專利名稱：生物催化不對(duì)稱還原制備(r)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種生物催化不對(duì)稱還原制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法及所用的重組載體和基因工程菌。
背景技術(shù)：
氯吡格雷(Clopidogrel)，化學(xué)名(S) - α -(2_氯苯基)_6，7_ 二氫噻吩并[3， 2-c]吡啶-5 GH)-乙酸甲酯，系一種血小板凝集抑制劑，由法國(guó)賽諾菲-安萬特公司 (Sanofi-Aventis)公司于1986年研究開發(fā)成功，臨床用其硫酸鹽，商品名Plavix (波立維)，主要用于治療動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病。2009年該藥品全球銷售額達(dá)一百億美元，僅次于降血脂藥物阿伐他汀，成為全球藥品市場(chǎng)中排名第二位的暢銷藥物。(R)-鄰氯扁桃酸及其甲酯是合成氯吡格雷的重要手性砌塊，(R)-鄰氯扁桃酸甲酯經(jīng)磺酸酯化和親核取代合成氯吡格雷的方法，反應(yīng)產(chǎn)率高，產(chǎn)物基本無消旋化。因此，研究00-鄰氯扁桃酸甲酯的手性合成具有廣闊的應(yīng)用前景。目前為止，(R)-鄰氯扁桃酸及其甲酯的合成路線主要包括以下三條(1)從消旋鄰氯扁桃酸或其酯出發(fā)，采用非對(duì)映體鹽結(jié)晶拆分法或酶促水解拆分法得到單一構(gòu)型的鄰氯扁桃酸甲酯。如專利W02007078176A1中報(bào)道了商品酶 CAL-A(Novozym 735)可以在水相中水解拆分鄰氯扁桃酸甲酯或乙酯，底物濃度1 % (ν/ν), 產(chǎn)物ee值均達(dá)99%以上。CAL-B(Novozym 43 拆分鄰氯扁桃酸甲酯時(shí)的產(chǎn)物ee值為 95. 9%，拆分鄰氯扁桃酸乙酯時(shí)產(chǎn)物ee值大于99%。CAL-A亦可以在非水相中拆分鄰氯扁桃酸甲酯得到光學(xué)純(R)-鄰氯扁桃酸甲酯(>99% ee)，產(chǎn)物得率41%，E = 34. 7 (J. Mol. Catal. B =Enzym.，2007，45 34-38)。但這種合成方法的理論收率僅50%，一定程度上造成了資源的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。(2)利用羥腈化酶催化鄰氯苯甲醛與氫氰酸不對(duì)稱合成(R)-鄰氯扁桃腈，再經(jīng)酸水解生成(R)-鄰氯扁桃酸。如 van Langen 等(Org. Process Res. Dev.，2003，7 :828-831) 利用商品化的羥腈化酶較低溫度下(0_20°C )合成00-鄰氯扁桃腈，產(chǎn)物得率98%，ee值 90%，酸水解后得到(R)-鄰氯扁桃酸，進(jìn)一步重結(jié)晶后產(chǎn)物ee值可達(dá)99%以上。Glieder 等(Angew Chem. Int. Ed.，2003，42 :4815-4818)利用扁桃(Prunus amygdalus)羥腈水解酶為催化劑，從鄰氯苯甲醛出發(fā)得到(R)-鄰氯扁桃腈，產(chǎn)物ee值為96.5%。將該酶交聯(lián)固定化后，催化劑可以重復(fù)使用10個(gè)批次以上(Org. Lett. , 2005, 7 =327-329) 0該方法雖然產(chǎn)物得率高，選擇性較好，但由于需用到劇毒的氫氰酸，加大了反應(yīng)操作難度和危險(xiǎn)性。(3)直接不對(duì)稱還原鄰氯苯甲酰甲酸或其甲酯得到(R)-鄰氯扁桃酸或其甲酯， 該方法理論上可以實(shí)現(xiàn)100%的產(chǎn)率，使原料得到充分利用。Yin等(J. Organometal. Chem. ,2009,694 =2092-2095)利用金屬釕(Ru)催化劑通過不對(duì)稱氫化法合成(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，但該反應(yīng)產(chǎn)物ee值只有92%，且反應(yīng)條件相對(duì)苛刻，產(chǎn)物中容易殘留有毒的重金屬。相比而言，生物催化的不對(duì)稱還原法反應(yīng)條件非常溫和，環(huán)境污染小，使其成為最具潛力的綠色生產(chǎn)方法之一。如專利EP1316613A2中篩選了幾十種微生物，用以不對(duì)
3稱還原鄰氯苯甲酰甲酸，底物加入量10g/L，產(chǎn)物ee值大多在98%以上，產(chǎn)物的最高得率為 88.7%。Guo 等(J. Chem. iTechnol. Biotechnol.，2009，84 :1787-1792)篩選得到一株橢圓酵母(Saccharomyces ellipsoideus)GIM2. 105，可以不對(duì)稱還原鄰氯苯甲酰甲酸生成光學(xué)純(R)-鄰氯扁桃酸，但底物濃度僅為30mM。Jeong等(Biotechnol. Lett.，2010，32 1529-1531)利用面包酵母催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的不對(duì)稱還原，底物濃度16. 7g/L，轉(zhuǎn)化率100%，ee值96. 1%。利用高表達(dá)還原酶的重組細(xì)胞作為催化劑可以克服野生微生物催化時(shí)反應(yīng)的時(shí)空產(chǎn)率和立體選擇性較低的障礙，提高產(chǎn)率和立體選擇性。由于還原酶催化不對(duì)稱還原反應(yīng)通常需要在輔酶存在下才能進(jìn)行，通過將還原酶和輔酶再生酶類(如葡萄糖脫氫酶)進(jìn)行共表達(dá)有可能可以解決輔酶再生問題。日本的Ema等(Adv. Synth. Catal.，2008，350 :2039-2044)通過將羰基還原酶Gre2與葡萄糖脫氫酶共表達(dá)，利用重組大腸桿菌作為催化劑不對(duì)稱還原IM鄰氯苯甲酰甲酸甲酯合成(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和對(duì)映選擇性均可達(dá)99 %以上，但是該方法并沒有解決輔酶再生的問題，還是需額外添加lg/L的昂貴輔酶NADP+，顯著增大了生產(chǎn)的成本，且反應(yīng)需要在20°C下進(jìn)行，一定程度上也增加了能耗。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)現(xiàn)有的生物還原法制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯需額外添加輔酶的嚴(yán)重缺陷，提供一種利用重組還原酶和輔酶再生酶雙酶的基因工程菌整細(xì)胞為催化劑來催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯不對(duì)稱還原制備光學(xué)純(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，以及其中所用的重組載體和重組菌。該方法不需要額外添加價(jià)格昂貴的輔酶 NADP+,極大地降低了生產(chǎn)的成本，并且反應(yīng)的生產(chǎn)效率高，產(chǎn)物的光學(xué)純度高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，操作簡(jiǎn)便，易于放大。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案解決上述問題本發(fā)明的第一方面提供一種生物催化不對(duì)稱還原制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，包括在PH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表達(dá)重組還原酶和重組葡萄糖脫氫酶的基因工程菌濕菌體或其凍干細(xì)胞為催化劑，以鄰氯苯甲酰甲酸甲酯為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中，所述的重組還原酶是重組醛酮還原酶(aldo-keto reductase，AKR)。本發(fā)明中，所述的重組醛酮還原酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，氨基酸序列如序列表中SEQ. ID NO 2所示；或者是在保持由該醛酮還原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 2所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述的重組葡萄糖脫氫酶(GDH)可以是現(xiàn)有的任何來源的葡萄糖脫氫酶，只要能夠在所在的基因工程菌中表達(dá)且可以實(shí)現(xiàn)輔酶的再生即可。較佳的，所述的重組葡萄糖脫氫酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，更佳的是氨基酸序列如序列表中SEQ. ID NO 3所示的重組葡萄糖脫氫酶；或者是在保持由該葡萄糖脫氫酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 3所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述的基因工程菌可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種微生物，只要能滿足能夠有效表達(dá)本發(fā)明的重組醛酮還原酶和和重組葡萄糖脫氫酶即可。該基因工程菌同時(shí)表達(dá)醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輔酶的高效再生。較佳的，所述的基因工程菌是重組大腸桿菌，更佳的為重組大腸埃希氏菌(E. coli)BL21(DE;3)。本發(fā)明的基因工程菌可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備而得，一般將含有本發(fā)明的重組醛酮還原酶和和重組葡萄糖脫氫酶的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞即可。本發(fā)明中，所述底物鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的濃度較佳的為50 1000g/L緩沖液， 較佳的為100-600g/L緩沖液。本發(fā)明的基因工程菌的用量為催化有效量，能使底物轉(zhuǎn)化達(dá)到99%以上即可，較佳的所述凍干細(xì)胞的用量為10 50g/L。所述葡萄糖用量與底物質(zhì)量之比較佳的為1.0 2.0，更佳的為1.0-1.5。本發(fā)明中，在所述的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中不加入輔酶NADP+就能夠達(dá)到發(fā)明效果。還可以加入輔酶NADP+，則達(dá)到極其優(yōu)良的效果。所述的NADP+用量較佳的不超過1. Ommol/L。本發(fā)明中，反應(yīng)液的pH為6-8，通過使用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行控制。所述的磷酸鹽緩沖液較佳的如磷酸-磷酸鉀或磷酸-磷酸鈉緩沖液。磷酸鹽緩沖液的濃度較佳的為 0. 05-0. lmol/L，所述的濃度是指緩沖溶液中共軛酸堿的總濃度。反應(yīng)過程中也可以滴加堿液，如碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水等的水溶液以維持反應(yīng)液PH恒定在pH 6-8的范圍。本發(fā)明中，所述的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的溫度較佳的為20 40°C。所述的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的時(shí)間以反應(yīng)完全為準(zhǔn)，一般為I-M小時(shí)。不對(duì)稱還原反應(yīng)結(jié)束后，可按本領(lǐng)域常規(guī)方法從反應(yīng)液中提取(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。本發(fā)明的第二方面提供一種重組載體，其含有編碼醛酮還原酶和編碼葡萄糖脫氫酶的堿基序列；或者含有在保持由該堿基序列編碼的醛酮還原酶或者葡萄糖脫氫酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。本發(fā)明中，所述的重組醛酮還原酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，氨基酸序列如序列表中SEQ. ID NO 2所示；或者是在保持由該醛酮還原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 2所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述的重組葡萄糖脫氫酶可以是現(xiàn)有的任何來源的葡萄糖脫氫酶，只要能夠在所在的基因工程菌中表達(dá)且可以實(shí)現(xiàn)輔酶的再生即可。較佳的，所述的重組葡萄糖脫氫酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，更佳的是氨基酸序列如序列表中 SEQ. ID NO 3所示的重組葡萄糖脫氫酶；或者是在保持由該葡萄糖脫氫酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 3所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述的編碼醛酮還原酶的堿基序列可以是常規(guī)，也可以是按照密碼子的間并性，進(jìn)行了優(yōu)化適合在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)重組醛酮還原酶。較佳的是來源于枯草芽孢桿菌的醛酮還原酶基因，更佳的是序列表SEQID NO :1的第1至843位所示的堿基序列；或者含有在保持由該堿基序列編碼的醛酮還原酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。本發(fā)明中，所述的編碼葡萄糖脫氫酶的堿基序列同樣的可以是常規(guī)，也可以是按照密碼子的間并性，進(jìn)行了優(yōu)化適合在宿主細(xì)胞中有效表達(dá)重組葡萄糖脫氫酶。較佳的是來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因，更佳的是序列表SEQ ID NO :1的第859至1644
5位所示的堿基序列，或者含有在保持由該堿基序列編碼的葡萄糖脫氫酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。本發(fā)明中，所述的重組載體的可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如市售的質(zhì)粒、粘粒、 噬菌體或病毒載體等，優(yōu)選質(zhì)粒pET28a。本發(fā)明的重組載體可以按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備得到。本發(fā)明的一較佳實(shí)施例是通過下述方法制得本發(fā)明的重組載體根據(jù)Genbank 中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的醛酮還原酶ytbE基因設(shè)計(jì)引物 (該引物較佳的如上游引物CGCGGATCCATGACAACACATTTACAAGCAAAAG ；下游引物CCGGTC GAGTTAAAAATCAAAGTTGTCCGGATC。)，以枯草芽孢桿菌全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到編碼醛酮還原酶的基因片段，將PCR擴(kuò)增出來的目的片段回收。將所得到的編碼醛酮還原酶(Al )的基因片段酶切后連接到pET28a質(zhì)粒上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET28a-AKR。將重組質(zhì)粒pET28a-AKR進(jìn)行B10I單酶切并去磷酸化；根據(jù)Genbank中已報(bào)道的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的葡萄糖脫氫酶基因(⑶H)序列設(shè)計(jì)引物，其中引物5’端引入pET28a-AKR上經(jīng)過單酶切后切口兩端15bp的序列(該引物較佳的如上游引物TGGTG GTGGTGGTGCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA ；下游引物ACTTTGATTTTTAACAAGGAGATATACATATGTA TCC)，以枯草芽孢桿菌全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增⑶H基因片段，將PCR擴(kuò)增出來的目的片段回收后，利用clone EZ試劑盒通過基因同源重組的方法將目的基因重組到單酶切后的pET28a-AKR上，形成同時(shí)含有醛酮還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因序列的重組質(zhì)粒 pET28a-AKR-GDH。本發(fā)明的第三方面提供一種基因工程菌，其包含如上所述的本發(fā)明的重組載體。 該基因工程菌能夠同時(shí)表達(dá)醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輔酶的高效再生。其可通過將本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足重組質(zhì)?？煞€(wěn)定地自行復(fù)制，且所攜帶的本發(fā)明的還原酶基因可被有效表達(dá)即可。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)，更優(yōu)選E. coli BL21(DE!3)。將前述重組載體pET28a-AKR-GDH轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株，即 E. coli BL21 (DE3)/pET28a_AKR-GDH。本發(fā)明的第四方面提供一種發(fā)酵培養(yǎng)如上所述的基因工程菌的方法，包括將如上所述的基因工程大腸桿菌接種至含卡那霉素(卡那霉素濃度為10 200yg/ml，優(yōu)選 50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度OD6tltl達(dá)到0. 5-0. 7 (優(yōu)選0. 6)時(shí)，加入終濃度為0. 1-lmmol/L (優(yōu)選0. 5mmol/L)的異丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，繼續(xù)誘導(dǎo)8-16小時(shí)。將發(fā)酵液離心，即得重組菌的濕菌體，再經(jīng)冷凍干燥即得重組菌的凍干細(xì)胞。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明的共表達(dá)醛酮還原酶和葡萄糖脫氫的基因工程菌可以高效高選擇性地制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。與現(xiàn)有報(bào)道的生物還原制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法相比，本發(fā)明的基因工程菌整細(xì)胞可以在不額外添加輔酶的情況下， 催化高濃度鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的完全轉(zhuǎn)化成單一構(gòu)型的(R)-鄰氯扁桃酸甲酯，催化效率高、立體選擇性強(qiáng)。在不加入輔酶的情況下，50g/L凍干細(xì)胞可以催化400g/L鄰氯苯甲酰甲酸甲酯完全轉(zhuǎn)化生成光學(xué)純的(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。若在加入lmmol/L輔酶的情況下， 30g/L凍干細(xì)胞可以完全轉(zhuǎn)化600g/L鄰氯苯甲酰甲酸甲酯生成光學(xué)純的(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。本發(fā)明的方法是目前為止生物還原法制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯生產(chǎn)效率最高的方法。由于反應(yīng)體系中不需要額外添加價(jià)格昂貴的輔酶，極大地降低了生產(chǎn)的成本，且反應(yīng)條件溫和，對(duì)環(huán)境友好，操作簡(jiǎn)便，在合成暢銷藥物氯吡格雷的手性中間體方面具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為醛酮還原酶基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。其中，1、醛酮還原酶基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；2、Marker (Marker II，北京天根生化科技有限公司)。圖2為葡萄糖脫氫酶基因的擴(kuò)增圖譜。其中，1、葡萄糖脫氫酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；2、 DNA Marker (Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。圖3質(zhì)粒pET28a_AKR的單酶切分析圖譜。其中，l、pEI^8a_AKR單酶切產(chǎn)物；2、DNA Marker (Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。圖4為重組質(zhì)粒pET28a-AKR_GDH的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。下列實(shí)施例中材料的來源為表達(dá)質(zhì)粒pET28a購(gòu)自上海Novagen公司。E.coli DH5a 和 Ε. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，2XTaq PCR MasterMix，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。Clone EZ重組克隆試劑盒購(gòu)自GeMcript公司。實(shí)施例1 4過程如圖4所示。實(shí)施例1醛酮還原酶基因的克隆根據(jù)Genbank中已收錄的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)的還原酶ytbE 的基因序列(Gene ID 937984)，設(shè)計(jì)PCR引物如下:上游引物CGCGGATCCATGACAACACATTTACAAGCAAAAG ；下游引物CCGGTCGAGTTAAAAATCAAAGTTGTCCGGATC。其中，上游引物下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物下劃線部分為BioI酶切位點(diǎn)。以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168(從美國(guó)俄亥俄州州立大學(xué)桿狀菌遺傳庫存中心，BGSC購(gòu)買)的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為2XI~aq PCR MasterMix 15 μ 1，上游引物和下游引物各 1 μ 1 (0. 3 μ mol/L)，DNA 模板 1 μ 1 (0. 1 μ g)禾口 ddH20 12 μ 1。PCR 擴(kuò)增步驟為⑴95°C，預(yù)變性 5min ； (2)94°C，變性 45s ； (3)60°C退火 Imin ； (4)72°C延伸Imin ；步驟(2) (4)重復(fù)35次；(5) 72°C繼續(xù)延伸lOmin，冷卻至4°C。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收700 900bp區(qū)間的目標(biāo)條帶(圖1)，即醛酮還原酶基因。
實(shí)施例2重組質(zhì)粒pET28a_AKR的制備將實(shí)施例1回收所得的醛酮還原酶基因目標(biāo)條帶在37°C用限制性內(nèi)切酶BamHI和 XhoI雙酶切12h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段。 將目標(biāo)片段在jM DNA連接酶的作用下，與同樣經(jīng)BamHI和BioI酶切后的質(zhì)粒pET28a，在 4°C下連接過夜得到重組質(zhì)粒pET28a-AKR。實(shí)施例3葡萄糖脫氫酶基因的克隆根據(jù)Genbank中已收錄的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的葡萄糖脫氫酶基因序列(Gene ID 938261)，設(shè)計(jì)特異性引物上游引物TGGTGGTGGTGGTGCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA；下游弓丨物ACTTTGATTTTTAACAAGGAGATATACATATGTATCC。以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 168的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR體系為:2XTaq PCR MasterMix 15 μ 1，上游引物和下游引物各 1 μ 1 (0. 3 μ mol/L)，DNA 模板1μ 1(0. 1μ g)和ddH20 12 μ 1。PCR擴(kuò)增步驟為⑴95°C，預(yù)變性5min ;(2)94°C，變性 45s ； (3)57 °C 退火 Imin ； (4)72 °C 延伸 Imin ；步驟(2) (4)重復(fù) 35 次；(5) 72°C 繼續(xù)延伸 IOmin,冷卻至4°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收 700 900bp區(qū)間的目標(biāo)條帶(圖幻，即葡萄糖脫氫酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例4重組質(zhì)粒pET28a-AKR_GDH的制備將實(shí)施例2中所得質(zhì)粒pET28a_AKR在37°C用限制性內(nèi)切酶BioI單酶切12h，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目標(biāo)片段(圖3)。將線性化質(zhì)粒pET28a-AKR與實(shí)施例3回收所得葡萄糖脫氫酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)條帶進(jìn)行同源重組。 反應(yīng)體系為線性化載體6μ 1，葡萄糖脫氫酶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物8μ l，10XClOneEZ緩沖液 2 μ 1，CloneEZ酶2 μ 1和ddH20 2 μ 1。將混合物在25°C放置30分鐘，冰上保持5分鐘，然后立即轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂在含50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落后，抽提所得質(zhì)粒即為重組質(zhì)粒pET28a-AKR-GDH，經(jīng)DNA測(cè)序，基因全長(zhǎng)1644bp，堿基序列如序列表中SEQ ID No 1所示。其中，從第1 第843位是醛酮還原酶基因的編碼序列，從第859 第1644位是葡萄糖脫氫酶基因的編碼序列。實(shí)施例5重組菌的制備及培養(yǎng)將實(shí)施例4所得重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化至E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜，即獲得陽性重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a-AKR-GDH。將上述所得的重組大腸桿菌接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按(ν/ν)的接種量接入裝有IOOml LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7. 0)的500ml三角瓶中，置37°C、180rpm搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600達(dá)到0. 6 時(shí)，加入終濃度為0. 5mmol/L的IPTG作為誘導(dǎo)劑，25°C誘導(dǎo)1 后，將培養(yǎng)液離心，收集細(xì)胞，并用生理鹽水洗滌兩次，將所得的靜息細(xì)胞冷凍干燥得凍干細(xì)胞。實(shí)施例6重組菌催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的不對(duì)稱還原取0. 3g實(shí)施例5所得的重組大腸桿菌的凍干細(xì)胞懸浮于IOml磷酸-磷酸鈉緩沖液(lOOmmol/L，pH 6.5)中，加入6g底物鄰氯苯甲酰甲酸甲酯，9g葡萄糖和10 μ mol NADP+。在30°C，磁力攪拌下反應(yīng)22h。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取三次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜，減壓蒸餾除去乙酸乙酯并真空干燥，即得(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。用氣相色譜(手性毛細(xì)管柱CP-Chirasil-DEX CB，載氣氮?dú)?，進(jìn)樣口溫度^(TC， 檢測(cè)器溫度280°C，柱溫180°C)和液相色譜(手性O(shè)D-H柱，流動(dòng)相正己烷/異丙醇= 97/3，流速lml/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm)分析測(cè)定底物轉(zhuǎn)化率和還原產(chǎn)物的ee值。核磁共振分析產(chǎn)物純度，旋光儀測(cè)定比旋光度。結(jié)果如下轉(zhuǎn)化率100% ；分離得率92% ；^值>
99.9% ；[ag: -187.1 (C 1.0, CHCl3)οNMR(CDCl3,500Hz) :3. 76 (s，4Η)，5· 58 (s，1Η)，
7. 25-7. 29 (m, 2H)，7. 38-7. 41 (m, 2H)。實(shí)施例7重組菌催化鄰氯苯甲酰甲酸甲酯的不對(duì)稱還原取5g實(shí)施例5所得的重組大腸桿菌的凍干細(xì)胞懸浮于IOOml磷酸-磷酸鈉緩沖液(100mmOl/L，pH 6.5)中，加入40g底物鄰氯苯甲酰甲酸甲酯，60g葡萄糖。在30°C，機(jī)械攪拌GOOrpm)下反應(yīng)5h。反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取三次，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，獲得37. 2g(R)_鄰氯扁桃酸甲酯，ee值> 99. 9%。
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權(quán)利要求
1.一種生物催化不對(duì)稱還原制備00-鄰氯扁桃酸甲酯的方法，包括在PH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表達(dá)重組還原酶和重組葡萄糖脫氫酶的基因工程菌濕菌體或其凍干細(xì)胞為催化劑，以鄰氯苯甲酰甲酸甲酯為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其特征在于，所述的重組還原酶是重組醛酮還原酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重組醛酮還原酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，氨基酸序列如序列表中SEQ. ID NO :2所示；或者是在保持由該醛酮還原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 2所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，還加入輔酶NADP+，所述的NADP+用量不超過 1. Ommol/L。
4.一種重組載體，其特征在于，含有編碼醛酮還原酶和編碼葡萄糖脫氫酶的堿基序列； 或者含有在保持由該堿基序列編碼的醛酮還原酶或者葡萄糖脫氫酶的催化活性的前提下， 由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述的編碼醛酮還原酶的堿基序列，(1)是編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO 2所示的重組醛酮還原酶的堿基序列； 或者是編碼在保持由該醛酮還原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中 SEQ. ID NO 2所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列的堿基序列；或者(2)是序列表SEQID NO 1的第1至843位所示的堿基序列；或者是在保持由該堿基序列編碼的醛酮還原酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列；所述的編碼葡萄糖脫氫酶的堿基序列，(1)是編碼氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO 3所示的重組葡萄糖脫氫酶的堿基序列；或者是編碼在保持由該葡萄糖脫氫酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替換如序列表中SEQ. ID NO 3所示的氨基酸序列中至少一個(gè)氨基酸而得到的變異的氨基酸序列的堿基序列；(2)是序列表SEQID NO 1的第859至1644位所示的堿基序列；或者是在保持由該堿基序列編碼的葡萄糖脫氫酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替換該堿基序列中至少一個(gè)堿基而得到的變異的堿基序列。
6.如權(quán)利要求4或5所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體是質(zhì)粒pET28a。
7.一種基因工程菌，其特征在于，包含如權(quán)利要求4 6任一項(xiàng)所述的重組載體。
8.如權(quán)利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌為大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7或8所述的基因工程菌在生物催化不對(duì)稱還原鄰氯苯甲酰甲酸甲酯制備00-鄰氯扁桃酸甲酯中的應(yīng)用。
10.一種發(fā)酵培養(yǎng)如權(quán)利要求8所述的基因工程菌的方法，其特征在于，包括將如權(quán)利要求8所述的大腸桿菌接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液的光密度0D_達(dá)到0. 5-0. 7時(shí)，加入終濃度為0. 1-lmmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續(xù)誘導(dǎo) 8-16小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物催化不對(duì)稱還原制備(R)-鄰氯扁桃酸甲酯的方法及所用的重組載體和基因工程菌。本方法包括在pH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表達(dá)重組還原酶和重組葡萄糖脫氫酶的基因工程菌濕菌體或其凍干細(xì)胞為催化劑，以鄰氯苯甲酰甲酸甲酯為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其中所述的重組還原酶是重組醛酮還原酶。本基因工程菌整細(xì)胞同時(shí)表達(dá)醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)輔酶NADP+的高效再生。因此不需要添加輔酶，就可催化高濃度鄰氯苯甲酰甲酸甲酯完全轉(zhuǎn)化成單一構(gòu)型的(R)-鄰氯扁桃酸甲酯。因輔酶價(jià)格昂貴，本發(fā)明極大的降低了生產(chǎn)成本，且反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，操作簡(jiǎn)便，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102206686SQ20111009853
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者倪燕, 李春秀, 潘江, 許建和, 馬宏敏 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)