一株諾氟沙星降解乙酸鈣不動(dòng)桿菌nor-36及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物高科技技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株諾氟沙星降解乙酸鈣不動(dòng)桿菌NOR-36及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]獸用抗生素是指以亞治療劑量用于動(dòng)物飼料中，以保障動(dòng)物健康、或促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)與生產(chǎn)、提高飼料利用率的抗生素?？股乇旧韺?duì)人體是無(wú)害的，但如果過量使用將使病源細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致抗生素對(duì)其失效?？股氐倪^量使用使藥物耐藥性、畜產(chǎn)品藥物殘留等都成為了不可忽視的嚴(yán)重問題，尤其是破壞動(dòng)物的免疫機(jī)能。同時(shí)抗生素屬于難生物降解物質(zhì)，一旦造成抗生素污染，很容易在環(huán)境中富集，誘導(dǎo)耐藥菌株產(chǎn)生，對(duì)環(huán)境微生態(tài)造成嚴(yán)重的影響。
[0003]氟喹諾酮類藥物在我國(guó)畜牧水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已廣泛應(yīng)用，但在使用中發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮類藥物會(huì)產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，如皮膚過敏反應(yīng)及光敏反應(yīng)、軟骨毒性、循環(huán)系統(tǒng)反應(yīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)等，直接影響了畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。諾氟沙星是當(dāng)前廣泛應(yīng)用于臨床的第三代喹諾酮抗生素(氟喹諾酮類)的代表藥物之一。由于諾氟沙星的喹諾酮環(huán)的穩(wěn)定性和抗水解能力使其成為持久性污染物，目前已多次在水體中被檢測(cè)出來。微生物降解具有成本低、效率高、無(wú)二次污染、生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已在很多方面得到應(yīng)用，所以篩選出諾氟沙星降解菌對(duì)于處理諾氟沙星生產(chǎn)廢水具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，利用微生物的方法來降解廢水中的污染物，適用于現(xiàn)代廢水處理工藝，使廢水達(dá)標(biāo)排放，同時(shí)降低生產(chǎn)和使用成本。
[0005]本發(fā)明提供一種消除諾氟沙星殘留的降解菌，其菌株NOR-36是一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌，于2015年2月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCjfta:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所，郵編100101)，保藏編號(hào)CGMCC N0.10540，經(jīng)鑒定是乙酸1?不動(dòng)桿菌difle1Aacier.calcoacetIcus^a生物學(xué)特性為革蘭氏染色陰性，菌落光滑，短桿狀，接觸氧化酶陽(yáng)性，硝酸鹽還原酶陰性。本發(fā)明提供了甲基桿菌N0R-36在諾氟沙星降解中的應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)條件下使?jié)舛葹?00ug/L的諾氟沙星降解率達(dá)90%以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
[0006]本發(fā)明提供了含有所述乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36的菌劑。
[0007]本發(fā)明還提供了所述乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36生產(chǎn)菌劑的方法。
[0008]所述乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36生產(chǎn)菌劑的方法，包括:斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品，所述產(chǎn)品的包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑。
[0009]所述生產(chǎn)菌劑的方法，具體為: O將諾氟沙星殘留的乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36的試管種接種于添加哌嗪的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
2)將步驟I)培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即種子液；
3)將步驟2)所述種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同，發(fā)酵完成后的培養(yǎng)液即為菌劑；
4)步驟3)所述菌劑直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
[0010]步驟I)中所述的LB培養(yǎng)基配方為:NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L,哌嗪 5g/L，ρΗ7.0。
[0011]步驟2)所述的種子罐所用的培養(yǎng)基配方為:哌嗪5g/L，葡萄糖8g/L，(NH4)2S04 Ig/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，NaCl lg/L%，CaCO3 0.5g/L，酵母膏 2g/L，pH 值 7.2-7.5。
[0012]步驟2)所述種子罐和步驟3)所述的生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中，無(wú)菌空氣的通氣量為1:0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30_35°C，步驟2和3的整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
[0013]所述菌劑在諾氟沙星降解中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明所述的乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36能使水體中諾氟沙星的殘留量降低90%以上，降低諾氟沙星在環(huán)境中富集并影響環(huán)境微生態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)。所制備的菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)的污水處理廠尤其是畜禽養(yǎng)殖廢水處理廠大面積推廣使用。本發(fā)明是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工，對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，提高水環(huán)境質(zhì)量安全具有重要的意義。使用該降解菌劑可以在降低水中化學(xué)需氧量濃度、氨氮濃度以及總磷濃度等常規(guī)污染物的同時(shí)，降低出水中諾氟沙星濃度。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，降低廢水處理成本具有重要的意義。
【附圖說明】
[0015]圖1本發(fā)明所述的乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36的結(jié)晶紫染色照片；
圖2接種量對(duì)本發(fā)明所述的乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36降解效果的影響；
圖3 pH對(duì)本發(fā)明所述的乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36降解效果的影響；
圖4諾氟沙星降解菌效果驗(yàn)證。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0018]實(shí)施例1諾氟沙星降解乙酸鈣不動(dòng)桿菌N0R-36的篩選和分離
取從生產(chǎn)諾氟沙星的某農(nóng)藥廠生產(chǎn)車間的廢水處理池中得到的活性污泥3.0ml加入10ml諾氟沙星濃度為50mg/L的含有哌嗪的LB培養(yǎng)基中，其配方為:含5g/L哌嗪，NaCl10.00g/L,蛋白胨 10.00g/L,酵母粉 5.00g/L, pH 7.0，于 160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)，每隔7天按3%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。
[0019]取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml無(wú)菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的10—1的富集液加入9.0ml無(wú)菌水中，充分混勻配成10 _2的富集液，以此類推，對(duì)富集液進(jìn)行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于含諾氟沙星的濃度為500ug/L無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基(配方為:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20gMgS04X7H20、l.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4, 20.0Og 瓊脂，pH 7.0)上，30°C培養(yǎng)7 天。7 天后從以上的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上挑取單菌落，于3.0ml的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，LB液體培養(yǎng)基配方為:哌嗪5g/L，NaCl 10.00g/L,蛋白胨10.00g/L,酵母粉5.00g/L，pH7.0于8000r/min的條件下離心2min，倒去上清液，加入3.0ml的無(wú)菌水搖勾，仍于8000r/min的條件下離心2min，按此方法用無(wú)菌水洗兩遍后，加入3.0ml無(wú)菌水重懸該菌。吸取1.0ml該菌液加入10ml諾氟沙星濃度為500ug/L的哌嗪-無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(配方為:每升含500ug哌嗪，1.50g K2HP04、0.50g KH2PO4'0.20g MgSO4X 7H20、1.0Og NaCl,1.0Og (NH4)2SO4,20.0Og瓊脂，pH 7.0)，于160r/min，30°C條件下振蕩培養(yǎng)72h后，用高效液相色譜測(cè)其降解效果。將降解效率較高的一株菌株