專利名稱：一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動(dòng)桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株鮑曼不動(dòng)桿菌。
背景技術(shù)：
甲氧咪草煙(Imazamox)是德國BASF公司(原美國氰胺公司)20世紀(jì)80年代初研制開發(fā)的咪唑啉酮類大豆田專用除草劑，它對(duì)一年生和多年生的禾本科、闊葉科、莎草科雜草及多種灌木和落葉樹有活性。由于該產(chǎn)品比其他滅生性除草劑具有較長(zhǎng)的持效期，可控制雜草4 6個(gè)月，故20世紀(jì)90年代初期在北美、歐洲、東南亞等國家已得到大面積推廣使用，是目前國內(nèi)外使用量較大的一種滅生性除草劑品種，但這類除草劑在土壤中殘留時(shí)間較長(zhǎng)，容易對(duì)后茬作物正常生長(zhǎng)造成影響。目前國內(nèi)外對(duì)甲氧咪草煙的研究報(bào)道主要集中在使用情況和藥害方面，而關(guān)于降解菌株的篩選以及應(yīng)用方面較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株鮑曼不動(dòng)桿菌(AcinetcAacter baumannii)菌株，可高效降解甲氧咪草煙，為甲氧咪草煙除草劑的環(huán)境修復(fù)和降解機(jī)制研究提供理論和微生物資源基石出。本發(fā)明高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動(dòng)桿菌為鮑曼不動(dòng)桿菌 IB5 (Acinetobacterbaumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年04月01 日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4728 ；本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5為革蘭氏陰性菌，桿狀，細(xì)胞大小為(0. 3μπι 0. 5μ )Χ(0. 8μπι 2. 2μ )，無鞭毛(如圖1所示)，產(chǎn)生菌膜，在無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌ΙΒ5氧化酶反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)呈陰性。鮑曼不動(dòng)桿菌 ΙΒ5能夠水解淀粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌ΙΒ5 (Acinetobacter baumannii IB5)通過 16S rDNA序列比對(duì)分析，與不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)的 16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定鮑曼不動(dòng)桿菌IB5屬于不動(dòng)桿菌屬(AcinetcAacter)，為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)菌株。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5可在添加了甲氧咪草煙的LB培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中甲氧咪草煙的最佳終濃度為800mg/L。鮑曼不動(dòng)桿菌IB5的最適生長(zhǎng)溫度為 37°C，最適合生長(zhǎng)環(huán)境的pH值為6 7。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5能夠高效降解甲氧咪草煙，鮑曼不動(dòng)桿菌IB5在甲氧咪草煙濃度為800mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在37°C、pH值為7的條件下，培養(yǎng)48h，對(duì)甲氧咪草煙的降解率達(dá)到92. 46%。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5對(duì)甲氧咪草煙殘留具有修復(fù)作用。
本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)屬于不動(dòng)桿菌屬 (AcinetcAacter)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4728 ο


圖1為本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌ΙΒ5的電子顯微鏡照片；圖2為通過鮑曼不動(dòng)桿菌ΙΒ5 和相近菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖3為具體實(shí)施方式
二中甲氧咪草煙濃度和鮑曼不動(dòng)桿菌IB5的菌體數(shù)量隨時(shí)間的變化關(guān)系曲線，-■-為鮑曼不動(dòng)桿菌IB5菌體數(shù)量變化曲線，-▲-為甲氧咪草煙濃度的變化曲線。
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動(dòng)桿菌為鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年 04月01日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 47280本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)為革蘭氏陰性菌， 桿狀，細(xì)胞大小為(0. 3 μ m 0. 5 μ m) X (0. 8 μ m 2. 2 μ m)，無鞭毛，產(chǎn)生菌膜，在無機(jī)鹽固
體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，顏色為乳白色。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌 IB5 (Acinetobacter baumannii IB5)進(jìn)行生理生化鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌IB5氧化酶反應(yīng)呈陰性，接觸酶反應(yīng)呈陰性。鮑曼不動(dòng)桿菌IB5能夠水解淀粉，氧化乳糖，不氧化山梨醇或蔗糖。本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5可在添加了甲氧咪草煙的LB培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中甲氧咪草煙的最佳終濃度為800mg/L。其中無機(jī)鹽培養(yǎng)基(IOOOmL)由 1. Og 的 NaCl、l. Og 的 NH4NO3U. 5g 的 K2HP04、0. 5g 的 KH2P04、0. Ig 的 MgSO4 · 7H20 和余量的蒸餾水組成。無機(jī)鹽培養(yǎng)基加熱充分溶解后于121°C高壓滅菌15min，冷卻至50 60°C后向其中加入甲氧咪草煙至終濃度為500mg/L。本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5的最適生長(zhǎng)溫度為37°C，最適合生長(zhǎng)環(huán)境的pH值為 6 7。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 (Acinetobacter baumannii IB5) 由中國黑龍江省訥河市受除草劑污染的土壤中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行取黑龍江省訥河市長(zhǎng)期施用甲氧咪草煙藥害農(nóng)田土壤5g于滅菌的廣口瓶中，加入50mL的生理鹽水， 振蕩30s，用8層紗布過濾，取過濾液ImL加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于30°C、180r/min條件下培養(yǎng)7 10天，期間不斷補(bǔ)充甲氧咪草煙，使甲氧咪草煙的濃度提高至800mg/L，得富集培養(yǎng)液；將無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(IOOOmL無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基由1. Og的NaCl、l. Og的NH4NO3U. 5g 的K2HP04、0. 5g的KH2P04、0. Ig的MgSO4 · 7H20、20g的瓊脂和余量的蒸餾水組成)滅菌后冷卻到50 60°C，加入甲氧醚草煙使其終濃度至800mg/L，制作平板，取富集培養(yǎng)液IOOyL 均勻涂布在平板上，于30°C培養(yǎng)24h后挑取生長(zhǎng)較好的菌落進(jìn)行三區(qū)劃線以獲得純培養(yǎng)上述優(yōu)選菌株經(jīng)初篩、復(fù)篩和純化，即可得到鮑曼不動(dòng)桿菌IB5。對(duì)篩選得到的鮑曼不動(dòng)桿菌IB5進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行用熱破壁法提取篩選得到的菌株的總DNA，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆子菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。鮑曼不動(dòng)桿菌IB5的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1524bp，其序列提交至GenBank獲得的登錄號(hào)為FJ550344。測(cè)序結(jié)果通過在線分析與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用軟件Mega4. 0的Neibour-Joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(如圖2所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與不動(dòng)桿菌屬(AcinetcAacter)的鮑曼不動(dòng)桿菌(AcinetcAacter baumannii)的16S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為 99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定鮑曼不動(dòng)桿菌IB5屬于不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)。PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司，其他試劑購自于大連寶生物工程有限公司。對(duì)本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5降解甲氧咪草煙的降解率進(jìn)行測(cè)定，具體方法如下將鮑曼不動(dòng)桿菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草煙的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于37°C、 PH值為7. O的條件下培養(yǎng)，設(shè)置不接菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照，做三個(gè)重復(fù)，每隔3小時(shí)取待測(cè)樣品l.OmL，按1 5的比例加入二氯甲烷，劇烈振蕩5min，靜置分層，取下層有機(jī)相， 于45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至二氯甲烷完全揮發(fā)；流動(dòng)相定容后，取10μ L進(jìn)樣檢測(cè)。檢測(cè)條件檢測(cè)波長(zhǎng)252nm;色譜柱ODS C18規(guī)格4. 6nmX 150nm ；流動(dòng)相色譜甲醇1.0%乙酸(7 3)； 流速1. OmL/min ；進(jìn)樣量10μ L。根據(jù)甲氧咪草煙標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中甲氧咪草煙的殘留量，根據(jù)以下公式求出其降解率甲氧咪草煙降解率(％) = [1_(實(shí)測(cè)殘留量/對(duì)照實(shí)測(cè)殘留量)]X 100。在甲氧咪草煙濃度為800mg/L、37°C、pH = 7. 0的最適生長(zhǎng)條件下，菌株生長(zhǎng)狀況良好。培養(yǎng)液中甲氧咪草煙濃度和鮑曼不動(dòng)桿菌IB5的菌體數(shù)量隨時(shí)間的變化關(guān)系曲線如圖3所示，隨著菌體數(shù)量的增加，培養(yǎng)液中的甲氧咪草煙殘留量逐漸減少，培養(yǎng)48h以后培養(yǎng)液中的甲氧咪草煙含量從800mg/L降低到60. 32mg/L,降解效率達(dá)到92. 46%，說明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5對(duì)甲氧咪草煙具有較高的降解效率。利用敏感作物檢測(cè)本實(shí)施方式鮑曼不動(dòng)桿菌IB5對(duì)甲氧咪草煙殘留的修復(fù)作用， 具體方法如下將鮑曼不動(dòng)桿菌IB5接入含有800mg/L甲氧咪草煙的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(以甲氧咪草煙為唯一碳源)中，于37 °C、pH值為7. 0的條件下培養(yǎng)4 后，取發(fā)酵液經(jīng)過0. 02 μ m 的細(xì)菌濾器過濾，分別取5mL無菌的發(fā)酵液加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個(gè)平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒谷子種子，作為實(shí)驗(yàn)組；分別取5mL未接鮑曼不動(dòng)桿菌 IB5的含有800mg/L甲氧咪草煙的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，分別加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個(gè)平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒谷子種子，作為對(duì)照組1 ；將鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 接入不含有甲氧咪草煙的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于37°C、pH值為7. 0的條件下培養(yǎng)4 后，取發(fā)酵液經(jīng)過0. 02 μ m的細(xì)菌濾器過濾，分別取5mL無菌的發(fā)酵液加入帶有雙層濾紙的滅過菌的2個(gè)平皿中，分別均勻地加入50粒油菜種子和50粒谷子種子，作為對(duì)照組2，每組處理重復(fù)3次。然后于25°C培養(yǎng)2 3天，培養(yǎng)要保持通風(fēng)和適宜的濕度。觀察種子發(fā)芽情況后統(tǒng)計(jì)種子的發(fā)芽率，比較甲氧咪草煙對(duì)種子發(fā)芽率的抑制情況，結(jié)果如表1所示。(對(duì)照組 1表示甲氧咪草煙未降解的條件下種子的發(fā)芽情況，對(duì)照組2中不加甲氧咪草煙，可以檢測(cè)種子本身的發(fā)芽情況)表 權(quán)利要求
1. 一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動(dòng)桿菌，其特征在于高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動(dòng)桿菌為鮑曼不動(dòng)桿菌IB5 (AcinetcAacter baumannii IB5)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4728。
全文摘要
一株高效降解甲氧咪草煙的鮑曼不動(dòng)桿菌，它涉及一株鮑曼不動(dòng)桿菌。本發(fā)明提供了一株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株，可高效降解甲氧咪草煙，為甲氧咪草煙除草劑的環(huán)境修復(fù)和降解機(jī)制研究提供理論和微生物資源基礎(chǔ)。本發(fā)明高效降解甲氧咪草煙菌株的鮑曼不動(dòng)桿菌為鮑曼不動(dòng)桿菌IB5，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2011年04月01日，保藏編號(hào)為CGMCCNo.4728。本發(fā)明鮑曼不動(dòng)桿菌IB5能夠高效降解甲氧咪草煙。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102250789SQ20111014502
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者劉麗萍, 劉春光, 張爽, 楊峰山, 楊鑫, 黃英澤 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)