本發(fā)明涉及DNA酶切技術(shù)領(lǐng)域，是一種用于將DNA酶切為單核苷的級聯(lián)酶反應(yīng)器。由兩支以上的DNA單一酶反應(yīng)器的串聯(lián)構(gòu)成，基因組DNA通過該反應(yīng)器可被酶解為單核苷，通過質(zhì)譜可以進(jìn)行DNA樣品中普通核苷和DNA加合物的定量、定性分析。

背景技術(shù)：

環(huán)境污染與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān)，污染物對人體的暴露可以引起DNA損傷和DNA的修飾，若不能及時(shí)修復(fù)，則可能引起基因突變，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。為了評價(jià)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，對DNA損傷產(chǎn)物和DNA加合物進(jìn)行鑒定顯得尤為重要。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)因?yàn)楦哽`敏度和準(zhǔn)確度是檢測DNA加合物的常用方法。檢測之前要將高分子量基因組DNA酶解為單核苷，這一步驟通常在溶液體系中進(jìn)行。而溶液體系下的酶解耗時(shí)長(＞12h)，酶的穩(wěn)定性差，酶解結(jié)束后還需要通過熱變性、超濾等操作將DNA水解酶去除。對于某些DNA氧化損傷產(chǎn)物如8-羥基脫氧鳥苷(8-oxodG)的檢測，繁瑣的樣品前處理過程極容易引起dG的氧化，干擾氧化損傷產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。因此，發(fā)展一種快速、便捷的酶解體系是DNA分析迫切需要解決的問題。

基于整體柱的固定化酶反應(yīng)器因?yàn)槊傅姆€(wěn)定性好，酶切效率高，酶與底物易分離已經(jīng)在蛋白組學(xué)得到了廣泛的應(yīng)用。Zhang等人采用戊二醛法將胰蛋白酶固定于有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱中，得到了高活性的酶反應(yīng)器，30s對蛋白序列的覆蓋率可達(dá)到92％。(Ma,J.F.；Liang,Z.；Zhang,Y.K.；Anal.Chem.2008,80(8),2949-2956.)隨著DNA酶反應(yīng)器的快速發(fā)展，DNA酶反應(yīng)器在寡聚核苷酸的鑒定方面也開始有了新嘗試。Zhao等將蛇毒磷酸二酯(SVP)酶固載于毛細(xì)管整體柱上，對寡聚核苷酸進(jìn)行酶解，并結(jié)合MALDI-TOF對寡聚核苷酸進(jìn)行分析，通過控制不同的酶解時(shí)間得到酶解的質(zhì)量“梯度”，實(shí)現(xiàn)對ssDNA及DNA加合物的序列測定。(Zhao,C.；Yin,R.C.；Yin,J.F.；Anal.Chem.2012,84(2),1157-1164.)Porebski等將脫氧核糖核酸酶(DNase I)鍵合于環(huán)氧基功能化的硅膠顆粒上制成填充酶反應(yīng)器柱，該酶反應(yīng)器與液相色譜聯(lián)用成功地用于在線檢測寡聚核苷酸的穩(wěn)定性。(Porebski,P.W.A.；Gyssels,E.；Madder,A.；J.Chromatogr.A 2015,1422,18-26.)基因組DNA的酶解過程涉及到包括脫氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶及堿性磷酸酶在內(nèi)的多種DNA水解酶，酶解體系復(fù)雜，目前還沒有一種DNA酶反應(yīng)器能夠?qū)⒒蚪MDNA酶解為單核苷。近年來，對于涉及多種酶參與的酶解過程，人們嘗試將這些酶混合固載于整體柱中制備多酶反應(yīng)器，例如Krenkova等人將胰蛋白酶和LysC蛋白內(nèi)切酶固定到poly(GMA-co-EDMA)整體柱上，這種酶反應(yīng)器打破了傳統(tǒng)胰蛋白酶反應(yīng)器對所分析蛋白分子量的限制，可以對高分子量(Mw>150 000Da)的蛋白如免疫球蛋白G進(jìn)行鑒定；(Krenkova,J.；Lacher,N.A.；Svec,F.；Anal.Chem.2009,81(5),2004-2012.)此外，也有研究考慮將多種單酶反應(yīng)器進(jìn)行串聯(lián)制備級聯(lián)酶反應(yīng)器，例如Yamaguchi等人將蛋白酶和磷酸酶反應(yīng)器串聯(lián)，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)和多肽的去磷酸化分析。(Yamaguchi,H.；Miyazaki,M.；Proteomics 2013,13(3-4),457-466.)本發(fā)明將DNA酶解體系常用的三種酶：脫氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶，堿性磷酸酶分別固載于整體柱中，制備得到相應(yīng)的單一酶反應(yīng)器；再將各單一酶反應(yīng)器按照一定的次序串聯(lián)，制備級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器。該級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器能夠?qū)⒒蚪MDNA快速酶解為單核苷。酶解產(chǎn)物可直接進(jìn)入LC-MS進(jìn)行目標(biāo)核苷產(chǎn)物的定性或定量分析，可減少樣品前處理過程(酶解，除酶)帶來的樣品污染。該發(fā)明適用于基因組DNA的酶解，結(jié)合LC-MS可進(jìn)行環(huán)境污染物暴露下的DNA加合物的分析。對研究環(huán)境污染與人類疾病發(fā)生的關(guān)系，評價(jià)癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是由兩支及兩支以上的單一酶反應(yīng)器串聯(lián)制備級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，基因組DNA通過該酶反應(yīng)器可被快速酶解為單核苷。

為了實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

DNA單一酶反應(yīng)器的制備：通過四甲氧基硅烷(TMOS)的原位聚合反應(yīng)制備得到具有多孔結(jié)構(gòu)的毛細(xì)管硅膠整體柱；再通過氨基硅烷化試劑(如3-氨基丙基三甲氧基硅烷)在整體柱表面引入氨基；最后由戊二醛與氨基的席夫堿反應(yīng)或碳二亞胺縮合法(NHS/EDC)將DNA水解酶(脫氧核糖核酸酶，磷酸二酯酶，堿性磷酸酶)鍵合于整體柱中。所制備的單一酶反應(yīng)器的長度為2-50cm，反應(yīng)器內(nèi)徑為25-200μm。

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器的制備：采用零死體積接頭將各單酶反應(yīng)器按照一定的次序進(jìn)行連接。

按照以上方法制備的級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器具有良好的通透性和機(jī)械性能，DNA樣品通過低壓注射泵或手推泵即可注入反應(yīng)器并快速酶解為單核苷。將級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解與LC-MS分析相結(jié)合可以進(jìn)行基因組DNA中目標(biāo)核苷產(chǎn)物的快速鑒定。

本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：

級聯(lián)酶反應(yīng)器具有良好的通透性和優(yōu)異的機(jī)械性能，酶解過程中反應(yīng)器柱的背壓低，酶解過程不會對反應(yīng)器的整體結(jié)構(gòu)造成影響；

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器可將基因組DNA酶解為單核苷，酶切效率可達(dá)99.0％以上；

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器用于基因組DNA的酶解速度快，酶切時(shí)間小于1小時(shí)；

制備的級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器穩(wěn)定性好，可重復(fù)使用(30次)和長期保存(2月以上)；

經(jīng)過級聯(lián)酶反應(yīng)器酶解后的樣品不用熱變性或超濾除酶，可直接進(jìn)入LC-MS進(jìn)行目標(biāo)核苷產(chǎn)物的定性或定量分析；

將級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解與質(zhì)譜分析相結(jié)合可以用于環(huán)境污染物暴露下的DNA加合物的鑒定。

附圖說明

圖1為所制備的級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器的實(shí)物圖；

圖2為基于毛細(xì)管硅膠整體柱的單一酶反應(yīng)器制備示意圖；

圖3為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS檢測dG色譜圖；

圖4為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS檢測dC色譜圖；

圖5為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA，LC-MS檢測dT色譜圖；

圖6為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解Fe²⁺/H₂O₂處理的小牛胸腺DNA，LC-MS檢測8-oxodG色譜圖；

圖7為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解TCBQ/H₂O₂處理的小牛胸腺DNA，LC-MS檢測8-oxodG色譜圖；

圖8為級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解HepG2細(xì)胞DNA，LC-MS檢測8-oxodG色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下提供本發(fā)明的級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器制備方法及應(yīng)用的具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

分別制備脫氧核糖核酸酶、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶固定化的DNA單一酶反應(yīng)器，再將這三種酶反應(yīng)器按照脫氧核糖核酸酶-磷酸二酯酶-堿性磷酸酶的順序串聯(lián)得到級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，實(shí)物如圖1。其中，脫氧核糖核酸酶在有Mg²⁺存在的情況下可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或寡脫氧核苷酸；磷酸二酯酶則可以從寡聚核苷酸的3’末端的羥基并釋放出5’-單核苷酸；而堿性磷酸酶可以將單核苷酸脫磷酸得到單核苷產(chǎn)物。單酶酶反應(yīng)器的制備方法如圖2，具體步驟如下：

1、毛細(xì)管硅膠整體柱的制備：截取的熔融石英毛細(xì)管若干，先用水和甲醇各沖30min，再用1M NaOH溶液沖洗活化3h，然后依次用去離子水沖洗30min，0.1M HCl沖洗1h，最后用去離子水再沖洗2h，活化好的毛細(xì)管在60℃下氮吹干。取PEG(Mw＝10000)0.44g，溶入0.01M 5mL乙酸，攪拌至溶解，再加入尿素0.45g，攪拌至溶解，冰浴下加入TMOS 2.1-2.2mL；高速攪拌30-40min，至均一無氣泡為止；攪拌后的均質(zhì)溶液經(jīng)過濾后注入毛細(xì)管中，封住兩端，在40℃水浴條件下反應(yīng)24h；逐步提高反應(yīng)溫度：即60℃保持1h，80℃保持1h，120℃保持3h。毛細(xì)管在330℃下老化24h，再用水、甲醇沖洗毛細(xì)管，氮吹干燥，得到的毛細(xì)管整體柱在4℃條件下保存。

2、毛細(xì)管整體柱的氨基硅烷化：配置1mL 5％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇-水溶液(即1mL溶液：900μL乙醇，100μL水和50μL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，并注入毛細(xì)管整體柱中室溫下(25℃)反應(yīng)2h，重復(fù)2次；反應(yīng)結(jié)束后用去離子水反復(fù)沖洗毛細(xì)管1h，60℃條件下氮吹，干燥后待用。

3、酶的固定化：配置20％的戊二醛磷酸緩沖溶液(25mM PBS緩沖溶液，pH＝6.9)，在4℃條件下，將戊二醛溶液緩慢注入毛細(xì)管內(nèi)，反應(yīng)2h，并重復(fù)2次；然后用PBS溶液沖洗20min。配置5mg/mL的脫氧核糖核酸酶(﹥500Kunitz U/mg)反應(yīng)溶液(25mM PBS緩沖溶液，pH＝6.9)，確保在低溫條件下，將脫氧核糖核酸酶溶液緩慢注入毛細(xì)管內(nèi)，反應(yīng)2h，重復(fù)2次；反應(yīng)結(jié)束后，用PBS緩沖溶液(pH＝6.9)沖洗30min；再通入2mg/mL NaCNBH₃溶液(25mM PBS緩沖溶液，pH＝6.9)反應(yīng)1h；制作完成的脫氧核糖核酸酶反應(yīng)器注入PBS(pH 6.9，0.02％NaN₃)，在4℃條件下保存待用。

同樣的，與脫氧核糖核酸酶反應(yīng)器制作方法相似，分別制備磷酸二酯酶酶反應(yīng)器和堿性磷酸酶反應(yīng)器。其中，配置的酶反應(yīng)溶液為：5mg/mL磷酸二酯酶(﹥0.01U/mg)反應(yīng)溶液(25mM PBS緩沖溶液，pH＝6.9)和5mg/mL的堿性磷酸酶(200U/mg)反應(yīng)溶液(25mM PBS緩沖溶液，pH＝6.9)。

4、級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器的制備：制備完成的DNA單一酶反應(yīng)器采用PEEK二通接頭(VICI，瑞士)按照脫氧核糖核酸酶-磷酸二酯酶-堿性磷酸酶的順序依次連接，得到級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器注入10mM Tris-HCl緩沖液(2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺，0.5％BSA，0.02％NaN₃)，在4℃條件下保存待用。

實(shí)施案例2

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA用于檢測脫氧鳥苷(dG)：將12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下分別酶切15，30，45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dG，檢測不同酶切時(shí)間下的色譜峰如圖3所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置：

(1)色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18column(2.1×100mm,1.8μm,Aglient)

(2)流動(dòng)相比例：等度分離，5.0％甲醇和95.0％水(0.1％甲酸)

(3)流速：0.3mL/min

(4)柱溫：30℃

(5)進(jìn)樣量：10μL

(6)質(zhì)譜條件：ESI電離方式；正離子化，多重監(jiān)測(MRM)模式，干燥氣流速9.0L/min；電噴霧電壓3500V；源溫度300℃；定量特征離子對：dG m/z 268.1→152.1(5eV)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，從15分鐘到45分鐘，通過級聯(lián)DNA酶反應(yīng)酶解得到的dG也在增加；酶解45分鐘時(shí)，小牛胸腺DNA酶切為單核苷釋放dG的效率達(dá)到了99.3±1.6％，說明制備的級聯(lián)酶反應(yīng)器具有很高的DNA酶切效率。

實(shí)施案例3

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA用于檢測dC:將12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下分別酶切15，30，45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dC，檢測不同酶切時(shí)間下的色譜峰如圖4所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置同實(shí)施案例2，定量特征離子對設(shè)為：dC m/z 228.1→112.1(5eV)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，從15分鐘到45分鐘，通過級聯(lián)DNA酶反應(yīng)酶解得到的dC的含量也隨之增加；酶解45分鐘時(shí)，小牛胸腺DNA酶切為單核苷釋放dC的效率達(dá)到了95.1±2.4％，說明制備的級聯(lián)酶反應(yīng)器具有很高的DNA酶切效率。

實(shí)施案例4

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解小牛胸腺DNA用于檢測dT:將12μL的200ng/μL小牛胸腺DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下分別酶切15，30，45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dC，檢測不同酶切時(shí)間下的色譜峰如圖5所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置同實(shí)施案例2，定量特征離子對設(shè)為：dT m/z 243.1→127.1(5eV)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著酶解時(shí)間的增加，從15分鐘到45分鐘，通過級聯(lián)DNA酶反應(yīng)酶解得到的dC也隨之增加；酶解45分鐘時(shí)，小牛胸腺DNA酶切為單核苷釋放dC的效率達(dá)到了103.7±0.8％，說明制備的級聯(lián)酶反應(yīng)器具有很高的DNA酶切效率。

實(shí)施案例5

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解Fe²⁺/H₂O₂處理的小牛胸腺DNA用于檢測8-oxodG：采用經(jīng)典的Fenton反應(yīng)處理小牛胸腺DNA，即10μM Fe²⁺和50μM H₂O₂于37℃與200ng/μL的小牛胸腺DNA孵育2小時(shí)，結(jié)束時(shí)加入1mM的甲磺酸去鐵銨終止反應(yīng)。將12μL的200ng/μL ct-DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下酶切45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dG，8-oxodG，檢測得到的色譜峰如圖6所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置：

(1)色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18column(2.1×100mm,1.8μm,Aglient)

(2)流動(dòng)相比例：等度分離，5.0％甲醇和95.0％水(0.1％乙酸)

(3)流速：0.3mL/min

(4)柱溫：30℃

(5)進(jìn)樣量：10μL

(6)質(zhì)譜條件：ESI電離方式；正離子化，多重監(jiān)測(MRM)模式，干燥氣流速9.0L/min；電噴霧電壓3500V；源溫度300℃；定量特征離子對：dG m/z 268.1→152.0(5eV)；[¹⁵N₅]-dG m/z 273.1→157.0(5eV)；8-oxodG m/z 284.1→168.0(5eV)；[¹⁵N₅]-8-oxodG m/z 289.1→173.0(5eV)。

通過LC-MS測得ct-DNA，H₂O₂以及Fe²⁺/H₂O₂處理的ct-DNA中8-oxodG的含量分別為：34.3±2.7，49.5±4.2，230.1±3.4個(gè)損傷/10⁶dG。而常規(guī)的溶液酶解體系測得值分別為：43.3±3.4，59.5±6.7，241.1±9.0個(gè)損傷/10⁶dG。說明級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器能夠?qū)⒒蚪MDNA有效地酶解為單核苷，并可能降低酶解等過程引起的dG的氧化及8-oxodG的干擾，這對8-oxodG準(zhǔn)確定量分析具有重要意義。

實(shí)施案例6

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解TCBQ/H₂O₂處理的小牛胸腺DNA用于檢測8-oxodG：采用10μM TCBQ和50μM H₂O₂于37℃與200ng/μL的小牛胸腺DNA孵育0.5小時(shí)，結(jié)束時(shí)加入1mM的甲磺酸去鐵銨終止反應(yīng)。將12μL的200ng/μL ct-DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下酶切45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dG，8-oxodG，檢測得到的色譜峰如圖7所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置同實(shí)施案例4。

通過LC-MS檢測得到TCBQ/H₂O₂處理的ct-DNA中8-oxodG的含量為982.6±30.1個(gè)損傷/10⁶dG。

實(shí)施案例7

級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器酶解HepG2細(xì)胞基因組DNA用于檢測8-oxodG：提取HepG2細(xì)胞的基因組DNA，將12μL的80ng/μL HepG2細(xì)胞基因組DNA通過低壓微量注射泵注入級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器，然后用10mM Tris-HCl(pH＝7.6，2mM Mg²⁺，2mM Ca²⁺)將酶解液沖出，室溫(25℃)條件下酶解45分鐘直至收集60μL的酶解樣品。采用LC-MS定量檢測酶切產(chǎn)物中的dG，8-oxodG檢測得到的色譜峰如圖8所示。

所用LC-MS的主要參數(shù)設(shè)置同實(shí)施案例4。

通過LC-MS檢測得到HepG2細(xì)胞中8-oxodG的含量為9.6±3.4個(gè)損傷/10⁶dG。

通過以上實(shí)例證明了本發(fā)明中所制備的級聯(lián)DNA酶反應(yīng)器能夠?qū)⒓?xì)胞基因組DNA的快速酶解為單核苷，結(jié)合LC-MS能夠進(jìn)行細(xì)胞基因組DNA中DNA加合物的快速定性、定量分析。該方法可以應(yīng)用于環(huán)境污染與DNA加合物的產(chǎn)生機(jī)理的相關(guān)研究。