鮑曼不動(dòng)桿菌鋅依賴寡肽a1s_1610蛋白及其制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_1610蛋白及其在制備鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗中的應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii)為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然界，屬于條件致病菌。廣泛存在于自然界的水及土壤、醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌?？剖曳植家訧CU最多，其次為呼吸內(nèi)科患者。感染的病人多是老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長(zhǎng)期使用廣譜抗生素治療的患者?？梢鸱窝?、燒傷感染、傷口感染、腦膜炎、尿路感染、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、關(guān)節(jié)炎等，并可進(jìn)一步發(fā)展為敗血癥。國(guó)內(nèi)資料表明，鮑曼不動(dòng)桿菌約占臨床分離的不動(dòng)桿菌的70%以上。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率已達(dá)63.0%~89.9%。對(duì)四種氨基糖苷類（阿米卡星、慶大酶素、奈替米星、妥布霉素）和環(huán)丙沙星的耐藥率達(dá)96.3%。我國(guó)目前的絕大多數(shù)菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、頭孢鮑曼不動(dòng)桿菌派酮/舒巴坦和多黏菌素B保持敏感，但在呼吸道感染的治療中效果較差。[0003]由于現(xiàn)有抗生素難以有效治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染，且鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染性疾病也變得日益復(fù)雜，近年來醫(yī)學(xué)界的相關(guān)的病原微生物研宄學(xué)習(xí)者也對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的預(yù)防和治療進(jìn)行了相關(guān)研宄。西班牙MichaelJ.McCnnell等人利用急性膿血癥小鼠模型對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌滅活全菌疫苗的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫兩個(gè)方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)；同時(shí)，MichaelJ.McCnnell等人在2011年對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白疫苗進(jìn)行了研宄，結(jié)果提示OMC可以刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ及活化Thl及Th2輔助B細(xì)胞分泌IgG抗體，均對(duì)小鼠具有良好的免疫保護(hù)性。但是由于全菌疫苗為傳統(tǒng)疫苗，其所含疫苗成分復(fù)雜，且具有一定的毒副作用，因此安全性不高。外膜復(fù)合物疫苗成分復(fù)雜，同時(shí)含有大量的內(nèi)毒素，對(duì)機(jī)體的毒副作用較大，因此研發(fā)一種質(zhì)量可控，安全有效的鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗是必然的趨勢(shì)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明提供一種鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_1610蛋白或其變體，所述A1S_1610蛋白具有如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列；優(yōu)選地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可在SEQIDN0:l、3或5中天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異（包括但不限于，置換，缺失和/或添加），而不影響A1S_1610的生物學(xué)特性。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"A1S_1610"意欲包括全長(zhǎng)A1S_1610蛋白、其成熟肽和其變體，包括SEQIDNO:1、3或5所示的多肽以及其天然或人工的變體，所述變體保留了A1S_1610的生物學(xué)特性，即，具有強(qiáng)免疫原性。并且，當(dāng)描述A1S_1610的序列片段時(shí)，其不僅包括SEQIDNO:1、3或5所示的多肽的序列片段，還包括該多肽的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。[0005]根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)在蛋白/多肽的背景中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"變體"是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與參照蛋白/多肽（例如，本發(fā)明的A1S_1610蛋白）的氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)（例如1-10個(gè)或1-5個(gè)或1-3個(gè)）氨基酸差異（例如，保守氨基酸置換），或者具有至少60%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或99%的同一性，并且其保留了參照蛋白/多肽的必要特性。在本發(fā)明中，蛋白/多肽（例如，本發(fā)明的A1S_1610蛋白）的必要特性可以指，具有強(qiáng)免疫原性。[0006]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"同一性"用于指兩個(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的某個(gè)位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(shí)（例如，兩個(gè)DNA分子的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被賴氨酸占據(jù)），那么各分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的"百分?jǐn)?shù)同一性"是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目XlOO的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60%的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性（總共6個(gè)位置中有3個(gè)位置匹配）。通常，在將兩個(gè)序列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過使用，例如，可通過計(jì)算機(jī)程序例如Align程序（DNAstar,Inc.)方便地進(jìn)行的Needleman等人（1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法來實(shí)現(xiàn)。還可使用已整合入ALIGN程序（版本2.0)的E.Meyers和W.MiIler(Comput.ApplBiosci.,4:11-17(1988))的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表(weightresiduetable)、12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分來測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一1性。此外，可使用已整合入GCG軟件包（可在www.gcg.com上獲得）的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重（gapweight)和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。[0007]如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"保守置換"意指不會(huì)不利地影響或改變包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物學(xué)活性的氨基酸置換。例如，可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變引入保守置換。保守氨基酸置換包括用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的置換，例如用在物理學(xué)上或功能上與相應(yīng)的氨基酸殘基相似（例如具有相似大小、形狀、電荷、化學(xué)性質(zhì)，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵的能力等）的殘基進(jìn)行的置換。已在本領(lǐng)域內(nèi)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈（例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸）、酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電荷的極性側(cè)鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、β分支側(cè)鏈（例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳香族側(cè)鏈（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基替代相應(yīng)的氨基酸殘基。鑒定氨基酸保守置換的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的（參見，例如，Brmiimell等人，Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA94:412_417(1997)，其通過引用并入本文）。[0008]根據(jù)本發(fā)明，AlS_1610蛋白與其他蛋白的連接可包括例如融合和綴合等。特別地，A1S_1610蛋白可通過接頭與其他蛋白連接。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"接頭"是指用于連接兩個(gè)分子（例如蛋白）的短肽。通常，通過將編碼該短肽的多核苷酸序列引入（例如，通過PCR擴(kuò)增或連接酶）分別編碼所要連接的兩種目的蛋白的2個(gè)DNA片段之間，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)來獲得融合蛋白，例如目的蛋白1-接頭-目的蛋白2。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，接頭包括但不限于柔性連接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3〇[0009]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"免疫原性（immunogenicity)"是指，能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞活化、增殖、分化，最終產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)如抗體和致敏淋巴細(xì)胞的特性，也指抗原刺激機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)能形成抗體或致敏T淋巴細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。[0010]在本發(fā)明中，氨基酸通常用本領(lǐng)域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。[0011]在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"具有相同的含義，可互換使用。[0012]本發(fā)明鑒于全長(zhǎng)A1S_1610蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽，其信號(hào)肽對(duì)應(yīng)1~31位的氨基酸序列，為了在最大限度上保持A1S_1610的結(jié)構(gòu)和功能不發(fā)生較大的變化，本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，其包含A1S_1610蛋白的成熟肽、其變體或其片段以及標(biāo)簽蛋白。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽蛋白為GST;優(yōu)選地，標(biāo)簽蛋白融合于A1S_1610蛋白的成熟狀的N端。上述融合蛋白經(jīng)酶切獲得A1S_1610重組蛋白；優(yōu)選地，當(dāng)標(biāo)簽蛋白為GST時(shí)，酶切所用酶為PreScissionprotease(PP酶），酶切獲得的A1S_1610重組蛋白在A1S_1610蛋白的成熟肽N端增加五個(gè)氨基酸殘基GPLGS。[0013]在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的A1S_1610蛋白、融合蛋白及其變體的多核苷酸以及含有該多核苷酸的載體。[0014]可用于插入目的多核苷酸的載體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。[0015]在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上述多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞包括但不限于，原核細(xì)胞例如大腸桿菌細(xì)胞，以及真核細(xì)胞例如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞（如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如小鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等）。本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可以是細(xì)胞系。[0016]本發(fā)明提供一種獲得A1S_1610重組蛋白的方法，其包含以下步驟：[0017](1)利用重組宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白；[0018](2)回收所述融合蛋白；[0019](3)對(duì)回收的融合蛋白進(jìn)行酶切，并從酶切產(chǎn)物中回收A1S_1610重組蛋白；[0020]優(yōu)選地，當(dāng)標(biāo)簽蛋白為GST時(shí)，酶切所用酶為PreScissionprotease(PP酶）。[0021]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，獲得本發(fā)明的A1S_1610重組蛋白的方法的步驟（1)還包括：[0022](i)根據(jù)編碼A1S_1610蛋白的核酸序列設(shè)計(jì)正向引物和反向引物；[0023](ii)使用步驟（i)設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物，通過PCR擴(kuò)增出編碼A1S_1610蛋白的基因片段；[0024](iii)將步驟（ii)所獲得的基因片段克隆至表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞；[0025](iv)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞表達(dá)A1S_1610融合蛋白。[0026]本發(fā)明優(yōu)選采用pGEX-6p_2質(zhì)粒來構(gòu)建重組原核細(xì)胞（例如大腸桿菌），表達(dá)A1S_1610融合蛋白，其主要特點(diǎn)是所表達(dá)的融合蛋白中的氨基端接有一個(gè)26kDa的GST標(biāo)簽，該標(biāo)簽可作為蛋白純化標(biāo)記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡(jiǎn)單、不需要變性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構(gòu)象和免疫原性。[0027]優(yōu)選地，本發(fā)明設(shè)計(jì)的正向引物和反向引物的核苷酸序列分別示于SEQIDNO.7和SEQID勵(lì).8，所使用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌乂當(dāng)前第1頁(yè)1 2