專(zhuān)利名稱(chēng)：融合蛋白GPR85-Gi1α及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白GPR85-Gila及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
G蛋白(G-protein)是一種在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要作用的GTP結(jié)合蛋白，由a，β，Y三個(gè)不同亞基組成。G蛋白具有GTP酶活性，有a，β，Υ三聚體G蛋白、低分子量的單體小G蛋白和高分子量的其他G蛋白三類(lèi)。G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor),是一種與三聚體G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞表面受體，含有7個(gè)穿膜區(qū)，是迄今發(fā)現(xiàn)的最大的受體超家族，其成員有1000多個(gè)。G蛋白偶聯(lián)受體與配體結(jié)合后通過(guò)激活所偶聯(lián)的G蛋白，啟動(dòng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并導(dǎo)致各 種生物效應(yīng)。G蛋白偶聯(lián)受體與其配基-激素、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞激素等相互作用，并且充當(dāng)促進(jìn)或關(guān)閉一很多功能生物過(guò)程的分子開(kāi)關(guān)。G蛋白偶聯(lián)受體在血壓調(diào)節(jié)、炎癥和心理疾病等多種疾病中扮演關(guān)鍵角色?，F(xiàn)代新藥研究與開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵首先是尋找、確定和制備藥物篩選靶-分子藥靶。藥物靶點(diǎn)是指藥物在體內(nèi)的作用結(jié)合位點(diǎn)，包括基因位點(diǎn)、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子。選擇確定新穎的有效藥靶是新藥開(kāi)發(fā)的首要任務(wù)。迄今已發(fā)現(xiàn)作為治療藥物靶點(diǎn)的總數(shù)約500個(gè)，而G-蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR)靶點(diǎn)占其中受體的絕大多數(shù)。高通量藥物篩選是開(kāi)發(fā)藥物早期階段的最重要工具之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白GPR85_Gil a及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在(a)的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列
~Poly-Arg5-6(通常為 5 個(gè)) RRRRR
~Poly-His2-10(通常為 6 個(gè)) HHHHHH
~FlM8DYKDDDDK
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將(a)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端I至2172位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、重組細(xì)胞或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2或3所述基因插入pFASTBacl質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求5所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DHlOBac菌株，通過(guò)菌內(nèi)重組得到的含有權(quán)利要求2或3所述基因的桿狀病毒質(zhì)粒。
7.一種制備權(quán)利要求I所述蛋白的方法，包括如下步驟 (1)將權(quán)利要求6所述桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)后收集上清，即為Pl代病毒液； (2)將所述Pl代病毒液感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)后得到權(quán)利要求I所述蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為sf9細(xì)胞；所述步驟(I)中，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)；所述步驟(2)中，所述感染的感染劑量為MOI = 5，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)間為72h。
9.一種表達(dá)權(quán)利要求I所述蛋白的試劑盒，包括大腸桿菌DHlOBac菌株、昆蟲(chóng)細(xì)胞和權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體。
10.權(quán)利要求I所述蛋白在藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種融合蛋白GPR85-Gi1α及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。單獨(dú)的GPR85或Gi1α蛋白脫離了生命狀態(tài)(活細(xì)胞環(huán)境)是無(wú)法結(jié)合在一起的，需要借助細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，才能結(jié)合成為被Gi1α蛋白特異性抗體識(shí)別的蛋白復(fù)合物。而本發(fā)明提供的融合蛋白，脫離了生命狀態(tài)(活細(xì)胞環(huán)境)即具有Gi1α蛋白的抗原活性，可以作為體外篩選系統(tǒng)，對(duì)候選的作為藥物的化合物或小分子進(jìn)行篩選(考察其能否與融合蛋白結(jié)合)。
文檔編號(hào)C12N15/866GK102863536SQ20111018562
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者劉永學(xué), 彭明麗, 吳芳明, 陳曦, 韓春光, 白月霞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所