本發(fā)明涉及液體或干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，該組合物包含添加的多肽/蛋白。
背景技術(shù)：
：通過(guò)凝乳性酶諸如凝乳酶和胃蛋白酶進(jìn)行的乳的酶法凝固是奶酪生產(chǎn)中最重要的過(guò)程之一。乳的酶法凝固是兩個(gè)階段的過(guò)程：第一階段中蛋白水解酶(凝乳酶或胃蛋白酶)攻擊κ-酪蛋白，導(dǎo)致酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)的亞穩(wěn)態(tài)，第二階段中乳隨后凝固并形成凝結(jié)物。凝乳酶(EC3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC3.4.23.1)，哺乳動(dòng)物胃中的凝乳性酶，是屬于一個(gè)廣義類的肽酶的天冬氨酸蛋白酶。毛霉凝乳酶(Mucorpepsin)(EC3.4.23.23)是一種來(lái)自真菌米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的凝乳性酶。商業(yè)相關(guān)的凝乳性酶產(chǎn)品常常是液體組合物，在本領(lǐng)域中描述了多種不同的方式以試圖穩(wěn)定產(chǎn)品中的凝乳性酶——例如以改善酶的存儲(chǔ)穩(wěn)定性或比活性。例如，EP2333056A1(DSM，申請(qǐng)日12.04.2007)描述了甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、丙酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、延胡索酸鹽或丙二醇可增高液體組合物/產(chǎn)品中天冬氨酸蛋白酶的穩(wěn)定性。WO2012/127005A1(DSM)描述了一種包含濃度為2-100g/kg無(wú)機(jī)鹽以及防腐劑的穩(wěn)定的液體凝乳酶組合物，所述防腐劑諸如甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、丙酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、苯甲酸鹽、山梨酸鹽或延胡索酸鹽、乙二醇、丙二醇、甘油、赤蘚糖醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇或半乳糖醇。所述凝乳酶組合物的最高強(qiáng)度為1500IMCU/ml(參見(jiàn)例如第6頁(yè)第1-3行)。聚乙二醇(PEG)是環(huán)氧乙烷的聚合物–其也可稱為聚氧乙烯(POE)。分子量在寬范圍諸如從300g/mol至10000000g/mol內(nèi)的PEG是可商購(gòu)的。DE1492060A1(Nordmark-WerkeGmbH，1969年公開(kāi))公開(kāi)了一種通過(guò)添加濃度為1-20wt％(對(duì)應(yīng)于10000-200000ppm)的具有400-6000分子量的聚乙二醇(PEG)來(lái)制備胃蛋白酶組合物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明待解決的一個(gè)問(wèn)題是提供一種新型的凝乳天冬氨酸蛋白酶(例如，凝乳酶)組合物，其中天冬氨酸蛋白酶具有增高的物理穩(wěn)定性和/或比活性。解決方案是基于本發(fā)明的發(fā)明人已鑒定出，通過(guò)向不同的天冬氨酸蛋白酶(例如，凝乳酶)中添加合適的多肽/蛋白制劑，顯著改善所述酶組合物的物理穩(wěn)定性和比活性。工業(yè)酶的液體制劑在例如運(yùn)輸過(guò)程中經(jīng)受物理作用力(諸如搖動(dòng))，酶組合物的物理穩(wěn)定性可通過(guò)反復(fù)搖動(dòng)(例如，通過(guò)顛倒)具有高的頂部空間與樣品體積比的測(cè)試試管中的樣品來(lái)檢測(cè)。如本文工作實(shí)施例中所討論的，向例如駱駝凝乳酶(M,Chr.HansenA/S)中添加多種不同的多肽/蛋白制劑，這些多肽/蛋白制劑中的一些顯著增高了駱駝凝乳酶的物理穩(wěn)定性。如本文工作實(shí)施例中所討論的，向牛凝乳酶(Chr.HansenA/S)、駱駝凝乳酶(M,Chr.HansenA/S)和毛霉凝乳酶(Chr.HansenA/S)中添加多種不同的多肽/蛋白制劑，這些多肽/蛋白制劑中的一些顯著增高了酶組合物的比活性。對(duì)于牛凝乳酶和駱駝凝乳酶比活性的增高是最顯著的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的，凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的比活性涉及活性/每組合物中的凝乳天冬氨酸蛋白酶蛋白的總量IMCU。如本文工作實(shí)施例中所描述的，向純化的凝乳酶樣品中添加例如乳清蛋白制劑產(chǎn)生具有顯著更高的IMCU/ml強(qiáng)度的酶組合物——即具有更高比活性的組合物。例如，添加0,5％(w/w)乳清蛋白濃縮物制劑WPC80使駱駝凝乳酶組合物本身的強(qiáng)度增高約10％。不受理論的限制，對(duì)本發(fā)明人而言感到意外是通過(guò)簡(jiǎn)單地添加合適量的例如乳清蛋白就可能增高例如凝乳酶組合物/產(chǎn)品的強(qiáng)度。本文相關(guān)的是注意到，酪蛋白水解物未顯著增高物理穩(wěn)定性和/或比活性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的——在酪蛋白水解物中已經(jīng)進(jìn)行了酪蛋白的水解。不受理論的限制——據(jù)信在這種酪蛋白水解物制劑中，大量的多肽是少于10個(gè)氨基酸的。換句話說(shuō)并且不受理論的限制——據(jù)信當(dāng)使用長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽時(shí)獲得本文有關(guān)的增高的物理穩(wěn)定性和比活性效果。如本領(lǐng)域所知的——術(shù)語(yǔ)肽可以在大小的基礎(chǔ)上區(qū)別于術(shù)語(yǔ)蛋白，肽(以任意基準(zhǔn))可以理解為大約50個(gè)或更少的氨基酸。換句話說(shuō)，長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的多肽在本領(lǐng)域通常被理解為是蛋白。因此，長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的多肽在本文中或者可以被稱為蛋白。如本文工作實(shí)施例中所討論的，本發(fā)明有關(guān)的增高的/改善的物理穩(wěn)定性和/或比活性效果與向凝乳酶中添加的多肽/蛋白組合物的量有關(guān)——其中如果添加小于0.01％(w/w)，未獲得顯著的積極效果。不受理論的限制——據(jù)信添加多肽/蛋白為凝乳酶提供了增高的構(gòu)象穩(wěn)定性，并且這可以解釋在本文工作實(shí)施例中觀察到的增高的物理穩(wěn)定性和增高的比活性。不受理論的限制——據(jù)信現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有描述或暗示添加多肽/蛋白可增高天冬氨酸蛋白酶凝乳性酶諸如，例如，凝乳酶的穩(wěn)定性——具體而言，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有描述可增高構(gòu)象穩(wěn)定性。酶的構(gòu)象穩(wěn)定性示于本文的圖3。如本領(lǐng)域所知的——構(gòu)象的喪失等同于酶活性的喪失——即酶的比活性更小。不受理論的限制——構(gòu)象喪失可增高酶的變性/沉淀并因此產(chǎn)生更小的如本文所討論的物理穩(wěn)定性。如本領(lǐng)域所知的——多種凝乳天冬氨酸蛋白酶可看作結(jié)構(gòu)上相對(duì)地類似。如本領(lǐng)域所知的——從不同的哺乳動(dòng)物或真菌物種(諸如例如，牛、駱駝、綿羊、豬或毛霉菌)獲得的不同的天然野生型凝乳天冬氨酸蛋白酶多肽序列具有相對(duì)高的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性。本文圖4中提供了與本文相關(guān)的來(lái)自不同哺乳動(dòng)物物種(奶牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝和豬)的不同凝乳性凝乳酶序列的比對(duì)——如圖4中可看出，它們具有密切的序列關(guān)系并且已知具有非常高的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性。本文圖5中提供了與本文相關(guān)的商購(gòu)的來(lái)自不同哺乳動(dòng)物或真菌物種的不同凝乳性凝乳酶序列(駱駝凝乳酶、牛凝乳酶、牛胃蛋白酶、真菌的毛霉凝乳酶和真菌的內(nèi)座殼凝乳酶(Endothiapepsin))的比對(duì)?？梢哉f(shuō)圖5的這5個(gè)不同的序列不是高度一致的——但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，已知這5個(gè)不同的凝乳天冬氨酸蛋白酶都具有高三級(jí)序列相似性。如上文所述并且如本文工作實(shí)施例中所顯示的，對(duì)于牛凝乳酶、駱駝凝乳酶和毛霉凝乳酶已經(jīng)證明了與本文相關(guān)的改善的/增高的穩(wěn)定性/活性效果。不受理論的限制——據(jù)信，沒(méi)有明顯的技術(shù)方面的理由認(rèn)為與本文相關(guān)的改善/增高的穩(wěn)定性效果一般與凝乳天冬氨酸蛋白酶不相關(guān)——如上文所述，已知這些酶具有高度的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性，并且如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的，這種三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性使得以下論述看起來(lái)是合理的：即，本文描述的聚合物-酶相互作用以獲得改善的穩(wěn)定性是與本文相關(guān)的結(jié)構(gòu)相似的凝乳天冬氨酸蛋白酶的一般類作用。因此，本發(fā)明第一方面涉及一種用于制備液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的方法，其中該方法包括以下步驟：(a)：獲得純化的液體凝乳天冬氨酸蛋白酶樣品，該樣品包括：(i)：25IMCU/g樣品-30000IMCU/g樣品的強(qiáng)度；和(ii)：其中，所述純化的樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少70％是凝乳天冬氨酸蛋白酶；以及(b)：向步驟(a)的樣品中添加合適量的多肽制劑，以獲得液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，所述多肽制劑包含長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽，其中所述多肽不是凝乳天冬氨酸蛋白酶也不是降解天冬氨酸蛋白酶的酶，其中所述組合物包含：(I)：強(qiáng)度為26IMCU/g所述組合物-30100IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶；和(II)：濃度是所述組合物的0.01％-10％(w/w)的步驟(b)添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽；并且其中，在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)至少比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g樣品)高1％。檢測(cè)(i)和(II)中的凝乳天冬氨酸蛋白酶強(qiáng)度并從而確定(II)中更高的強(qiáng)度的要求是否得到滿足是常規(guī)的工作。在本發(fā)明上下文中，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言很明顯的是，用于檢測(cè)存儲(chǔ)一周后(i)中的強(qiáng)度的對(duì)照樣品是步驟(a)中的樣品(即，沒(méi)有步驟(b)中添加的多肽制劑)。如本文討論的，本發(fā)明人測(cè)試了多種多肽/蛋白制劑(參見(jiàn)本文的工作實(shí)施例)，其中一些顯著增高了酶組合物的比活性。因此，基于本文的教導(dǎo)和本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般常識(shí)——本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)多的負(fù)擔(dān)可以確定在步驟(b)中添加的合適量的合適的優(yōu)選蛋白制劑以獲得第一方面的所述方法的所需的增高的/更高的強(qiáng)度。本發(fā)明上下文中，很明顯，第一方面的方法的步驟(b)中，優(yōu)選不添加降解天冬氨酸蛋白酶的酶，步驟(b)中的術(shù)語(yǔ)“不是降解天冬氨酸蛋白酶的酶”應(yīng)據(jù)此理解。第(II)項(xiàng)中的濃度是關(guān)于組合物本身的。例如，如果組合物本身的重量是1kg，第(II)項(xiàng)的步驟(b)中添加的多肽的濃度是1％(w/w)，則步驟(b)中添加了10g長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在步驟(b)中添加合適量的多肽制劑以獲得根據(jù)第一方面第(II)項(xiàng)的添加的多肽的所需濃度是常規(guī)工作。本文圖1中顯示了牛凝乳酶(Chr.HansenA/S)和毛霉凝乳酶(Chr.HansenA/S)的不同樣品的SDS-PAGE數(shù)據(jù)。和都是泳道2(命名為“Feed”)，基本上取自發(fā)酵液的未純化樣品，泳道3是純化的樣品?？梢钥闯觥兓臉悠吩诘谝环矫娴牡?ii)項(xiàng)的范圍內(nèi)——即，它們是其中具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少70％是凝乳天冬氨酸蛋白酶的樣品。未純化的樣品不在第一方面的第(ii)項(xiàng)的范圍內(nèi)。SDS-PAGE是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)——即，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，確定目的純化的凝乳天冬氨酸蛋白酶樣品是否是第一方面的第(ii)項(xiàng)范圍內(nèi)的樣品是常規(guī)工作。從本文圖1中可看出，對(duì)于例如在泳道3的純化樣品中的在34-38kDa的遷移范圍內(nèi)有兩個(gè)條帶。不受理論的限制——據(jù)信這兩個(gè)條帶代表的兩種不同的糖基化形式。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的——這兩種不同的糖基化形式都是凝乳天冬氨酸蛋白酶，因?yàn)樗鼈兌加心樾悦富钚?。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的——第(i)項(xiàng)中的術(shù)語(yǔ)“IMCU/g所述樣品”涉及每克樣品本身的IMCU酶活性。類似的——第(I)項(xiàng)中的術(shù)語(yǔ)“IMCU/g所述組合物”涉及每克組合物本身的IMCU酶活性。可優(yōu)選的是第一方面的液體組合物具有10g-10000kg的總重量。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的——重量為1kg的本文相關(guān)的第一方面的液體組合物大約具有1升的體積。本發(fā)明第二方面涉及一種液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其可通過(guò)所述第一方面的方法或者其任何與本文相關(guān)的實(shí)施方式來(lái)獲得。本文第一方面和第二方面涉及液體組合物——然而，凝乳天冬氨酸蛋白酶(例如，凝乳酶)也可作為干燥的粒狀組合物/產(chǎn)品進(jìn)行商業(yè)化。因此，本發(fā)明第三方面涉及一種用于制備干燥的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟：(1)：首先根據(jù)所述第一方面的方法或者其任何與本文相關(guān)的實(shí)施方式制備液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物；(2)：使步驟(1)的液體組合物干燥并?；垣@得干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物。在本發(fā)明上下文中干燥步驟(2)可以看作對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)常規(guī)的步驟——因此本文無(wú)需對(duì)該步驟本身進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明第四方面涉及干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其可通過(guò)所述第三方面的方法或者其任何與本文相關(guān)的實(shí)施方式來(lái)獲得。本發(fā)明第五方面涉及液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包含：(I)：強(qiáng)度為25IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶；(II)：濃度為所述組合物的0.01％-10％(w/w)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸且不是凝乳天冬氨酸蛋白酶的多肽；以及(III)：濃度為1-350g/kg的鹽，并且其中所述組合物的pH為2-8；以及(x)：其中第(II)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠、牛血清白蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、馬鈴薯蛋白、大麻蛋白、稻蛋白、螺旋藻蛋白、小麥蛋白、花生蛋白、向日葵蛋白、油菜籽蛋白、血蛋白和藻類蛋白。在本發(fā)明上下文中——本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道或者可常規(guī)地確定(例如，基于具體相關(guān)的氨基酸序列)第(x)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的來(lái)源。如本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明上下文中所理解的——與第(III)項(xiàng)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“g/kg”涉及每kg所述組合物本身的鹽的克數(shù)。本發(fā)明第六方面涉及干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包含：(I)：強(qiáng)度為25IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶；(II)：濃度為所述組合物的0.01％-10％(w/w)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸且不是凝乳天冬氨酸蛋白酶的多肽；以及(III)：鹽，并且其中懸浮于水中的所述組合物的pH為2-8；以及(x)：其中第(II)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠、牛血清白蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、馬鈴薯蛋白、大麻蛋白、稻蛋白、螺旋藻蛋白、小麥蛋白、花生蛋白、向日葵蛋白、油菜籽蛋白、血蛋白和藻類蛋白。本發(fā)明第七方面涉及液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包括強(qiáng)度為1600IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶以及濃度為1-350g/kg的鹽，且其中所述組合物的pH為2-8。本發(fā)明第八方面涉及干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包括強(qiáng)度為1600IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶以及鹽，且其中懸浮于水中的所述組合物的pH為2-8。本文所述的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物可根據(jù)本領(lǐng)域用于——例如，制備目的食品或飼料產(chǎn)品(諸如例如，基于乳的目的產(chǎn)品，例如可以是奶酪產(chǎn)品)。因此，本發(fā)明第九方面涉及一種用于制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，包括向食品或飼料成分中添加有效量的第五至第八方面的任一或其與本文相關(guān)的實(shí)施方式的任一的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，并進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟以獲得食品或飼料產(chǎn)品。定義本文相關(guān)的術(shù)語(yǔ)的所有定義均與本領(lǐng)域技術(shù)人員相對(duì)于本文相關(guān)的技術(shù)上下文所理解的一致。術(shù)語(yǔ)“凝乳性酶”指具有凝乳性酶活性的酶，即活性的凝乳性酶。凝乳活性可以用國(guó)際凝乳單位(IMCU)/ml或IMCU/g表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定本文相關(guān)的凝乳性酶活性。本文的工作實(shí)施例1中提供了確定凝乳性酶活性和凝乳性酶比活性的標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)例。如本領(lǐng)域所知的——通過(guò)凝結(jié)活性(IMCU/ml)除以總蛋白含量(mg總蛋白/ml)來(lái)確定凝結(jié)比活性(IMCU/mg總蛋白)。術(shù)語(yǔ)“序列一致性”涉及兩個(gè)氨基酸序列之間的相關(guān)性。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)本領(lǐng)域確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性程度，并且優(yōu)選使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)，如在EMBOSS軟件包(EMBOSS：TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite，Rice等人，2000，TrendsGenet.16：276-277)的Needle程序(優(yōu)選3.0.0或更高版本)中實(shí)施的。所使用的任選參數(shù)是空位開(kāi)放罰分為10，空位延伸罰分為0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)置換矩陣。標(biāo)簽為“最長(zhǎng)一致性”(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)的Needle輸出作為百分比一致性，并按如下計(jì)算：(相同殘基×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))。術(shù)語(yǔ)“變體”指具有凝乳性酶活性的肽，其包含在一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))位置上的改變，即取代、插入和/或缺失。取代是指用不同的氨基酸取代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)某位置的氨基酸；插入是指添加與占據(jù)某位置的氨基酸相鄰的1-3個(gè)氨基酸。氨基酸可以是天然或非天然氨基酸——例如，用例如D-丙氨酸的特別的D-異構(gòu)體(或D-形式)的取代在理論上是可能的。本發(fā)明的實(shí)施方式描述于下文，僅作為示例的方式。附圖說(shuō)明圖1：本文圖1中顯示了牛凝乳酶(Chr.HansenA/S)和毛霉凝乳酶(Chr.HansenA/S)的不同樣品的SDS-PAGE數(shù)據(jù)。和都是泳道2(名為“Feed”)，基本上取自發(fā)酵液的未純化樣品，泳道3是純化的樣品。圖2：顯示了用于確定與本文相關(guān)的物理穩(wěn)定性的如本文討論的顛倒實(shí)驗(yàn)的一些結(jié)果。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)本文的工作實(shí)施例。圖3：說(shuō)明了酶的構(gòu)象穩(wěn)定性。圖4：來(lái)自不同哺乳動(dòng)物物種(牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝和豬)的與本文相關(guān)的不同凝乳性凝乳酶序列的比對(duì)。圖4的所有序列都是公眾可獲得的。圖5：與本文相關(guān)的可通過(guò)商業(yè)途徑獲得的來(lái)自不同的哺乳動(dòng)物或真菌物種的不同凝乳天冬氨酸蛋白酶序列(駱駝凝乳酶、牛凝乳酶、牛胃蛋白酶、真菌的毛霉凝乳酶和真菌的內(nèi)座殼凝乳酶)的比對(duì)。圖5的所有序列都是公眾可獲得的。發(fā)明詳述凝乳天冬氨酸蛋白酶下文對(duì)與本文相關(guān)的凝乳天冬氨酸蛋白酶的具體實(shí)施方式/實(shí)施例的討論與對(duì)本文討論的發(fā)明的所有方面都是相關(guān)的。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是選自由如下組成的組的凝乳性酶：凝乳酶(EC3.4.23.4)、胃蛋白酶(EC3.4.23.1)和毛霉凝乳酶(EC3.4.23.23)。如本文工作實(shí)施例中所討論的，對(duì)于牛凝乳酶組合物和駱駝凝乳酶組合物，與本文相關(guān)的比活性和強(qiáng)度的增高最顯著。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是凝乳酶(EC3.4.23.4)。優(yōu)選的凝乳天冬氨酸蛋白酶是例如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中所述的單峰駱駝(Cameliusdromedarius)凝乳酶。本文或可稱為駱駝凝乳酶，公眾所知的成熟多肽氨基酸序列示于本文圖5中。如本領(lǐng)域所知的——對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，制備目的酶的變體(即，氨基酸修飾)且不顯著改變酶的特性是常規(guī)工作。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是包含本文圖5所示的多肽氨基酸序列(稱為“Camel_chymosin”)的單峰駱駝凝乳酶或單峰駱駝凝乳酶的變體，其中所述變體包含與本文圖5所示的駱駝凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90％(優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％)序列一致性的多肽序列。優(yōu)選的凝乳天冬氨酸蛋白酶是牛凝乳酶。本文或稱為奶牛凝乳酶，公眾所知的成熟多肽氨基酸序列示于本文圖5中。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是包含本文圖5所示的多肽氨基酸序列(稱為“Cow_chymosin”)的牛凝乳酶或牛凝乳酶的變體，其中所述變體包含與本文圖5所示的牛凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90％(優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％)序列一致性的多肽序列。優(yōu)選的凝乳天冬氨酸蛋白酶是牛胃蛋白酶.本文或稱為奶牛胃蛋白酶，公眾所知的成熟多肽氨基酸序列示于本文圖5中。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是包含本文圖5所示的多肽氨基酸序列的牛胃蛋白酶(稱為“Cow_pepsin”)或牛胃蛋白酶的變體，其中所述變體包含與本文圖5所示的牛胃蛋白酶多肽氨基酸序列具有至少90％(優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％)序列一致性的多肽序列。優(yōu)選的凝乳天冬氨酸蛋白酶是毛霉凝乳酶(參見(jiàn)例如，EP0805866B1(Harboeetal,Chr.HansenA/S,Denmark))。公眾所知的成熟多肽氨基酸序列示于本文圖5中。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是包含本文圖5所示的多肽氨基酸序列(稱為“Mucor”)的毛霉凝乳酶或毛霉凝乳酶的變體，其中所述變體包含與本文圖5所示的毛霉凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90％(優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％)序列一致性的多肽序列。優(yōu)選的凝乳天冬氨酸蛋白酶是內(nèi)座殼凝乳酶。公眾所知的成熟多肽氨基酸序列示于本文圖5中。因此，在一優(yōu)選實(shí)施方式中，凝乳天冬氨酸蛋白酶是包含本文圖5所示的多肽氨基酸序列(稱為“Endothia”)的內(nèi)座殼凝乳酶或內(nèi)座殼凝乳酶的變體，其中所述變體包含與本文圖5所示的內(nèi)座殼凝乳酶多肽氨基酸序列具有至少90％(優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少99％)序列一致性的多肽序列。添加的多肽/蛋白如上文所述——第一方面的方法中的步驟(b)為：步驟(b)：向步驟(a)的樣品中添加合適量的多肽制劑，以獲得液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，所述多肽制劑包含長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽，其中所述多肽不是凝乳天冬氨酸蛋白酶也不是降解天冬氨酸蛋白酶的酶，如上所述——第五方面的液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的第(II)項(xiàng)和第六方面的干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的第(II)項(xiàng)為：(II)：濃度為所述組合物的0.01％-10％(w/w)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸且不是凝乳天冬氨酸蛋白酶的多肽；下文對(duì)與本文相關(guān)的“長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽”的具體實(shí)施方式/實(shí)施例的討論與對(duì)本文討論的發(fā)明的所有方面都是相關(guān)的。本發(fā)明上下文中，很明顯，第一方面的方法的步驟(b)中，優(yōu)選不添加降解天冬氨酸蛋白酶的酶，步驟(b)中的術(shù)語(yǔ)“不是降解天冬氨酸蛋白酶的酶”應(yīng)據(jù)此理解。優(yōu)選地，所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下所組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠、牛血清白蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、馬鈴薯蛋白、大麻蛋白、稻蛋白、螺旋藻蛋白、小麥蛋白、花生蛋白、向日葵蛋白、油菜籽蛋白、血蛋白和藻類蛋白。更優(yōu)選地，所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下所組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠和牛血清白蛋白。在上一段提及的組中，優(yōu)選所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠和牛血清白蛋白。在一優(yōu)選實(shí)施方式中——長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是長(zhǎng)于25個(gè)氨基酸的多肽，更優(yōu)選地是長(zhǎng)于40個(gè)氨基酸的多肽。如本文工作實(shí)施例中所討論的——通過(guò)添加例如乳清蛋白、卵清蛋白和BSA(本文中全部可以稱為相對(duì)大的蛋白)獲得與本文相關(guān)的積極的結(jié)果。如本領(lǐng)域所知的——術(shù)語(yǔ)肽可以在大小的基礎(chǔ)上區(qū)別于術(shù)語(yǔ)蛋白，肽(以任意基準(zhǔn))可以理解為大約50個(gè)或更少的氨基酸。換句話說(shuō)，長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的多肽在本領(lǐng)域通常被理解為是蛋白。因此，長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的多肽在本文中或者可以被稱為蛋白。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，——長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是長(zhǎng)于50個(gè)氨基酸的蛋白，更優(yōu)選地是長(zhǎng)于75個(gè)氨基酸的蛋白，甚至更優(yōu)選地長(zhǎng)于150個(gè)氨基酸。甚至更優(yōu)選的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是長(zhǎng)于300個(gè)氨基酸的蛋白。第一方面-一種用于制備液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的方法如上文所述–本發(fā)明第一方面涉及一種用于制備液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物的方法，其中該方法包括以下步驟：(a)：獲得純化的液體凝乳天冬氨酸蛋白酶樣品，該樣品包括：(i)：25IMCU/g所述樣品-30000IMCU/g所述樣品的強(qiáng)度；和(ii)：其中，在所述純化的樣品中，通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少70％是凝乳天冬氨酸蛋白酶；以及(b)：向步驟(a)的樣品中添加合適量的多肽制劑，以獲得液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，所述多肽制劑包含長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽，其中所述多肽不是凝乳天冬氨酸蛋白酶也不是降解天冬氨酸蛋白酶的酶，其中所述組合物包含：(I)：強(qiáng)度為26IMCU/g所述組合物-30100IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶；和(II)：濃度是所述組合物的0.01％-10％(w/w)的步驟(b)添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽；并且其中，在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g樣品)高至少1％。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g樣品)高至少3％；更優(yōu)選地,在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g樣品)高至少7％；甚至更優(yōu)選地，在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g樣品)高至少10％；最優(yōu)選地，在5℃存儲(chǔ)一周之后檢測(cè)，(I)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)比(i)中的強(qiáng)度(IMCU/g所述組合物)高至少15％。凝乳天冬氨酸蛋白酶的優(yōu)選實(shí)施例/實(shí)施方式如上文所述?！伴L(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽”的優(yōu)選實(shí)施例/實(shí)施方式如上文所述。優(yōu)選第(i)項(xiàng)的酶強(qiáng)度是100MCU/g所述樣品-10000IMCU/g所述樣品的強(qiáng)度，更優(yōu)選地是500IMCU/g所述樣品-6000IMCU/g所述樣品的強(qiáng)度。優(yōu)選第(I)項(xiàng)的酶強(qiáng)度是100IMCU/g所述組合物-10000IMCU/g所述組合物的強(qiáng)度，更優(yōu)選地是500IMCU/g所述組合物-6000IMCU/g所述組合物的強(qiáng)度。優(yōu)選地，步驟(a)(ii)的純化的樣品是這樣一種樣品，其中所述純化樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少80％是凝乳天冬氨酸蛋白酶；更優(yōu)選地，其中所述純化樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少90％是凝乳天冬氨酸蛋白酶；甚至更優(yōu)選地，其中所述純化樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少95％是凝乳天冬氨酸蛋白酶?？蓛?yōu)選的是所述純化樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少99％是凝乳天冬氨酸蛋白酶。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的——在本發(fā)明上下文中，本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得本文所討論的純化的液體凝乳天冬氨酸蛋白酶樣品是常規(guī)工作——例如通過(guò)使用合適的層析(例如，柱層析)分離程序。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這樣的層析，因此沒(méi)有必要在此詳細(xì)描述層析過(guò)程。例如，WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述了使用曲霉(Aspergillus)細(xì)胞(優(yōu)選黑曲霉(Aspergillusniger))作為生產(chǎn)宿主細(xì)胞產(chǎn)生單峰駱駝凝乳酶(駱駝凝乳酶)的重組方法。還已知使用其它細(xì)胞作為生產(chǎn)宿主細(xì)胞–諸如例如，酵母細(xì)胞，其中一個(gè)例子是例如克魯維酵母(Kluyveromyces)細(xì)胞(例如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis))。因此，可優(yōu)選的是步驟(a)(ii)的純化樣品是從真菌或酵母生產(chǎn)宿主細(xì)胞例如曲霉細(xì)胞或克魯維酵母細(xì)胞中的凝乳天冬氨酸蛋白酶的重組生產(chǎn)獲得的樣品。如本領(lǐng)域所知的——來(lái)自米赫根毛霉的毛霉凝乳酶可優(yōu)選地通過(guò)使用米赫根毛霉作為生產(chǎn)宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。關(guān)于第(II)項(xiàng)——優(yōu)選步驟(b)中添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.05％-8％(w/w)；更優(yōu)選地，步驟(b)中添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.1％-7％(w/w)；甚至更優(yōu)選地，步驟(b)中添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.25％-5％(w/w)，最優(yōu)選地，步驟(b)中添加的不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.5％-4％(w/w)(諸如例如，濃度是組合物的1％-3％(w/w))。第五和/或第六方面-液體和/或干燥的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物如上文所述–本發(fā)明第五方面涉及一種液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包含：(I)：強(qiáng)度為25IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶；(II)：濃度為所述組合物的0.01％-10％(w/w)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸且不是凝乳天冬氨酸蛋白酶的多肽；以及(III)：濃度為1-350g/kg的鹽，并且其中所述組合物的pH為2-8；以及(x)：其中第(II)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠、牛血清白蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、馬鈴薯蛋白、大麻蛋白、稻蛋白、螺旋藻蛋白、小麥蛋白、花生蛋白、向日葵蛋白、油菜籽蛋白、血蛋白和藻類蛋白。如上文所述–本發(fā)明第六方面涉及干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包含：(I)：強(qiáng)度為25IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶，其；(II)：濃度為所述組合物的0.01％-10％(w/w)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸且不是凝乳天冬氨酸蛋白酶的多肽；以及(III)：鹽，并且其中懸浮于水中的所述組合物的pH為2-8；以及(x)：其中第(II)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽是選自由如下組成的多肽組的至少一種多肽：乳清蛋白、α乳白蛋白、β-乳球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳過(guò)氧化物酶、酪蛋白、α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、卵清蛋白、明膠、牛血清白蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、玉米蛋白、馬鈴薯蛋白、大麻蛋白、稻蛋白、螺旋藻蛋白、小麥蛋白、花生蛋白、向日葵蛋白、油菜籽蛋白、血蛋白和藻類蛋白。對(duì)于液體的和干燥的組合物而言-凝乳天冬氨酸蛋白酶的優(yōu)選實(shí)施例/實(shí)施方式如上文所述。對(duì)于液體的和干燥的組合物而言-“長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽”的優(yōu)選實(shí)施例/實(shí)施方式如上文所述。對(duì)于液體的和干燥的組合物而言–優(yōu)選第(I)項(xiàng)中的酶強(qiáng)度是100IMCU/g所述組合物–10000IMCU/g所述組合物的強(qiáng)度，更優(yōu)選地是500IMCU/g所述組合物-6000IMCU/g所述組合物的強(qiáng)度。對(duì)于液體的和干燥的組合物而言–關(guān)于第(II)項(xiàng)，優(yōu)選不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.05％-8％(w/w)；更優(yōu)選地，不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.1％-7％(w/w)；甚至更優(yōu)選地，不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.25％-5％(w/w)，最優(yōu)選地，不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的0.5％-4％(w/w)(諸如例如，不是凝乳天冬氨酸蛋白酶且長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的濃度是組合物的1％-3％(w/w))。對(duì)于液體組合物–第(iii)項(xiàng)中的鹽的濃度優(yōu)選為10-300g/kg，更優(yōu)選地第(iii)項(xiàng)中的鹽的濃度為25-250g/kg。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的-對(duì)于干燥的組合物，第(iii)項(xiàng)中的鹽濃度可相對(duì)較高——諸如例如，50％(w/w)-99.9％(w/w)或諸如例如，80％(w/w)-99％(w/w)。對(duì)于液體的和干燥的組合物而言–優(yōu)選所述鹽是無(wú)機(jī)鹽–優(yōu)選地其中所述無(wú)機(jī)鹽選自如下的組：NaCl、KCl、Na2SO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4或NaH2PO4或它們的組合。最優(yōu)選地，所述鹽是NaCl。所述液體或干燥的組合物均可包含其他添加劑/化合物諸如例如，防腐劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的-防腐劑通?？梢宰阋栽诋a(chǎn)品的保質(zhì)期期間防止微生物生長(zhǎng)的濃度添加。防腐劑的實(shí)例可以是例如，弱有機(jī)酸如甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、丙酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、苯甲酸鹽、山梨酸鹽或延胡索酸鹽。對(duì)羥基苯甲酸酯(對(duì)羥基苯甲酸的烷基酯)也可以用作防腐劑。甘油或丙二醇也已被描述為防腐劑。液體的和干燥的組合物–優(yōu)選pH為3-7，更優(yōu)選地pH為4-6.5，甚至更優(yōu)選地pH為5–6。優(yōu)選地，所述液體組合物是含水組合物，例如水溶液。如本文所用的含水組合物或含水溶液涵蓋包含水例如至少20wt％水、例如至少40wt％水的任何組合物或溶液?？蓛?yōu)選的是本文所述的液體組合物具有10g-10000kg諸如例如100g-3000kg的總重量?？蓛?yōu)選的是本文所述的干燥的粒狀組合物具有0.25g-200kg諸如例如0.5g-50kg的總重量。優(yōu)選所述組合物是如本文所述的液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物。對(duì)于液體和干燥的組合物而言–優(yōu)選的實(shí)施方式是：(y)：其中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的第(I)項(xiàng)的天冬氨酸蛋白酶和第(II)項(xiàng)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的含量的總和高于組合物中長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的蛋白和/或多肽的總量的50％(w/w)；更優(yōu)選地(y)：其中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的第(I)項(xiàng)的天冬氨酸蛋白酶和第(II)項(xiàng)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的含量的總和高于組合物中長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的蛋白和/或多肽的總量的70％(w/w)；甚至更優(yōu)選地(y)：其中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的第(I)項(xiàng)的天冬氨酸蛋白酶和第(II)項(xiàng)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的含量的總和高于組合物中長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的蛋白和/或多肽的總量的80％(w/w)；以及最優(yōu)選地(y)：其中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的第(I)項(xiàng)的天冬氨酸蛋白酶和第(II)項(xiàng)的長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的含量的總和高于組合物中長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的蛋白和/或多肽的總量的90％(w/w)。在本發(fā)明上下文中–本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道或者可常規(guī)地確定(例如，基于具體相關(guān)的氨基酸序列)第(x)項(xiàng)中所述長(zhǎng)于10個(gè)氨基酸的多肽的來(lái)源。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可因此常規(guī)地確定(例如，通過(guò)SDS-PAGE)在本文相關(guān)的目的組合物中第(y)項(xiàng)是否得到滿足。第七方面和第八方面如上文所述-本發(fā)明第七方面涉及液體凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包括強(qiáng)度為1600IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶以及濃度為1-350g/kg的鹽，且其中所述組合物的pH為2-8。本發(fā)明第八方面涉及干燥的粒狀凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，其包括強(qiáng)度為1600IMCU/g所述組合物-30000IMCU/g所述組合物的凝乳天冬氨酸蛋白酶以及鹽，且其中懸浮于水中的所述組合物的pH為2-8。對(duì)于液體和干燥的組合物而言–優(yōu)選地，所述強(qiáng)度是2000IMCU/g所述組合物-15000IMCU/g所述組合物的強(qiáng)度，諸如3000IMCU/g所述組合物-10000IMCU/g所述組合物，或諸如4000IMCU/g所述組合物-8000IMCU/g所述組合物。第九方面-用于制備食品或飼料產(chǎn)品的方法根據(jù)本領(lǐng)域如上文所述-本文所述的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物可用于——例如，制備基于乳的目的產(chǎn)品(諸如例如，奶酪產(chǎn)品)。如上文所述–本發(fā)明第九方面涉及一種用于制備食品或飼料產(chǎn)品的方法，包括向食品或飼料組分中添加有效量的根據(jù)第五至第八方面的任一或其與本文相關(guān)的實(shí)施方式的任一的凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，并進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟以獲得食品或飼料產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述食品或飼料產(chǎn)品是基于乳的產(chǎn)品，且其中所述方法包括向乳中添加有效量的本文所述的分離的凝乳酶多肽變體并進(jìn)行進(jìn)一步的制備步驟以獲得基于乳的產(chǎn)品。乳可以例如是綿羊奶、山羊奶、水牛奶、牦牛奶、羊駝(lama)奶、駱駝奶或牛奶?；谌榈漠a(chǎn)品可以例如是發(fā)酵乳產(chǎn)品、奶渣(quark)或奶酪?？蓛?yōu)選的是用于制備第四方面或其與本文相關(guān)的實(shí)施方式的食品或飼料產(chǎn)品的方法是這樣的方法，其中首先根據(jù)第三方面的用于存儲(chǔ)凝乳天冬氨酸蛋白酶的方法存儲(chǔ)凝乳天冬氨酸蛋白酶組合物，然后根據(jù)用于制備第四方面的食品或飼料產(chǎn)品的方法添加到食品或飼料組分中。實(shí)施例實(shí)施例1：凝乳比活性的測(cè)定4.1凝結(jié)活性的測(cè)定使用REMCAT方法測(cè)定凝乳活性，REMCAT方法是由國(guó)際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法(IDF方法)。凝乳活性由從低熱、低脂奶粉和0,5g/升(pH≈6,5)的氯化鈣溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)乳底物的可見(jiàn)絮凝所需的時(shí)間來(lái)確定。將凝乳酶樣品的凝結(jié)時(shí)間與具有已知的凝乳活性且根據(jù)IDF標(biāo)準(zhǔn)110B具有與樣品相同的酶組分的參照標(biāo)準(zhǔn)品的凝結(jié)時(shí)間進(jìn)行比較。在相同的化學(xué)和物理?xiàng)l件下測(cè)量樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)品。使用84mM乙酸pH5.5緩沖液將多種樣品調(diào)節(jié)至約3IMCU/ml。此后，將200μl酶添加到置于水浴中的玻璃試管中的10ml預(yù)熱的牛奶(32℃)中，牛奶在恒定攪拌下能夠保持32℃±1℃的恒溫。根據(jù)下式，相對(duì)于具有與樣品相同的酶組成的標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算凝乳性酶的總凝乳活性(強(qiáng)度)，以國(guó)際乳凝結(jié)單位(IMCU)/ml表示：S標(biāo)準(zhǔn)：國(guó)際參照標(biāo)準(zhǔn)品凝乳酶(rennet)的凝乳活性T標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液獲得的凝結(jié)時(shí)間(秒)D樣品：樣品的稀釋因子D標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋因子T樣品：從添加酶至絮凝的時(shí)間對(duì)于稀釋的凝乳酶樣品獲得的凝結(jié)時(shí)間(秒)4.2總蛋白含量測(cè)定使用來(lái)自ThermoScientific的PierceBCA蛋白測(cè)定試劑盒，根據(jù)提供商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白含量。4.3凝結(jié)比活性的計(jì)算通過(guò)凝結(jié)活性(IMCU/ml)除以總蛋白含量(mg總蛋白/ml)來(lái)確定凝結(jié)比活性(IMCU/mg總蛋白)實(shí)施例2：酶制劑在黑曲霉(大致如WO02/36752A2所述)中重組表達(dá)牛凝乳酶(Chr.HansenA/S)或駱駝凝乳酶(M,Chr.HansenA/S)。通過(guò)層析技術(shù)純化酶。使用米赫根毛霉作為生產(chǎn)宿主細(xì)胞產(chǎn)生來(lái)自米赫根毛霉的毛霉凝乳酶(Chr.HansenA/S)，并通過(guò)層析技術(shù)純化。對(duì)于所有純化的酶樣品-在純化的樣品中通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的具有大于10kDa大小的蛋白的總量的至少90％是相關(guān)的凝乳天冬氨酸蛋白酶。所有的酶樣品均通過(guò)以下方式制備：將精確體積的酶儲(chǔ)液與添加劑的溶液混合并添加緩沖液至最終體積。以這種方式，對(duì)于所有制備的樣品，酶蛋白的濃度保持恒定。緩沖液組成為：0.25M乙酸鈉、20mM磷酸鈉、2.0M氯化鈉pH5.7、5mM甲硫氨酸和35mM苯甲酸鈉。強(qiáng)度為200-1200IMCU/ml。向組合物中添加不同的多肽，例如Hammersten酪蛋白，WPC80，LacprodanAlpha10，LacprodanAlpha20等。WPC80是具有80％蛋白的干乳清蛋白濃縮物的商業(yè)制劑。LacprodanAlpha10和LacprodanAlpha20是乳清蛋白分離物的商業(yè)制劑，分別含有43％總蛋白含量和60％總蛋白含量的α乳白蛋白。實(shí)施例3：駱駝凝乳酶的物理穩(wěn)定性工業(yè)酶的液體制劑經(jīng)受來(lái)自單元操作的物理力，諸如泵送、攪拌和膜上過(guò)濾。在部分填充的容器的運(yùn)輸期間，液體制劑的晃動(dòng)也可能有助于此。剪切應(yīng)力和酶暴露于水-空氣界面的增加可引起變性和伴隨的酶活性損失。酶或蛋白樣品的物理穩(wěn)定性可以通過(guò)反復(fù)搖動(dòng)在具有高的頂部空間與樣品體積比的試管中的酶樣品來(lái)測(cè)試。通過(guò)在旋轉(zhuǎn)裝置中顛倒填充在10ml試管中的2ml樣品1小時(shí)來(lái)研究不同的天冬氨酸蛋白酶針對(duì)震蕩的穩(wěn)定性(參見(jiàn)本文圖2)。對(duì)于每種溶液，在垂直顛倒1小時(shí)(室溫)后測(cè)量相對(duì)凝乳活性，并與具有完全相同組成的未顛倒對(duì)照進(jìn)行比較。結(jié)果表示為“保留的活性”，其通過(guò)顛倒樣品的活性除以未顛倒對(duì)照樣品的活性而獲得。結(jié)果：駱駝凝乳酶樣品垂直顛倒1小時(shí)導(dǎo)致超過(guò)30％的活性損失，參見(jiàn)表1(無(wú)添加)。發(fā)現(xiàn)添加濃度為0.015％PEG8000保護(hù)駱駝凝乳酶，并且使得垂直顛倒后沒(méi)有活性損失。當(dāng)駱駝凝乳酶樣品含有濃度為0.5％w/v或1.0％w/v的Hammersten酪蛋白、Alpha10、Alpha20或WPC80時(shí)，可見(jiàn)在垂直顛倒后幾乎沒(méi)有損失。發(fā)現(xiàn)當(dāng)Alpha20和WPC80的濃度降低到低于0.1％時(shí)，它們的保護(hù)作用逐漸降低。具有酸性酪蛋白水解物或無(wú)蛋白乳清的駱駝凝乳酶制劑未增高酶的穩(wěn)定性，因?yàn)榇怪鳖嵉购蠡钚缘膿p失與未處理的對(duì)照樣品相同(表3)。結(jié)論：結(jié)果表明，添加到駱駝凝乳酶制劑中的某些蛋白可以增高酶的物理穩(wěn)定性。表1：垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留活性(內(nèi)部參考號(hào)：EXP-13-AD2681)?；衔锉Ａ舻幕钚詿o(wú)添加67％(3％)PEG(0.015％)99％(0％)甘油(6％)67％(4％)0.5％Hammersten酪蛋白97％(0％)1％Hammersten酪蛋白97％(1％)0.5％酪蛋白水解物(Merck)67％(4％)1％酪蛋白水解物(Merck)74％(5％)0.5％Alpha10(樣品1)98％(0％)1％Alpha10(樣品1)98％(0％)0.5％Alpha20(樣品2)98％(0％)1％Alpha2098％(0％)0.5％無(wú)蛋白乳清64％(17％)1％無(wú)蛋白乳清69％(1％)0.1％WPC80100％(0％)1％WPC8099％(0％)實(shí)施例4：駱駝凝乳酶的比活性結(jié)果：設(shè)計(jì)顛倒實(shí)驗(yàn)，使得在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中添加完全相同量的酶蛋白并且將所有制劑制成相同的體積。如果制劑的組成不影響酶活性，則預(yù)期會(huì)發(fā)現(xiàn)所有對(duì)照樣品即未顛倒的樣品具有相同的酶活性。然而，情況并非如此。含有PEG8000的樣品的活性高4-5％，良好地符合最近提交的專利申請(qǐng)IN5103DK00。即使應(yīng)用相同量的酶蛋白，含有Hammerstein酪蛋白、Alpha20或WPC80的樣品與不含添加劑的樣品(無(wú)添加)相比活性高13-18％(表2)。這表明，駱駝凝乳酶制劑中存在的乳蛋白提高了酶的比活性。從表3中得出相同的結(jié)論，表3顯示了含有5種不同濃度的Alpha20和WPC80的組合物的活性。表5顯示了組合物的活性，“無(wú)添加”的活性指數(shù)＝100％，以及垂直顛倒1小時(shí)的樣品的保留活性。向駱駝凝乳酶的組合物中添加多肽對(duì)酶有兩種作用：比活性增高和酶的物理穩(wěn)定性增高。如表3所示，兩種性能與多肽的劑量良好相關(guān)。在表3中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Alpha20的濃度從0.5％降低至0.01％時(shí)，酶活性從指數(shù)115降至指數(shù)102(為與未處理的對(duì)照幾乎相同的水平)。Alpha20的濃度為0.01％時(shí)，酶的物理穩(wěn)定性(保留的活性)與對(duì)照實(shí)驗(yàn)(未添加)相同。表2：添加了不同多肽的M的活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示(內(nèi)部參考號(hào)：EXP-13-AD2681)。表3：添加了不同多肽的M的活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示。右欄顯示垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留的活性(內(nèi)部參考號(hào)：EXP-13-AD2681)。結(jié)論：向駱駝凝乳酶組合物中添加多肽對(duì)酶具有兩種作用：比活性增高和酶的物理穩(wěn)定性增高。兩種性能均與多肽的劑量良好相關(guān)。實(shí)施例5：駱駝凝乳酶、牛凝乳酶、毛霉凝乳酶L和毛霉凝乳酶XL的比活性表4：添加了不同多肽的凝乳性酶的活性(內(nèi)部參考號(hào)：EXP-13-AD2690)。絕對(duì)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在括號(hào)中。結(jié)論：表2-4的結(jié)果顯示，向天冬氨酸蛋白酶制劑中添加多肽增高了比活性。實(shí)施例6：下表顯示了類似于上述實(shí)施例3進(jìn)行的測(cè)試的結(jié)果——但使用不同的蛋白制劑。添加表中所示的所有蛋白至最終含量為1％w/w，麥醇溶蛋白作為唯一的例外產(chǎn)生澄清溶液。根據(jù)實(shí)施例3測(cè)試物理穩(wěn)定性。樣品在5℃和37℃分別存儲(chǔ)1年，并在存儲(chǔ)期間測(cè)試穩(wěn)定性。“存儲(chǔ)結(jié)束”這一欄顯示1年后的保留的活性-通過(guò)對(duì)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合單個(gè)指數(shù)函數(shù)來(lái)計(jì)算數(shù)值。如本領(lǐng)域所知的–術(shù)語(yǔ)“蛋白胨”是指通過(guò)蛋白質(zhì)水解消化的蛋白。如本領(lǐng)域所知的–術(shù)語(yǔ)“胰蛋白胨”是指由胰蛋白酶這種蛋白酶消化的蛋白。表5：添加1％w/w不同多肽的CHY-MAXM的活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示。“保留的活性”這一欄顯示垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留的活性?！按鎯?chǔ)結(jié)束”這一欄顯示在5℃和37℃存儲(chǔ)后的保留的活性。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。(內(nèi)部參考號(hào)：EXP-14-AE8307)實(shí)施例7：通過(guò)將2g樣品懸浮于40ml鹽水中制備植物蛋白提取物，所述鹽水由溶于水中的12％NaCl、20g/L無(wú)水NaAc、2.5g/L無(wú)水NaH2PO4和10g/L苯甲酸鈉組成，pH5.4-5.8。在旋轉(zhuǎn)裝置上混合2小時(shí)后，將懸浮液離心，將上清液的pH調(diào)節(jié)至5.4-5.8，并通過(guò)0.45μm的針筒式過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)與精確測(cè)量的等體積的酶儲(chǔ)液混合，提取物用于制備CHY-MAXM制劑，產(chǎn)生具有相同濃度的酶蛋白的樣品。在該實(shí)施例中，在三組中測(cè)試27種不同植物蛋白的提取物，每組在不同的天制備。在樣品制備后一天測(cè)量活性；標(biāo)題為“活性”的一欄示出了相對(duì)于未處理對(duì)照(無(wú)添加)的活性(IMCU/ml)。根據(jù)實(shí)施例3測(cè)試物理穩(wěn)定性，唯一的區(qū)別在于，在本實(shí)施例中，使用不同的旋轉(zhuǎn)裝置用于樣品的垂直顛倒(來(lái)自Biosan的MultiRS-60，32rpm，1小時(shí))。旋轉(zhuǎn)裝置的改變可能導(dǎo)致樣品的物理應(yīng)力增加，因?yàn)榕c前述實(shí)施例中70％活性相比未處理樣品的保留的活性僅為10％。樣品在5℃和37℃下分別儲(chǔ)存1年，并在儲(chǔ)存期間測(cè)試穩(wěn)定性?！按鎯?chǔ)結(jié)束”一欄顯示1年后的保留的活性-通過(guò)對(duì)所有數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合單個(gè)指數(shù)函數(shù)來(lái)計(jì)算數(shù)值。表6：添加不同多肽的M的活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示?！氨Ａ舻幕钚浴边@一欄顯示垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留活性?！按鎯?chǔ)結(jié)束”這一欄顯示在5℃和37℃存儲(chǔ)后的保留的活性。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。內(nèi)部參考號(hào)：組1/EXP-14-AF3604。表7：添加了不同多肽的M活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示?！氨Ａ艋钚浴边@一欄顯示垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留活性。“存儲(chǔ)結(jié)束”這一欄顯示在5℃和37℃存儲(chǔ)后的保留活性。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。內(nèi)部參考號(hào)：組2/EXP-14-AF3604。表8：添加不同多肽的M的活性。相對(duì)于未處理對(duì)照(“無(wú)添加”)的活性指數(shù)以百分比顯示?！氨Ａ舻幕钚浴边@一欄顯示垂直顛倒1小時(shí)的駱駝凝乳酶樣品的保留的活性。“存儲(chǔ)結(jié)束”這一欄顯示在5℃和37℃存儲(chǔ)后的保留的活性。標(biāo)準(zhǔn)偏差示于括號(hào)中。內(nèi)部參考號(hào)：組3/EXP-14-AF3604。參考文獻(xiàn)1：EP2333056A1(DSM,申請(qǐng)日2007.12.04)2：WO2012/127005A1(DSM)3：DE1492060A1(Nordmark-WerkeGmbH,1969年公開(kāi))當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3