagen type X，ColX)的表達，促進軟骨細胞的分化；通過免疫組化等相關技術檢測XBPlS Knockdown(KD)小鼠趾骨發(fā)現(xiàn)XBPlS促進軟骨細胞肥大、礦化與內(nèi)骨生長，促進軟骨修復(相應結(jié)果見說明書附圖5、6、7)?？傊?，真核細胞中XBPlS具有調(diào)控細胞的生長、增殖、分化或者凋亡的能力，是決定細胞最終命運的調(diào)節(jié)器。我們進一步通過動物實驗證實，轉(zhuǎn)錄因子XBPlS可以促進和誘導軟骨細胞的分化，促進骨質(zhì)增長，修復受損的關節(jié)，增加骨關節(jié)腔中軟骨的密度，從而促進形成關節(jié)軟骨組織，達到預防和治療關節(jié)炎的作用。

發(fā)明內(nèi)容
人類XBPlS基因位于22號染色體(22ql2. 1)上，在成人組織中廣泛存在和表達， 是新近發(fā)現(xiàn)的一種與蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)建相關的蛋白質(zhì)。XBPlS基因結(jié)構(gòu)分析顯示 XBPlS是一個序列特異的DNA結(jié)合蛋白，具有DNA識別結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域和結(jié)合其他蛋白結(jié)構(gòu)域三個功能域。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBPlS可以誘導軟骨細胞的分化，促進軟骨修復，并進一步在動物實驗中證實了 XBPlS的這一生物學功能。轉(zhuǎn)錄因子XBPlS的基因序列如下
ATG gtggtggtg gcagccgcgc cgaacccggc cgacgggacc cctaaagttc tgcttctgtc ggggcagccc gcctccgccg ccggagcccc ggccggccag gccctgccgc tcatggtgcc agcccagaga ggggccagcc cggaggcagc gagcgggggg ctgccccagg cgcgcaagcg acagcgcctc acgcacctga gccccgagga
gaaggcgctgaggaggaaactgaaaaacagagtagcagctcagactgccagagatcgaaagaaggctcgaatgagtgagctggaacagcaagtggtagatttagaagaagagaaccaaaaacttttgctagaaaatcagcttttacgagagaaaactcatggccttgtagttgagaaccaggagttaagacagcgcttggggatggatgccctggttgctgaagaggaggcggaagccaaggggaatgaagtgaggccagtggccgggtctgctgagtccgcagcaggtgcaggcccagttgtcacccctccagaacatctccccatggattctggcggtattgactcttcagattcagagtctgatatcctgttgggcattctggacaacttggacccagtcatgttcttcaaatgcccttccccagagcctgccagcctggaggagctcccagaggtctacccagaaggacccagttccttaccagcctccctttctctgtcagtggggacgtcatcagccaagctggaagccattaatgaactaattcgttttgaccacatatataccaagcccctagtcttagagataccctctgagacagagagccaagctaatgtggtagtgaaaatcgaggaagcacctctcagcccctcagagaatgatcaccctgaattcattgtctcagtgaaggaagaacctgtagaagatgacctcgttccggagctgggtatctcaaatctgctttcatccagccactgcccaaagccatcttcctgcctactggatgcttacagtgactgtggatacgggggttccctttccccattcagtgacatgtcctctctgcttggtgtaaaccattcttgggaggacact
tttgccaatg aactctttcc ccagctgatt agtgtc TAA XBPlS氨基酸序列如下
mvwaaapnp adgtpkvlll sgqpasaaga pagqalplmv paqrgaspea asgglpqark rqrlthlspe ekalrrklkn rvaaqtardr kkarmseleq qwdleeenq kl llenql Ir ekthglwen qelrqrlgmd alvaeeeaea kgnevrpvag saesaagagp wtppehlpm dsggidssds esdillgild nldpvmffkc pspepaslee lpevypegps slpaslslsv gtssakleai nelirfdhiy tkplvleips etesqanvw kieeaplsps endhpefivs vkeepveddl vpelgisnll ssshcpkpss clldaysdcg yggslspfsd mssllgvnhs wedtfanelf pqlisv 我們首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBPlS可以促進和誘導軟骨細胞的分化，促進骨質(zhì)增長，修復受損的關節(jié)軟骨，增加骨關節(jié)腔中軟骨的密度，從而促進形成關節(jié)軟骨組織，達到預防和治療關節(jié)炎的作用。XBPlS的這一生物學功能的發(fā)現(xiàn)具有創(chuàng)造性和創(chuàng)新性。我們的發(fā)明內(nèi)容是XBP1S誘導軟骨細胞分化、促進軟骨修復的生物學功能。我們申請對轉(zhuǎn)錄因子XBPlS上述兩項特定的內(nèi)容進行專利保護。根據(jù)中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局發(fā)布的”專利審查指南O010) ”第三部分”進入國家階段的國際申請的審查”部分的規(guī)定(P302)如果在申請的發(fā)明中，某蛋白質(zhì)已知而其氨基酸序列是未知的， 那么只要本領域技術人員在該申請?zhí)峤粫r可以容易地確定其氨基酸序列，編碼該蛋白質(zhì)的基因發(fā)明就不具有創(chuàng)造性。但是，如果該基因具有特定的堿基序列，而且與其他編碼所述蛋白質(zhì)的、具有不同堿基序列的基因相比，具有本領域技術人員預料不到的效果，則該基因
的發(fā)明具有創(chuàng)造性。
說明書


圖1是XBPlS的PCR擴增結(jié)果與真核表達載體酶切電泳圖。A.XBP1S PCR擴增結(jié)果; B. pcDNA3. 1 (-) -XBPlS 酶切電泳結(jié)果· 圖2是XBPlS測序結(jié)果圖.
圖3是軟骨細胞中XBPlS反式激活基因的差異表達譜分析.
圖4是軟骨發(fā)育不同時期XBPlS的表達結(jié)果.BMP2誘導微團培養(yǎng)干細胞C3H10T1/2，
A.real-time檢測軟骨細胞分化不同時間點XBPlS與ColX的mRNA水平；B.免疫印跡檢測軟骨細胞分化不同時間點XBPlS與ColX的表達；C.免疫組化檢測XBPlS在小鼠軟骨生長板增殖期與肥大期均有表達.
圖5是靶向XBPlS的兩條siRNA的測序結(jié)果.
圖6是SiXBPlS導致小鼠軟骨發(fā)育遲緩的檢測結(jié)果.A. SiXBPlS小鼠(KD)中XBPlS表達降低；B. Mfrmin O檢測KD小鼠中軟骨生長板發(fā)育遲緩；C，D，E.原位雜交檢測KD小鼠中軟骨生長板ColII(C)/ColX (D)/Α ρφ)表達明顯降低.
圖7是XBPlS促進軟骨細胞肥大、礦化與內(nèi)骨生長，促進軟骨修復的檢測分析結(jié)果.Α，
B.Mfranin O/Fast Green染色顯示Ad-XBPlS誘導培養(yǎng)15. 5天胎鼠趾骨的發(fā)育；C， D. Alizarin red/Alcim blue染色顯示Ad-XBPlS誘導培養(yǎng)15. 5天胎鼠趾骨發(fā)育的礦化與內(nèi)骨生長；E，F(xiàn). Ad-XBPlS促進損傷關節(jié)軟骨的修復與量化分析.
轉(zhuǎn)錄因子XBPlS的基因序列如下
ATG gtggtggtg gcagccgcgc cgaacccggc cgacgggacc cctaaagttc tgcttctgtc
ggggcagccc ggggccagcc gccccgagga gaaggctcga gaaaatcagc ggatggatgc tgctgagtcc attgactctt tcaaatgccc cttaccagcc cgttttgacc tggtagtgaa gaaggaagaa tgcccaaagc tcagtgacat
gcctccgccg cggaggcagc gaaggcgctg atgagtgagc ttttacgaga cctggttgct gcagcaggtg cagattcaga ttccccagag tccctttctc acatatatac aatcgaggaa cctgtagaag catcttcctg gtcctctctg
ccggagcccc
gagcgggggg aggaggaaac tggaacagca gaaaactcat gaagaggagg caggcccagt gtctgatatc cctgccagcc tgtcagtggg caagccccta gcacctctca atgacctcgt cctactggat cttggtgtaa
ggccggccag ctgccccagg tgaaaaacag agtggtagat ggccttgtag cggaagccaa tgtcacccct ctgttgggca tggaggagct gacgtcatca gtcttagaga gcccctcaga tccggagctg gcttacagtg accattcttg
gccctgccgc cgcgcaagcg agtagcagct ttagaagaag ttgagaacca ggggaatgaa ccagaacatc ttctggacaa cccagaggtc gccaagctgg taccctctga gaatgatcac ggtatctcaa actgtggata ggaggacact
tcatggtgcc acagcgcctc cagactgcca agaaccaaaa ggagttaaga gtgaggccag tccccatgga cttggaccca tacccagaag aagccattaa gacagagagc cctgaattca atctgctttc cgggggttcc tttgccaatg
agcccagaga acgcacctga gagatcgaaa acttttgcta cagcgcttgg tggccgggtc ttctggcggt gtcatgttct gacccagttc tgaactaatt caagctaatg ttgtctcagt atccagccac ctttccccat aactctttcc
ccagctgatt agtgtc TAA
轉(zhuǎn)錄因子XBPlS的氨基酸序列如下
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)錄因子，人類X-box binding proteinl spliced (XBPlS)，具有新型、獨特的誘導軟骨細胞分化、促進軟骨修復的生物學功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子XBP1S，其生物學功能特征如下首先，Ad-XBPlS腺病毒顆?？梢悦黠@上調(diào)軟骨細胞分化各標志基因II型膠原(Colli)、X型膠原(ColX)的表達；促進軟骨細胞的肥大、礦化以及軟骨內(nèi)骨化；促進軟骨的修復。其次，與正常小鼠相比，XBPlS knockdown(KD)小鼠骨發(fā)育遲緩、骨生長板增殖緩慢、軟骨內(nèi)骨化延遲；同時，XBPlS KD小鼠的軟骨發(fā)育相關標志基因Colli、ColX及堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, ALP)的表達均明顯降低。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子XBP1S，其所具有的新型、獨特的生物學特征是促進和誘導軟骨細胞的分化，促進軟骨修復。
全文摘要
我們申請的發(fā)明內(nèi)容是轉(zhuǎn)錄因子XBP1S具有誘導軟骨細胞分化、促進軟骨修復的生物學功能。我們首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子XBP1S可以促進和誘導軟骨細胞的分化，促進骨質(zhì)增長，修復受損的關節(jié)，增加骨關節(jié)腔中軟骨的密度，從而促進形成關節(jié)軟骨組織，達到預防和治療關節(jié)炎的作用。XBP1S的這一生物學功能的發(fā)現(xiàn)具有創(chuàng)造性和創(chuàng)新性，為此，我們特申請專利保護。
文檔編號C12N5/077GK102321574SQ201110250119
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者郭風勁 申請人:郭風勁, 重慶醫(yī)科大學