專利名稱：半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及軍團菌檢測和分型方法的技術領域，具體為一種不僅能檢測軍團菌， 而且可以將軍團菌分為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌的快速檢測與分型方法。
背景技術：
軍團菌是一種兼性胞內寄生菌，在環(huán)境水源中分布甚廣，是引起人類軍團菌病的重要病原體。近年來，軍團菌病在世界各地時有爆發(fā)流行，被我國例入14種新發(fā)傳染病之一。該病由軍團菌感染引起，臨床類型分肺炎型與龐蒂阿克熱型，主要通過氣溶膠吸入呼吸道傳播。據國外報道，院內不明原因肺炎感染有10%是由軍團菌引起。目前已知軍團菌屬有52個種，70多個血清型。嗜肺軍團菌是其中之一，臨床上80%以上軍團菌感染是由該菌引起。因此，軍團菌屬及嗜肺軍團菌種的早期檢測對于軍團菌病臨床診斷具有重大價值。目前軍團菌的檢驗方法主要有軍團菌分離培養(yǎng)、血清抗體檢測、尿可溶性抗原檢測等。但直接分離培養(yǎng)，所需時間長達3-10天，陽性率低，培養(yǎng)基配置復雜，價格昂貴；尿抗原檢測僅對嗜肺軍團菌血清型1型具有特異性(嗜肺軍團菌共包括15個血清型)。由于軍團菌病與臨床上其他病原體引起的肺炎鑒別診斷困難，而治療方案又完全不同。因此，用分子生物學方法快速檢測軍團菌并對軍團菌進行分型具有很重要的現實意義。軍團菌分子分型檢測技術主要包括擴增片段長度多態(tài)性分析(AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性分析(RAPD)、脈沖場凝膠電泳分析(PFGE)、限制性酶切分析(Restriction analysis)、DNA測序分析和熒光定量PCR等。這些方法在很大程度上提高了軍團菌檢測的敏感性和特異性，但仍然存在各自的缺點，如DNA測序是最為準確的軍團菌種鑒定方法，但耗時較長，分析困難，不能適應臨床上的快速要求；熒光定量 PCR技術耗時短，操作方便，且污染小，但該法對儀器設備要求較高。

發(fā)明內容
本發(fā)明是對原有專利技術軍團菌快速檢測與分型方法的改進，建立了一種半巢式 PCR方法，提供了一種更敏感、更特異的軍團菌鑒定方法，將軍團菌分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌，并可直接用來檢測臨床標本和環(huán)境水樣中的軍團菌。為了實現以上目的，本發(fā)明是這樣實現的1. 一種半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌，首先，增加一對引物Leg 226F和Leg 2 ^ ；接著，以386bp擴增片段為模板，進行第二次PCR擴增，得226bp片段產物；最后，對226bp的PCR擴增產物作瓊脂糖凝膠電泳分析，選陽性者用i^stDigestTaa I核酸內切酶作酶切分型，觀察酶切分型結果。進一步地，所述酶切反應使用的限制性內切酶是識別位點為“ACNGT”的 FastDigest Taa I0再進一步地，利用軍團菌16S rRNA基因序列中386bp片段，設計兩對引物，通過半巢氏PCR和Taa I核酸內切酶酶切分析，將軍團菌分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌。一種半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌的應用，它可用于臨床痰液標本的軍團菌快速檢測與分型，也可用于環(huán)境水樣本的軍團菌快速檢測與分型，還可用于臨床標本如支氣管灌洗液的軍團菌快速檢測與分型。與現有技術相比，本發(fā)明半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌方法的有益效果是1、本發(fā)明第一次PCR反應是被國內外廣泛認可和使用的軍團菌檢測方法，是已被臨床和環(huán)境樣本證明的具有很好特異性的一種檢測方法，在此基礎上的第二次PCR擴增 (半巢式PCR)，增強了反應的敏感性和特異性；2、本發(fā)明通過建立半巢氏PCR反應，大大提高了檢測的敏感性；與常規(guī)PCR反應相比，該半巢氏PCR反應的敏感性提高約10-100倍，能檢測出約IOfg的軍團菌DNA，大大提高了檢測的敏感性和特異性；3、本發(fā)明使用限制性內切酶!^stDigest Taa I代替HpyCH4III，酶切反應時間由原來Ih縮短為5min ；4、本發(fā)明方法可直接用于臨床標本的檢測，經濟實用，解決了軍團菌含量較低的臨床標本檢測的難題?？傊景l(fā)明所描述的半巢式PCR-酶切分型檢測軍團菌的方法具有簡便、快速， 敏感性和特異性高，可直接用于臨床標本檢測，只需PCR儀和65°C水浴箱，4-5小時即可完成等優(yōu)點。


圖1 第一次PCR擴增軍團菌的16S rRNA 386bp基因片段電泳圖。圖2 第二次半巢氏PCR擴增軍團菌的226bp基因片段電泳圖。圖3 不同類型軍團菌各自的酶切分型電泳圖；圖3a 嗜肺軍團菌酶切分型電泳圖；圖北非嗜肺軍團菌中的菲氏軍團菌、昆氏軍團菌等酶切分型電泳圖；圖3c 其他類型非嗜肺軍團菌酶切分型電泳圖。圖4:不同類型軍團菌的酶切分型電泳圖(實例分析)。圖 4 中，M :100-bp DNA Marker,從上到下依次為 600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp、IOObp ；1，2，3，7，8，10和11 不同菌株酶切結果；4，戈氏軍團菌 L. gormanii (ATCC 33342)；5，橡樹嶺軍團菌 L. oakridgensis(ATCC 33761)；6，長灘軍團菌 L. Iongbeachae (ATCC 33462)；9，嗜肺軍團菌 L. pneumophila(ATCC33152)；12，菲氏軍團菌 L. feeleii(ATCC 35072)。
具體實施例方式本發(fā)明半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌方法是一個完整的整體。利用軍團菌16S rRNA基因序列中386bp片段和其中嗜肺軍團菌特有的核酸內切酶位點，設計兩對引物，通過半巢氏PCR和Taa I核酸內切酶酶切分析，可以將軍團菌分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌，如圖4所示。
本發(fā)明半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌方法，包括如下步驟(1)提取待檢標本的基因組DNA ；(2)以基因組DNA為模板，Leg 386F和Leg 386R引物(表1)，按表2反應體系及表3反應條件進行第一次PCR擴增，得386bp片段產物，如圖1 ；表1半巢式PCR引物序列
權利要求
1.一種半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌，其特征在于首先，增加一對引物Leg 226F和Leg 226R ；接著，以386bp擴增片段為模板，進行第二次PCR擴增，得226bp片段產物；最后，對226bp的PCR擴增產物作瓊脂糖凝膠電泳分析，選陽性者用i^stDigestTaa I 核酸內切酶作酶切分型，觀察酶切分型結果。
2.權利要求書1所述的半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌，其特征在于， 所述酶切反應使用的限制性內切酶是識別位點為“ACNGT” Wi^astDigest Taa I。
3.權利要求書2所述的半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌，其特征在于， 利用軍團菌16S rRNA基因序列中386bp片段，設計兩對引物，通過半巢氏PCR和Taa I核酸內切酶酶切分析，將軍團菌分型為嗜肺軍團菌與非嗜肺軍團菌。
4.一種如權利要求1至3任一項所述的半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌的應用，其特征在于，用于臨床痰液標本的軍團菌快速檢測與分型。
5.一種如權利要求1至3任一項所述的半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌的應用，其特征在于，用于環(huán)境水樣本的軍團菌快速檢測與分型。
6.一種如權利要求1至3任一項所述的半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌的應用，其特征在于，用于支氣管灌洗液的軍團菌快速檢測與分型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種半巢式聚合酶鏈反應酶切分型快速檢測軍團菌及其應用。檢測方法是首先，增加一對引物Leg 226F和Leg 226R；接著，以386bp擴增片段為模板，進行第二次PCR擴增，得226bp片段產物；最后，對226bp的PCR擴增產物作瓊脂糖凝膠電泳分析，選陽性者用FastDigestTaa I核酸內切酶作酶切分型，觀察酶切分型結果。該檢測方法可用于臨床痰液標本的軍團菌快速檢測與分型，也可用于環(huán)境水樣本的軍團菌快速檢測與分型，還可用于臨床標本如支氣管灌洗液的軍團菌快速檢測與分型。本發(fā)明半巢式PCR-酶切分型檢測軍團菌的方法具有簡便、快速，敏感性和特異性高，可直接用于臨床標本檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102337329SQ20111012621
公開日2012年2月1日 申請日期2011年5月13日 優(yōu)先權日2011年5月13日
發(fā)明者劉洋敏, 朱慶義, 胡朝暉, 詹曉勇, 趙利偉 申請人:廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司