一種天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于骨軟骨組織修復(fù)及其再生技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前，骨關(guān)節(jié)炎、軟骨缺損等疾病是嚴(yán)重威脅著人類健康，而關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)依然是臨床的一大難題。為此，人工生物材料正逐步運(yùn)用于病人的軟骨組織修復(fù)。但是，由于生物相容性、降解性、透明軟骨難以再生等不足，使得目前仍然沒有合適的材料能夠真正替代健康的軟骨組織，實現(xiàn)其原有的生理功能需求。此外，軟骨的損傷往往引起軟骨下骨的損傷及退變，骨軟骨病變在臨床上十分常見，限制了關(guān)節(jié)的活動并且?guī)Ыo病人難以忍受的痛苦。而目前對于同時修復(fù)軟骨聯(lián)合骨的生物材料還基本無報道
[0003]天然組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)含有正常組織或器官細(xì)胞所需的各種生化因子，具有天然宏觀及超微三維的立體結(jié)構(gòu)，并且擁有天然組織的生物力學(xué)性能。目前，運(yùn)用動物(牛、豬)和異體人來源的脫細(xì)胞軟骨用于修復(fù)動物關(guān)節(jié)斷骨缺損有一定的研究報道。然而，目前還未有人報道采用骨聯(lián)合軟骨的脫細(xì)胞材料來修復(fù)軟骨或軟骨聯(lián)合骨的病變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法。本發(fā)明同時對軟骨聯(lián)合骨組織上的軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞進(jìn)行完全去細(xì)胞化處理，且條件溫和、無ECM損害、快速穩(wěn)定。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:天然組織來源的脫細(xì)胞軟骨聯(lián)合骨材料的制備方法，將哺乳動物任意軟骨聯(lián)合骨組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液、有機(jī)溶劑溶液、含Triton X的PBS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液和含DNA酶的I3BS緩沖液處理，獲得脫細(xì)胞軟骨聯(lián)合骨材料。
[0006]哺乳動物任意軟骨聯(lián)合骨組織為四肢長骨關(guān)節(jié)軟骨聯(lián)合骨組織。
[0007]含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液摩爾濃度為I%-5%，蛋白酶抑制劑含量為1KIU/ml；
[0008]有機(jī)溶劑溶液為等體積比的氯仿和甲醇溶液、摩爾濃度10 %-100 %的丙酮溶液或摩爾濃度30 % -70 %的乙醇溶液；
[0009]含TritonX的PBS緩沖液為濃度I %_10% 的Triton X-200或Triton X-100的PBS緩沖液；
[0010]含SDS的PBS緩沖液為摩爾濃度0.5%-10%的SDS的PBS緩沖液，其中混合1-20mmol/L的Tris；
[0011 ] 含DNA酶的PBS緩沖液中DNA酶濃度為0.01-0.5mg/ml ；
[0012]上述天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨材料的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)取哺乳動物全身任意軟骨聯(lián)合骨組織用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、毛發(fā)和韌帶；
[0014](2)在含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液中，恒溫45°C搖床150rpm震蕩8-24小時；
[0015](3)在有機(jī)溶劑溶液中，恒溫45°(:搖床150印111震蕩脫脂2-12小時；
[0016](4)在含Triton X的I3BS緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45°C搖床150rpm震蕩3-72小時；
[0017](5)在含SDS的PBS緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45°C搖床150rpm震蕩2-96小時；
[0018](6)在含DNA酶的I3BS緩沖液中，加入青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37°C搖床150rpm震蕩1-12小時；
[0019](7)在無菌生理鹽水中，37°C搖床150rpm震蕩72小時，即得天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。
[0020]混合抗菌液中青霉素和鏈霉素的濃度分別為10KIU/ml、10KIU/ml，青霉素和鏈霉素的比例為1:1;步驟(4) -(6)中PBS緩沖液和混合抗菌液體積比分別為1: 1、1: 1、5:1。
[0021]步驟(2)-(6)中，每個步驟完成后均用生理鹽水沖洗5小時。
[0022]上述制備方法得到的天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。
[0023]針對目前用于軟骨和軟骨聯(lián)合骨修復(fù)和再生的骨材料及其制備方法存在的問題，發(fā)明人建立了一種天然組織來源的軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的制備方法，該法將哺乳動物任意軟骨聯(lián)合骨組織經(jīng)含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液、有機(jī)溶劑溶液、含Triton X的PBS緩沖液、含SDS的PBS緩沖液、含DNA酶的PBS緩沖液處理，獲得軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料。本發(fā)明能同時對軟骨聯(lián)合骨組織上的軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞進(jìn)行完全去細(xì)胞化處理，且條件溫和、無ECM損害、快速穩(wěn)定，所得軟骨聯(lián)合骨材料具有生物相容性好、可塑性強(qiáng)、生物力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點，可用于修復(fù)臨床上各類病因造成的軟骨缺損和骨關(guān)節(jié)炎等軟骨和軟骨聯(lián)合骨再生、修復(fù)障礙。
[0024]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的顯著進(jìn)步在于:
[0025](I)本發(fā)明運(yùn)用一種脫細(xì)胞方案即可同時實現(xiàn)對全身任意軟骨聯(lián)合骨組織進(jìn)行徹底去細(xì)胞化處理，更加高效便捷的獲得均一性高的脫細(xì)胞軟骨聯(lián)合骨材料。
[0026](2)本發(fā)明在去除具有免疫原性的異體或異種細(xì)胞的同時，可保留原先ECM的完整性，具有良好的細(xì)胞外微環(huán)境、生化因子和生物力學(xué)性質(zhì)等，可以最大限度的模擬正常軟骨和骨組織的成分和結(jié)構(gòu)。
[0027](3)本發(fā)明可以為病人訂制具有個體化、可供移植的軟骨及軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料，并且高效制備脫細(xì)胞材料可滿足臨床上復(fù)雜多樣的軟骨和軟骨聯(lián)合骨修復(fù)填補(bǔ)需求，也可以將其研磨制成粉末，將正常自身軟骨和軟骨聯(lián)合骨組織中所含有的生化因子溶解，用于全身任意部位的骨科疾病。
【附圖說明】
[0028]圖1是本發(fā)明的軟骨聯(lián)合骨材料大體外觀圖；
[0029]圖2是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的HE染色無細(xì)胞及無細(xì)胞核成分殘留圖；
[0030]圖3是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的DAPI染色無細(xì)胞及無細(xì)胞核成分殘留圖；
[0031 ]圖4是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料DNA定量檢測幾乎不含有DNA成分圖；
[0032]圖5是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的膠原定量檢測保留大量膠原成分圖；
[0033]圖6是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料的天狼星紅染色膠原定性檢測保留大量膠原成分圖；
[0034]圖7是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料掃描電鏡檢測軟骨和骨細(xì)胞外基質(zhì)排布和空間立體結(jié)構(gòu)完整保留圖；
[0035]圖8是CCK-8檢測軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料無細(xì)胞毒性；
[0036]圖9是軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料修復(fù)兔子關(guān)節(jié)軟骨聯(lián)合骨缺損的12周修復(fù)效果圖(H&E染色)；
[0037]圖10軟骨聯(lián)合骨脫細(xì)胞材料修復(fù)兔子關(guān)節(jié)軟骨聯(lián)合骨缺損的12周修復(fù)效果圖(番紅固綠染色)。
【具體實施方式】
[0038]實施例1脫細(xì)胞松軟骨聯(lián)合骨材料的制備和研究
[0039](I)取豬股骨頭軟骨聯(lián)合骨，轉(zhuǎn)移至4°C環(huán)境中，用無菌生理鹽水漂洗3次、20分鐘/次，去除血液、殘余肌肉組織、毛發(fā)和韌帶等組織;取材大小視臨床實際手術(shù)需要而定，通常大小為 lcm*0.5cm*lcm。
[0040](2)在1000ml摩爾濃度為I %含蛋白酶抑制劑的生理鹽水緩沖液(蛋白酶抑制劑含量為10KIU/ml)中，恒溫45°C搖床150rpm震蕩24小時，并用生理鹽水沖洗5小時；
[0041 ] (3 )在1 O O m I有機(jī)溶劑溶液(等體積比的氯仿和甲醇溶液)中，恒溫4 5 °C搖床150rpm震蕩脫脂12小時，并用生理鹽水沖洗5小時；
[0042](4)在100ml含Triton X的PBS緩沖液(濃度I % 的Triton X-100)中，加入10ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45°C搖床150rpm震蕩72小時，并用生理鹽水沖洗5小時；
[0043](5)在100ml含SDS的PBS緩沖液(SDS濃度為0.5%，混合Immol的Tris)中，加入10ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，恒溫45°C搖床150rpm震蕩96小時，并用生理鹽水沖洗5小時；
[0044](6)在300ml含DNA酶的PBS緩沖液中(DNA酶濃度為(h01mg/ml)，加入60ml青霉素和鏈霉素混合抗菌液，37 0C搖床150rpm震蕩12小時，并用生