專利名稱：：一種快速檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變點的熒光定量pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于動物獸藥殘留檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用熒光定量聚合酶鏈式法檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因變異的方法，具體檢測彎曲桿菌23SrDNA中的2074位和2075位的基因是否發(fā)生變異。
背景技術(shù)：
：彎曲菌病(Caw"/o6acfe7'M的是由彎曲菌屬(C"w/^/otocb)細菌感染引起的一系列疾病的總稱。彎曲桿菌有很多種，其中的空腸彎曲桿菌(C"附;7少/ok^"剛')和結(jié)腸彎曲桿菌(Ow^y/o^rferco//)均為革蘭氏陰性、高度可運動、微需氧性和嗜熱性細菌，現(xiàn)己被認為是世界各地人類急性細菌性腸炎的主要病原菌。有研究表明，在一些發(fā)達國家，空腸彎曲桿菌感染引起的腹瀉甚至超過沙門氏菌、志賀氏菌或者大腸埃希氏桿菌0157:H7引起的腹瀉的27倍。大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物被列為抗彎曲桿菌感染的首選藥物。然而，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物在獸醫(yī)臨床和人醫(yī)臨床的廣泛使用，其弓1起的細菌耐藥性問題也閂益呈現(xiàn)。雖然在美國、日本等國家，耐紅霉素彎曲桿菌的檢出率并不高(低于四環(huán)素類和氟喹諾酮類)，但是在大環(huán)內(nèi)酯類藥物使用較多的國家，如新西蘭和澳大利亞等，彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥問題較為嚴重。在我國，大環(huán)內(nèi)酯類藥物被廣泛用于動物臨床和人醫(yī)臨床，其所引發(fā)的耐藥彎曲桿菌問題不得不引起我們的憂慮。建立簡便快速、準確可靠的耐藥性監(jiān)測手段是控制彎曲桿菌耐藥性流行和傳播的關(guān)鍵。彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥機制主要是藥物作用靶位改變。據(jù)一項調(diào)査顯示在23株大環(huán)內(nèi)酯類耐藥彎曲桿菌中78%的耐藥菌株是由于其23SrDNAV區(qū)發(fā)生了A2075G(相當十5.co/fA2059G)的突變引起，13%的耐藥彎曲桿菌發(fā)生了A2074C的突變，雖然A2074G的突變也在耐大環(huán)內(nèi)酯類彎曲桿菌中被檢測出來，但是穩(wěn)定性實驗發(fā)現(xiàn)，這種耐藥因子是很不穩(wěn)定的。目甜，細菌耐藥性的檢測方法有很多。微生物學方法有紙片法、MIC法(常規(guī)方法+特殊判斷標準)，雙紙片協(xié)同試驗，三相試驗，E-test，自動化儀器等。生物化學方法主要是等電聚焦電泳。分子生物學方法主要有PCR方法、DNA探針和DNA序列分析等。分子生物學方法中聚合酶鏈式反應(PCR),聚合酶鏈式反應-特異性片斷長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)，聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)，PCR-線性探針分析(LiPA)，PCR-通用型異源雙倍體發(fā)生器分析(HDF)，生物芯片分析，自動DNA序列測定和實時熒光定量PCR(Real-timePCR)等常用于檢測耐藥基因的突變。目前已經(jīng)建立的檢測彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類突變的方法有限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(PCR-RFLP)，線性探針(LineProbeAssay,PCR-LIPA)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-timePCR)技術(shù)等。2003年，Vacher等(Vacher,S.,A.Menard,E.Bernard,andF.Megraud.2003.PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisfordetectionofpointmutationsassociatedwithmacrolideresistanceinCampylobacterspp.AntimicrobAgentsChemother47:1125-8.)建立rPCR-RFLP方法來檢測了30株臨床分離彎曲桿菌屬23SrDNA相關(guān)點突變。他們用S加IandB"Al兩種酶作為切割酶來切割PCR擴增片斷，根據(jù)切割片斷長度的多態(tài)性來鑒別兩種不同突變類型。然而，此種方法涉及PCR擴增，酶切、膠回收和染色等一系列程序，操作繁瑣，特異性較差。NiWa等(Niwa,H.,T.Chuma,K.Okamoto,andK.Itoh.2001.RapiddetectionofmutationsassociatedwithresistancetoerythromycininCampylobacterjejuni/colibyPCRandlineprobeassay,intJAntimicrobAgents18:359-64.)于2001年建立了PCR-LIPA法用于檢測31株彎曲桿菌(6株藥物誘導株，23株臨床分離株)對人環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變點，檢測結(jié)果與測序結(jié)果完全相符，準確性很高。2003年(Niwa，H.，T.Chuma,K.Okamoto，andK.Itoh.2003.SimultaneousdetectionofmutationsassociatedwithresistancetomacrolidesandquinolonesinCampylobacterjejuniandC.coliusingaPCR-lineprobeassay.IntJAntimicrobAgents22:374-9.)#>們又進一步優(yōu)化了這種方法，可以同時檢測彎曲桿菌對大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物的耐藥，即同時分析23SrDNA和gyrA上的突變點。然而這種方法中涉及到PCR擴增、線件探針膠條的制備和反向雜交等過程，對于操作的技術(shù)要求過高，并且反應過程中的影響因素太多，穩(wěn)定性較差，不夠方便快捷。2005年，Vacher(VacherS，MenardA，BernardE,SantosA,MegraudF.DetectionofmutationsassociatedwithmacrolideresistanceinthermophilicCampylobacterspp.byreal-timePCR.MicrobDrugResist.2005Spring;ll(l):40-7)等建立了一種實時熒光定量多聚酶鏈式反應(Real-timePCR)方法來檢測嗜熱彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變，他們是通過比較野生型和突變型基丙擴增產(chǎn)物的熔解曲線和Tm值的差異來判斷樣品屮細菌基因是否存在變異，因此難以擺脫DNA結(jié)合染料的通病，即檢測結(jié)果的判讀不夠直觀，必須和溶解曲線聯(lián)合分析，檢測的特異性和準確性都有待提高。熒光定量PCR實驗中，熒光標記的探針有優(yōu)于DNA結(jié)合染料的兩大特征，第一，它們可以特異性地監(jiān)測目標序列，防止非特異性產(chǎn)物的干擾而影響定量的準確性第二，它們可以用于多重反應。同時，它們克服了傳統(tǒng)測序技術(shù)技術(shù)耗時、實驗繁瑣、對序列進行專業(yè)比對等缺點。故熒光探針因為所具有的省時，簡便、特異性強等優(yōu)勢而作為突變分析的一種手段被廣泛使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服傳統(tǒng)檢測方法的缺陷，提供一種簡便、快速、準確率高的檢測空腸彎曲桿菌耐藥基因變異的方法，具體涉及一種用'災光定量聚合酶鏈式法檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因變異的方法。本發(fā)明利用實時熒光定量PCRTaqMan探針技術(shù)，依據(jù)空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥主要突變區(qū)23SrDNA基因中結(jié)構(gòu)域V區(qū)核酸序列，設(shè)計引物及探針檢測23SrDNA中A2074C和A2075G的基因突變。本發(fā)明利用Taq酶的5'—3'外切酶活性，在PCR反應系統(tǒng)中加入不同熒光(例如FAM，HEX)標記的三條探針，分別和同一基因的野生型和兩種突變型基因序列相對應，三條探針的5'端標以熒光發(fā)射基團FAM或HEX標記，靠近3'端標以熒光淬滅基團(TAMRA)。反應體系中的每種探針可以與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，野生型探針只與野生型基因序列雜交，兩種突變型探針可以分別與兩種對應的突變序列雜交，每種探針對應每種堿基序列。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發(fā)射基團的熒光發(fā)射。發(fā)射基團一旦與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，檢測波長處光密度增加而被熒光探測系統(tǒng)檢測到。復性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿著DNA模板移動，當移動到探針結(jié)合處切斷探針，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放，結(jié)果中被檢測到的熒光信號所標記的探針，對應于檢測區(qū)域的突變基因類型。本發(fā)明包括下述步驟a、根據(jù)空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥性相關(guān)突變位點的靶基因序列設(shè)計、合成一對引物，并通過PCR擴增大腸桿菌、沙門氏菌和糞腸球菌來考査弓I物的特異性；b、根據(jù)靶基因序列在引物之間設(shè)計、合成三個熒光探針，并且保證每條探針可以特異性檢測不同的變異基因(包括一種野生型和兩種突變型基因)；c、運用分子克隆和定點誘變方法人工構(gòu)建三種對照質(zhì)粒(見實施例2)。其中一個為野生型對照質(zhì)粒，另外兩個為突變型對照質(zhì)粒(分別為A2074C、A2075G兩種突變類型)；d、使用步驟a中的引物和步驟b中的熒光探針及其他聚合酶鏈式反應成分組成熒光聚合酶鏈式反應體系。優(yōu)化反應體系和反應條件，通過檢測步驟c中人工構(gòu)建的已知基因類型的三種對照質(zhì)粒，以考查所優(yōu)化的方法的特異性；e、從空腸彎曲桿菌細菌培養(yǎng)液中采用煮沸法(Niwa,H.,T.Chuma,K.Okamoto，andK.Itoh.2001.RapiddetectionofmutationsassociatedwithresistancetoerythromycininCampylobacterjejuni/colibyPCRandlineprobeassay.IntJAntimicrobAgents18:359-64)提取樣本細菌DNA(見實施例5)，加入歩驟d中的熒光聚合酶鏈式反應體系，在熒光定量PCR儀上進行擴增實驗；f、進行30-50個循環(huán)的熒光PCR反應，循環(huán)過程中讀取熒光值，將擴增產(chǎn)物的熒光信號與域值進行比較，判定與探針對應的突變情況。歩驟a中所述的兩個引物之間相距50-200個堿基，擴增的耙基因序列的長度為147bp。步驟b中所述的熒光探針為TaqMan探針，5'端以FAM或HEX標記，3，端以TAMRA標記。步驟a中所述的空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性相關(guān)突變位點的特異性基因的核苷酸序列為ACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG步驟a中所述的引物對的核苷酸序列為引物1:5'CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAG3'引物2:5，CCCACCTATCCT'GCACATTCTT3，。步驟b中所述的熒光探針的核苷酸序列為探針WT:FAM-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-TAMRA探針A2074C:HEX-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-TAMRA探針A2075G:HEX-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-TAMRA。步驟c中的三種對照質(zhì)粒包括一個野生型對照質(zhì)粒(命名為質(zhì)粒WT)，兩個突變型對照質(zhì)粒(分別命名為質(zhì)粒A2074C和質(zhì)粒A2075G)。其中野牛:型對照質(zhì)粒是釆用2074和2075位點為野生型的TA克隆重組質(zhì)粒(見實施例2),是將包含2074和2075位點的一段308bp的野生型基因序列通過PCR擴增、產(chǎn)物回收后，使用大連寶生物有限公司生產(chǎn)的TA克隆試劑盒連接到pMD18-T載體(試劑盒中自帶)中構(gòu)建而成的。另外，使用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的"定點誘變試劑盒"和上?；瞪锛夹g(shù)有限公司設(shè)計的突變引物(引物序列參見實施例2)，運用定點誘變試劑盒將野生型質(zhì)粒(質(zhì)粒WT)誘變成為含有2074和2075位點突變的重組質(zhì)粒(即分別命名的質(zhì)粒A2074C和質(zhì)粒A2075G)(見實施例2)。步驟d中的反應試劑使用大連寶生物有限公司生產(chǎn)的premixExTaqTM混合液。此混合液中已經(jīng)將DNA聚合酶、反應用Buffer、dNTPs等試劑預混在一起，是一種2x濃度的premixtype試劑。該混合液中的DNA聚合酶使用了改良后的熱啟動法用DNA聚合酶TaKaRaExTaqHS，與TaKaRa精心研制的RealTimePCR用buffer組合使用，可以有效抑制非特異性的PCR擴增，大大提高PCR的擴增效率，進行高靈敏度的實時熒光定量PCR擴增反應。本發(fā)明對各種影響反應特異性的因素進行了優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化的反應體系和反應條件具有更高的擴增效率，能快速準確檢測出特定位點基因突變情況。選取經(jīng)克隆測序確認的空腸彎曲桿菌樣本，用本發(fā)明進行檢測，準確率為100%，結(jié)果具有可重復性，穩(wěn)定性較好。本發(fā)明優(yōu)良效果如下本發(fā)明通過對彎曲桿菌23SrDNA基因比對，設(shè)計針對空腸彎曲桿菌(Qw^j;/o6ac/"的特異性擴增引物，可以特異性地將空腸彎曲桿菌屬與其他腸道細菌鑒別開來。本發(fā)明通過使用大連寶生物有限公司精心研制的premixExTaq混合液，有效抑制了非特異性的PCR擴增，提高了PCR的擴增效率。同時，本發(fā)明通過對引物和探針濃度、退火溫度等影響擴增和檢測特異性的因素進行優(yōu)化，解決了非特異性探針結(jié)合的問題，從而可以準確無誤的鑒別不同的耐藥突變基因型。另外，本發(fā)明可以在同一反應條件下，同時檢測位置相鄰的兩個突變點。本發(fā)明從抽提細菌DNA到報告整個過程只需2小時左右，比測序等其他檢測突變的方法操作簡便、準確快速。國外已經(jīng)建立的熒光定量PCR方法，是通過比較熔解曲線和Tm值差異來檢測和鑒別突變類型。本發(fā)明是使用特異性探針檢測耐藥突變，其檢測的特異性更強，靈敏度更卨，熒光信號的判讀更直觀和準確。圖1是本發(fā)明所設(shè)計的引物特異性考査結(jié)果。該圖是運用所設(shè)計的引物分別擴增幾種腸道細菌的PCR擴增后的瓊脂糖電泳圖，標記中的1號為空腸彎曲桿菌標準株ATCC33291(購自美國標準物保藏中心),2號為大腸桿菌ATCC25922(購自美國標準物保藏中心)，3號為糞腸球菌ATCC29212(購自美國標準物保藏中心)，4號為沙門氏菌C77431(購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)，圖中M為DL2000的DNAmarker。圖中只有1號菌擴增出147bp的片斷，表明所設(shè)計的引物特異性較好，可以很好的鑒別空腸彎曲桿菌與其他腸道優(yōu)勢菌群。圖2是三種標準對照質(zhì)粒的測序圖譜。其中圖2A為質(zhì)粒WT插入序列的測序圖譜。質(zhì)粒WT為野生型對照質(zhì)粒。圖2B為質(zhì)粒A2074C插入序列的測序圖譜。質(zhì)粒A2074C為發(fā)生了A2074C突變的誘變質(zhì)粒。圖2C為質(zhì)粒A2075G插入序列的測序圖譜。質(zhì)粒A2075G為發(fā)生了A2075G突變的誘變質(zhì)粒。對比以上三種對照質(zhì)粒的插入序列的測序結(jié)果可以確定三種質(zhì)粒的基因類型。這三種已知基因類型的質(zhì)粒可以作為標準對照質(zhì)粒用于考査本發(fā)明中所建方法的特異性。圖3是TaqMan熒光定量PCR檢測標準對照質(zhì)粒的特異性考査結(jié)果其中，圖3A顯示反應條件優(yōu)化以后，三條探針特異性檢測三種對照質(zhì)粒的總體結(jié)果。其中橫坐標代表循環(huán)數(shù)，縱坐標代表相對熒光強度，圖中平行且遠離橫坐標的直線代表熒光閾值。圖中顯示的二個熒光信號分別在圖B、C和D中逐一說明。圖3B-圖3D分別是三條探針檢測三種對照質(zhì)粒的結(jié)果。圖3B為野生型探針(探針WT)的特異性檢測結(jié)果。圖中只有野生型對照質(zhì)粒(質(zhì)粒WT)具有熒光信號，其他突變型對照質(zhì)粒則沒有熒光信號，表明野生型探針的檢測特異性較好。圖3C為突變型探針1(探針A2074C)的特異性檢測結(jié)果。圖中只有突變型對照質(zhì)粒A2074C具有熒光信號，而野生型對照質(zhì)粒和另外一個突變型對照質(zhì)粒則沒有熒光信號，表明突變型探針1的檢測特異性較好，可以鑒別A2074C的特征性突變。圖3D為突變型探針2(探針A2075G)的特異性檢測結(jié)果。圖中只有突變型對照質(zhì)粒A2075G具有熒光信號，而野生型對照質(zhì)粒和另外一個突變型對照質(zhì)粒則沒有熒光信號，表明突變型探針2的檢測特異性較好，可以鑒別A2075G的特征性突變。圖4是TaqMan熒光定量PCR檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變位點的結(jié)果其屮，圖4A為三條探針分別檢測空腸彎曲桿菌ATCC33291的結(jié)果，圖中只有野生型探針的熒光信號而沒有其他兩條探針的熒光信號，表明所檢測的細菌樣本為空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類敏感菌株，沒有發(fā)生相關(guān)的耐藥突變。此結(jié)果與測序結(jié)果相同。圖4B為三條探針分別檢測空腸彎曲桿菌耐藥株95064(法國彎曲桿菌和幽門螺旋桿菌研究中心惠贈)的結(jié)果，圖中只有突變型探針l(探針A2074C)的熒光信號而沒有其他兩條探針的熒光信號，表明所檢測的細菌樣本為空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變株，細菌發(fā)生了A2074C的突變。此結(jié)果與測序結(jié)果和文獻報道結(jié)果一致(耐藥株95064的文獻見Vacher,S.,A.Menard,E.Bernard,andF.Megraud.2003.PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisfordetectionofpointmutationsassociatedwithmacrolideresistanceinCampylobacterspp,AntimicrobAgentsChemother47:1125-8.)。圖4C為三條探針分別檢測細菌樣本3和樣本4的結(jié)果，圖中沒有任何探針的熒光信號，表明所檢測的為非彎曲桿菌屬的陰性樣本。此結(jié)果與細菌樣本鑒定結(jié)果一致，樣本3為大腸桿菌DH5ot，樣本4為大腸桿菌ATCC25922，其中大腸樸菌DH5a是對照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化載體。此結(jié)果表明我們所建立的檢測方法可以有效鑒別空腸彎曲桿菌和腸道優(yōu)勢齒大腸桿菌，p/以有效扣除大腸桿菌的基因背景，進一歩證實三條探針的檢測特異性。具體實施例方式實施例1、彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性相關(guān)靶基因序列的選擇、引物和探針設(shè)計與合成利用NCBI中的BLAST工具，比較空腸彎曲桿菌屬23SrDNA基因序列與其他腸道細菌序列差異。利用BeaconDesigner2.1(分子信標設(shè)計軟件2.1)設(shè)計一對引物，以特異性擴增空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性相關(guān)靶基因。其擴增耙基因長度為147bp,其基因序列與其他腸道細菌同源性不高，可以保證PCR反應特異性擴增空腸彎曲桿菌屬大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因。其中引物的特異性通過普通PCR擴增來考査。從圖1的結(jié)果看出，所設(shè)計的引物只能特異性擴增空腸彎曲桿菌菌株，而對于其他腸道優(yōu)勢菌群(大腸桿菌、腸球菌和沙門氏菌)呈陰性結(jié)果，該發(fā)明所設(shè)計的引物的特異性良好。在該發(fā)明所設(shè)計的上下游引物之間，我們設(shè)計了特異性探針分別與突變和野生位點結(jié)合。同時，我們運用BeaconDesigner2.1設(shè)計三條TaqMan探針，其中一條為野生型探針，另外兩條為突變型探針。其中突變型探針分別檢測靶基因序列中2074位和2075位的點突變。探針長度為1530個堿基，5'端以FAM或HEX標記，3'端以TAMRA標記。所有引物和探針由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。引物1:5，CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAG3'引物2:5'CCCACCTATCCTGCACATTCTT3，。探針WT:FAM-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-TAMRA探針A2074C:HEX-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-TAMRA探針A2075G:HEX-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-TAMRA實施例2、三種對照質(zhì)粒的構(gòu)建1.野生型對照質(zhì)粒(質(zhì)粒WT)的構(gòu)建參考AmeraGibreel(Gibreel，A.，andD.E.Taylor.2006.MacrolideresistanceinCampylobacterjejuniandCampylobactercoli.J.Antimicrob.Chemother.58:243—255.)—文，PCR擴增空腸彎曲桿菌標準菌株ATCC33291(購自美國標準物保藏中心)23SrDNAV區(qū)的一段308bp的核酸序列。所擴增的PCR產(chǎn)物膠回收以后，使用大連i生物有限公司生產(chǎn)的TA克隆試劑盒，按照該試劑盒說明書所介紹的方法，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(該載體為該試劑盒自帶)中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，從而構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測序，確定其插入序列為野生型序列，不含有2074和2075位點突變。2.突變型對照質(zhì)粒的構(gòu)建首先，通過上?；瞪锛夹g(shù)有限公司設(shè)計并合成定點誘變引物(序列如下所列出的A2074C誘變引物和A2075G誘變引物)，同時，購買上海賽百盛基因技術(shù)有限公司的定點誘變試劑盒，按照該試劑盒的說明書所介紹的的定點誘變的方法將野生型質(zhì)粒(命名為質(zhì)粒WT)誘變成為含有2074和2075位點突變的重組質(zhì)粒(質(zhì)粒A2074C和質(zhì)粒A2075G)。對重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物測序，確定突變質(zhì)粒A2074C含有A2074C的位點突變，突變質(zhì)粒A2075G含有A2075G的位點突變。其中A2074C誘變引物為2074-FP:CGCGGCAAGACGGCAAGACCCCGTGGAC;2074-RP:GTCCACGGGGTCTTGCCGTCTTGCCGCGA2075G誘變引物為2075-FP:CGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACC2075-RP:GGTCCACGGGGTCTCTCCGTCTTGCCGCG。三種質(zhì)粒插入序列的測序結(jié)果如下質(zhì)，T插入序列—，.|GGCAAACGATOTTGTCGGTTAATACCGACCTG'CATGAATG'GCG'TAACGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAM粒A2074C插:入序列GGGATCCAGTGAAATTGTAGTCGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGG^AGACCCCGTGGACC質(zhì)粒A2075G插入序列GGGATCCAGTGAAATTGTAGTCGAGGTCAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGG^AGACCCCGTGGACC實施例3、TaqMan熒光定量PCR反應體系和反應條件優(yōu)化T叫Man熒光定量PCR反應退火溫度的選擇為了降低非特異性擴增，冋時保證較高的擴增效率，我們結(jié)合引物和探針的Tm值，設(shè)定了58'C，62。C和64'C三個退火溫度。TaqMan熒光定量PCR反應中引物和探針比例的優(yōu)化為避免探針與模板非特異性結(jié)合，參考其他相關(guān)TaqMan熒光定量PCR反應中引物和探針的濃度設(shè)定，利用方陣設(shè)計原理，我們選定了三個比例10:3，5:3和5:l進行比較，以確定最佳引物和探針比例(見表l-4)。TaqMan熒光定量PCR反應體系為25|al，其中包括以下組成(見表l)。定量PCR擴增采用Bio-Rad(伯樂)公司IQTM5PCR擴增儀，程序為95。C3分鐘1循環(huán)；95'C10秒、58/62/64°C20秒，共計50個循環(huán)。反應過程中收集熒光信號。表1Taqman熒光定量PCR反應體系<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>25實施例4、TaqMan熒光定量PCR反應檢測特異性考査將通過人工構(gòu)建的三個對照質(zhì)粒作為特異性考查檢測對象，進行TaqMan熒光定量PCR反應。反應體系和反應條件組合如下表2:表2TaqMan熒光定l1:PCR反應體系和反應條件組合<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對于以上六種組合的特異性檢測結(jié)果列表如表3(表中的檢測值用Cr值表示)，CY值大于40的判定為陰性結(jié)果，用NA表示。根據(jù)表3屮的檢測結(jié)果，我們可以確定最佳TaqMan熒光定量PCR反應為組合5的反應體系和反應條件(退火溫度為62°C，引物和探針濃度比例為5:1)。然而在此最佳組合下，探針A2074C和探針A2075G的特異性還有待提高。故我們考慮加入二甲亞砜(DMSO)以提高引物和探針的特異性，并通過調(diào)節(jié)閾值來達到最佳的檢測效果。最終確定的對于不同的探針的反應條件和檢測結(jié)果見表4。從圖3(A-D圖)可以看出，幾條探針的特異性良好，野生型探針(探針WT)可以將野生型對照質(zhì)粒與其他兩種突變型質(zhì)粒鑒別開來，突變型探針1(探針A2074C)可以針對性檢測出A2074C的突變，突變型探針2(探針A2075G)可以特異性檢測出A2075G的突變。表3Taqman熒光定l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4T叫Man熒光定量PCR反應最佳反應條件的確定及特異性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例5、TaqMan熒光定量PCR檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變位點1.細菌DNA的提取復蘇細菌其菌株包括空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類敏感株ATCC33291，空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥株95064(該菌株由法國彎曲桿菌和幽門螺旋桿菌研究中心惠贈，文獻見Vacher,S.,A.Menard,E.Bernard,andF.Megraud.2003.PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisfordetectionofpointmutationsassociatedwithmacrolideresistanceinCampylobacterspp.AntimicrobAgentsChemother47:1125-8.)，大腸桿菌DH5a(對照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化載體菌)和大腸桿菌ATCC25922。取lml細菌菌懸液，6000rpm離心10分鐘，去上清，沉淀加入50-100ul滅菌雙蒸水，重懸細菌，混懸液在沸水中煮沸10分鐘，立即冰浴5-15分鐘，12000rpm離心2分鐘，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，作為模板DNA備用。2.熒光定量PCR反應采用優(yōu)化的反應體系和最佳的反應條件，進行熒光定量PCR反應，檢測所提取的細菌DAN樣本。3.熒光定量PCR結(jié)果分析圖4(A-C圖)顯示，對于空腸彎曲桿菌ATCC33291菌株的檢測，圖中只有一個野生型探針(探針WT)的熒光信號，而沒有任何相應突變型探針的信號；對于空腸彎曲桿菌耐藥菌株95064的檢測，圖中只有一個突變型探針(探針A2074C)的熒光信號，而沒有野生型和另外一個突變型探針(探針A2075G)的熒光信號。而對于另外兩株大腸桿菌則沒有任何熒光信號。表明探針的特異性良好，此方法可以很好的鑒別出空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的基因類型(野生型、A2074C突變型和A2075G突變型)權(quán)利要求1、一種快速檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥突變點的熒光定量PCR方法，其特征在于利用特異性TaqMan探針，同時檢測空腸彎曲桿菌23SrDNA中的2074位和2075位的基因突變，它包括下述步驟a、根據(jù)空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥突變位點的靶基因序列設(shè)計、合成引物和熒光探針；b、將引物、熒光探針與反應試劑配比、組合，構(gòu)成實時熒光定量PCR反應體系；c、優(yōu)化實時熒光定量PCR的反應條件，其中退火溫度為58℃至64℃；d、進行實時熒光定量PCR反應，鑒別人工構(gòu)建的野生型和突變型對照質(zhì)粒；e、進行實時熒光定量PCR反應，鑒別空腸彎曲桿菌耐藥相關(guān)基因的突變情況。其中步驟a中所述的空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯耐藥性突變位點的靶基因序列位于一對引物之間，序列長度為147bp，該基因的核苷酸序列如下CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAGAGGGATCCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAGCTTGACACTGCTACTTGGATAAGAATGTGCAGGATAGGTGGG；步驟a中所述的引物對的核苷酸序列如下引物15’CGAGATGGGAGCTGTCTCAAAG3’，引物25’CCCACCTATCCTGCACATTCTT3’；步驟a中所述的熒光探針為TaqMan探針，其探針5’端為FAM或HEX熒光基團標記，3’端標記熒光淬滅集團TAMRA，所述的熒光探針的序列為探針WT(FAM)-TCCACGGGGTCTTTCCGTCTTG-(TAMRA)，探針A2074C(HEX)-TCCACGGGGTCTTGCCGTCTT-(TAMRA)，探針A2075G(HEX)-TCCACGGGGTCTCTCCGTCTTG-(TAMRA)。2、按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，歩驟b中所述的熒光定量PCR反應體系采用大連寶生物有限公司的PremixExTaq試劑，該反應體系中所述的引物與探針的體積比為10:110:6;還包括在整個反應體系中添加12%體積的二甲亞砜。3、按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟c中所述的熒光定量PCR反應條件為94°C/95°C10秒~5分鐘1循環(huán)；94°C/95°C510秒、5864。C20秒，共計3050個循全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥相關(guān)基因突變的方法。本發(fā)明利用實時熒光定量PCRTaqMan探針技術(shù)，依據(jù)空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變區(qū)23SrDNA中V區(qū)的核酸序列，設(shè)計特異性的引物和探針，通過優(yōu)化TaqMan實時熒光定量PCR反應體系和反應條件，以準確檢測靶基因的相關(guān)耐藥突變點。本發(fā)明能夠快速準確地同時檢測出空腸彎曲桿菌大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的兩個主要突變位點，比目前已經(jīng)報道的相關(guān)分子生物學檢測方法具有更好的特異性和更高的靈敏度，比傳統(tǒng)的測序和藥敏實驗方法操作簡便、準確快速。本發(fā)明為耐大環(huán)內(nèi)酯類空腸彎曲桿菌分子流行病學監(jiān)測提供了有力的技術(shù)手段。文檔編號C12Q1/68GK101348831SQ20081004809公開日2009年1月21日申請日期2008年6月19日優(yōu)先權(quán)日2008年6月19日發(fā)明者彭大鵬,戴夢紅,旭王,王玉蓮,袁宗輝,郝海紅,郭文韜,陳冬梅,陶燕飛,魏亞靜,黃玲利申請人:華中農(nóng)業(yè)大學