專利名稱：一種肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬 于細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，以其作為免疫性肝損傷模型應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選。
背景技術(shù)：
免疫性肝損傷通常由生物性因素等引起，常見的原因為病毒感染，如臨床上乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒的感染，其重要的特征是肝組織內(nèi)大量的炎癥細(xì)胞浸潤，產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷。病毒侵入肝細(xì)胞后，可與肝細(xì)胞DNA整合在一起，免疫細(xì)胞或抗病毒藥物在殺滅病毒的同時，也會清除受感染的肝細(xì)胞，從而造成免疫性肝損傷。長期反復(fù)的肝損傷會導(dǎo)致疤痕狀增生、肝纖維化、肝硬化、肝腹水、甚至肝癌等。免疫性肝損傷是肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末病變發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，從正常、免疫性肝損傷到肝纖維化、肝硬化甚至到肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫性肝損傷是疾病發(fā)生的重要步驟，它決定了疾病的轉(zhuǎn)歸或發(fā)生發(fā)展。肝細(xì)胞是肝臟的主要組成部分，參與肝臟的代謝和解毒。肝細(xì)胞本身表達(dá)低水平的TLR4,保持肝臟免疫系統(tǒng)對LPS的低反應(yīng)性，這樣就可以移除體液中的內(nèi)毒素。免疫性肝損傷的最主要的特征就是肝細(xì)胞的壞死。這種壞死不是局部的，而是彌漫性的?？莘窦?xì)胞(Kupffer cells)是肝臟所包含的大量的固有巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞是由血液單核細(xì)胞發(fā)育而來的，主要集中在肝臟血竇內(nèi)。Kupffer細(xì)胞第一時間接觸腸道過來的毒素，引發(fā)肝臟炎癥反應(yīng)。Kupffer細(xì)胞表達(dá)TLR4，對清除肝內(nèi)毒素有重要作用。Kupffer細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖(LPS)的刺激下可以產(chǎn)生許多炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)白介素 8(IL-8)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)等，引起肝細(xì)胞的損傷和壞死，最終引起肝臟的炎癥反應(yīng)。TNF-α是肝臟病理、生理過程的關(guān)鍵性促炎介質(zhì)，是肝壞死較敏感的標(biāo)志物。研究表明TNF- α與慢性肝病進(jìn)展呈正相關(guān)，因此對慢性肝病患者動態(tài)觀察TNF- α的變化，可作為判斷肝臟炎癥和(或)纖維化的程度變化的有效指標(biāo)。慢性乙型肝炎患者其血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶比值(ALT)、 Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)明顯增高，其增高程度與慢性乙肝嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，通過此三項指標(biāo)綜合判斷，可較準(zhǔn)確地了解慢性乙肝病變程度及預(yù)后， AST、ALT、GGT、TNF- α等檢測已越來越廣泛被用于評估慢性乙肝的嚴(yán)重程度。ALT主要存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，是肝損傷的一個很靈敏指標(biāo)。急性肝炎時ALT升高最為顯著，其次為慢性肝炎中度，可見，ALT只能反映肝細(xì)胞的完整性，ALT增高往往說明肝實質(zhì)細(xì)胞的損傷，是急性肝炎早期最敏感的指標(biāo)，但并非在任何肝病時都有明顯改變，如爆發(fā)性肝炎病情惡化黃疽加深時，ALT反而急劇下降甚至正常，肝硬化失代償或活動期ALT 輕度增高，代償期可正常，因此，血清ALT的測定對慢性肝病的轉(zhuǎn)歸預(yù)測價值不大。AST主要存在于線粒體，病變較輕的肝病時，ALT升高程度高于AST，AST/ALT < 1. 0 ；重癥肝炎時， AST、ALT增高，AST/ALT >1.0 ；慢性肝炎，特別是肝硬化，AST、ALT也輕度增高，AST/ALT >1. O。進(jìn)行性肝功能損害常伴有AST/ALT比值增高，其與慢性乙肝的組織學(xué)分期和臨床評定相關(guān)，可提示肝病臨床類型，估計病情預(yù)后，目前已常規(guī)用于臨床診斷，但是單一檢測AST、 ALT在評估慢性肝病的嚴(yán)重程度中診斷價值有限。GGT在肝細(xì)胞內(nèi)合成，局限于細(xì)胞漿及肝內(nèi)膽管上皮中，從膽道排泄，血清中的 GGT主要來自肝臟；由于肝實質(zhì)受到擠壓，可導(dǎo)致肝細(xì)胞的炎癥，使肝細(xì)胞合成GGT增加，從而導(dǎo)致血清中GCT增高。正常血清中GGT含量較少，肝細(xì)胞漿中含量較高，故血清GGT活性測定對肝細(xì)胞損害有較高的診斷價值。在肝實質(zhì)疾病時呈輕度增高，是肝膽疾病中陽性率最高的酶，有助于肝膽疾病的鑒別診斷。在部分慢性肝炎病例，ALT、AST已降至正常，而 GGT仍異常，說明GGT檢測還可以作為觀察慢性活動性肝炎的一個指標(biāo)，也是脂肪肝較敏感的生化指標(biāo)。但GGT缺乏特異性，與ALT、AST等聯(lián)合檢測，有助于對肝病的鑒別診斷。我國是病毒性乙型肝炎發(fā)病率最高的國家之一，據(jù)統(tǒng)計我國乙肝病毒攜帶者約有 9300萬人，其中1/3出現(xiàn)肝損害的臨床表現(xiàn)，而對免疫性肝損傷的臨床治療還缺乏特效的藥物，因此，抗免疫性肝損傷藥物的快速篩選方法的研究，就尤為迫在眉梢。目前常用的免疫性肝損傷模型有整體動物模型，如卡介苗、活菌與細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的體內(nèi)免疫性肝損傷模型、自體組織與福氏佐劑誘導(dǎo)的自身免疫性肝損傷模型、以及由細(xì)胞免疫導(dǎo)致的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性肝損傷模型；體外模型如體外肝細(xì)胞免疫性損傷模型。整體動物模型雖然可信度比較高，但是耗時較長，從開始造模到實驗結(jié)束一般需要1 2個月的時間；體外肝細(xì)胞免疫性損傷模型均采用單種細(xì)胞，很難模擬體內(nèi)復(fù)雜的生理、病理狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其應(yīng)用，該共培養(yǎng)體系能夠作為包含免疫因子影響下的免疫性肝損傷模型，用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)在Millicell雙層培養(yǎng)室中添加培養(yǎng)基和1 lOOng/mL的LPS，在上層培養(yǎng) Kuffer細(xì)胞，在下層培養(yǎng)肝細(xì)胞；在培養(yǎng)箱中37°C、5% C02靜置培養(yǎng)，隔天更換一半新鮮的培養(yǎng)基，并保持LPS的濃度。所述的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，添加的LPS的濃度為5ng/mL。所述的肝細(xì)胞的培養(yǎng)濃度為1 IOX IO5個/mL，Kuffer細(xì)胞的培養(yǎng)濃度為1 10 X IO5 個/mL。所述的肝細(xì)胞是通過將體外傳代培養(yǎng)2 3的肝細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于 Millicell雙層培養(yǎng)室的下層。所述的Kuffer細(xì)胞是通過將體外單層培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞成細(xì)胞懸液接種于 Millicell雙層培養(yǎng)室的上層。 所述的Millicell雙層培養(yǎng)室在上層與下層之間設(shè)置的半透膜的孔徑為8 μ m。所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選。所述的應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選，是篩選能夠降低肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系中AST、ALT、GGT, TNF- α的活性及免疫因子分泌量的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提 供的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，是在Millicell雙層培養(yǎng)系統(tǒng)中，KupfTer細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在上層培養(yǎng)室的半透膜上，肝細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在下層培養(yǎng)室的底面上；所添加的LPS既不影響兩種細(xì)胞的增殖，又可以在更換培養(yǎng)基之后刺激KupfTer細(xì)胞和肝細(xì)胞不斷的產(chǎn)生的酶的活性(AST、ALT、GGT)及免疫因子(TNF-α )。本發(fā)明提供的肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，是在體外條件下，Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞受到LPS的刺激之后，產(chǎn)生酶(AST、ALT、GGT)及免疫因子(TNF-α )，以此來模擬肝細(xì)胞受到病毒感染之后，產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷；并以藥物對免疫因子分泌量的影響，應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選。本發(fā)明提供的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系作為篩選模型，與整體動物模型相比，具有快速培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)還能兼具免疫刺激的特性；與單種細(xì)胞的免疫性損傷模型相比， 在保持快速培養(yǎng)的基礎(chǔ)上(所添加的LPS不影響細(xì)胞增殖)，又模擬了體內(nèi)免疫因子對肝細(xì)胞的刺激。以本發(fā)明提供的肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系作為篩選模型，對部分中藥材進(jìn)行的初步篩選，結(jié)果表明，淫羊藿醇提物、黨參醇提物、白芍總皂苷、丹參脂溶部分、白術(shù)脂溶部分、人參總皂苷等均可顯著降低模型中AST、ALT、GGT、TNF-α等酶活性及免疫因子分泌量，所述藥物包含的有效組份可以作為抗免疫肝損傷藥物的備選，這也與現(xiàn)有技術(shù)指出的淫羊藿醇提物、黨參醇提物、白芍總皂苷、丹參脂溶部分、白術(shù)脂溶部分、人參總皂苷等對免疫肝損傷有較好的保護(hù)及治療作用相一致。


圖1為原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞形態(tài)觀察圖(Χ300)；圖2為原代培養(yǎng)的小鼠肝內(nèi)枯否細(xì)胞形態(tài)觀察圖(Χ300)；圖3為枯否細(xì)胞的遷移及其對肝細(xì)胞增殖的影響分析圖(Mean士SD，η = 5)；圖4為肝細(xì)胞的遷移及其對枯否細(xì)胞增殖的影響分析圖(Mean士SD，η = 5)；圖5為不同濃度LPS對肝細(xì)胞增殖的影響的曲線圖(Mean士SD，η = 5)，橫坐標(biāo)為 LPS的濃度，縱坐標(biāo)為肝細(xì)胞增殖率；圖6為不同濃度LPS對枯否細(xì)胞增殖的影響的曲線圖(Mean士SD，η = 5)，橫坐標(biāo)為LPS的濃度，縱坐標(biāo)為枯否細(xì)胞增殖率；圖7為不同濃度LPS對枯否細(xì)胞分泌TNF- α的影響曲線圖(Mean士SD，η = 5), 橫坐標(biāo)為時間的濃度，縱坐標(biāo)為TNF-α的濃度；圖8為肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞在Millicell雙層培養(yǎng)室中共培養(yǎng)的示意圖；其中 1為Millicell雙層培養(yǎng)室的上層，2為Millicell雙層培養(yǎng)室的下層。圖9a 圖9c為不同濃度LPS對共培養(yǎng)模型中AST、ALT、GGT的影響(Mean士SD， η = 5) ο
具體實施例方式下面結(jié)合肝細(xì)胞的分離純化、Kupffer細(xì)胞的分離純化、LPS添加濃度的選擇、共培養(yǎng)體系的構(gòu)建，以及對藥物的初步篩選對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。 1、肝細(xì)胞的分離純化選用正常的BALB/C小鼠，用水合氯醛(3. 5%,lmL/100g, ip)麻醉后固定體位、消毒胸腹部皮膚，打開腹膜，游離門靜脈和下腔靜脈后，距肝門約Icm處插入22號導(dǎo)管行門靜脈插管，下腔靜脈插入固定另一導(dǎo)管備用。37 °C預(yù)溫D-HanksjfW 25mL/min流速灌注，數(shù)分鐘后可見肝臟膨大，顏色均勻蒼白。剪開下腔靜脈放出積血積液，門靜脈換用含0. 025% IV型膠原酶的Hanks液迅速灌約lOmin。待肝臟韌性消失，壓迫下陷不易恢復(fù)時切斷肝周韌帶，剪下肝臟，置于4°C預(yù)冷的PBS中；劃開肝被膜，用玻璃分針輕輕梳理肝臟，以促使細(xì)胞分散。收集細(xì)胞懸液置于400目尼龍網(wǎng)上過濾，濾液即為肝臟細(xì)胞懸液.用4°C的PBS洗滌肝臟細(xì)胞3次，將細(xì)胞懸液鋪于60% Percoll液面上，4°C，200g離心15min，收集沉淀，即得到分離純化的肝細(xì)胞，加入含10%胎牛血清(10% FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)液。置37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每24小時更換培養(yǎng)基。原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖1 所示。采用0. 25%胰酶消化3 5min后進(jìn)行細(xì)胞傳代。采用臺盤蘭染色法測定小鼠肝細(xì)胞的存活率為96 士 3 %，結(jié)果表明，其細(xì)胞存活率滿足體外培養(yǎng)的要求。2.小鼠肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞的分離純化選用正?；蚪?jīng)BCG致敏12d后的BALB/C小鼠，戊巴比妥鈉皮下注射麻醉BALB/C 鼠，無菌取肝，D-Hank' s緩沖液沖洗去血，除去膽囊及非肝組織，置消毒的小玻璃瓶中用眼科剪刀剪碎，肝組織塊剪成Imm3大小。每克肝組織加IOmL 0. 05%鏈霉蛋白酶E溶液，輕輕吹打消化lOmin。200目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，100 X g離心lOmin，棄上清，D-Hank' s緩沖液清洗2遍，30% 70% Percoll分離液梯度離心15min (1000X g)，取中間層，RPMI-1640液清洗2遍，10% FCS培養(yǎng)于玻璃培養(yǎng)瓶，4h后，用RPMI-1640輕輕沖洗3次去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為分離純化的Kupffer細(xì)胞。原代培養(yǎng)的小鼠肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖2所示。 采用臺盤蘭染色法測定小鼠肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞的存活率為98 士 3 %，結(jié)果表明，其細(xì)胞存活率滿足要求。3、細(xì)胞相互間增殖和遷移的影響3. 1肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的Millicell小室共培養(yǎng)取第2 3代的肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞，用0. 25 %胰酶消化后，在不同的 Millicell(中間半透膜的微孔直徑為8μπι)下室內(nèi)加入500 μ L密度分別為1Χ106， 1 X IO5,1 X IO4個/mL的肝細(xì)胞，待其貼壁后將500 μ L Kupffer細(xì)胞以1 X IO5個/mL密度， 加入到用Millicell上層小室。所用培養(yǎng)基均為含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液，隔天換液，每次換上下室各一半溶液。另外，以相同的密度將肝細(xì)胞另外置入24孔培養(yǎng)板單獨(dú)同步培養(yǎng)作為對照組。同樣的培養(yǎng)條件下，在微孔直徑為8 μ m的Millicell下室內(nèi)加入500 μ L密度分別為1 X IO6,1 X IO5,1 X IO4個/mL的Kupffer細(xì)胞，待其貼壁后將500 μ L肝細(xì)胞以1 X IO5 個/mL密度，加入到用Millicell上層小室。隔天換液，每次換上下室各一半溶液。以相同的密度將KupfTer細(xì)胞另外置入24孔培養(yǎng)板單獨(dú)同步培養(yǎng)作為對照組。
3. 2細(xì)胞增殖和遷移的相互影響共培養(yǎng)7d后，取出上層小室，擦去Millicell濾膜上表面的細(xì)胞，吉姆薩染色，隨機(jī)計數(shù)濾膜下表面5個視野的細(xì)胞數(shù)目。下室及 對照組孔板每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 80 μ L，37°C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入500 μ L 01^0，振動10 15min，使結(jié)晶物充分溶解，30min后，分別吸取150 μ L至96孔酶標(biāo)板，全自動酶標(biāo)儀490nm處測定各孔吸光值，記
錄結(jié)果。各個濃度組別與對照組比較，判斷在共培養(yǎng)模型中，Kupffer細(xì)胞與肝細(xì)胞之間增殖和遷移的相互影響。與單獨(dú)培養(yǎng)的對照組比較，Millicell小室共培養(yǎng)模型中，Kupffer細(xì)胞(IX IO5 個/mL)對不同濃度的肝細(xì)胞的增殖沒有顯著的影響。組內(nèi)比較，不同濃度的肝細(xì)胞對 Kupffer細(xì)胞的遷移也沒有顯著的影響。具體比較如圖3所示的枯否細(xì)胞的遷移及其對肝細(xì)胞增殖的影響分析圖。與單獨(dú)培養(yǎng)的對照組比較，共培養(yǎng)模型中，肝細(xì)胞(IXlO5個/mL)對不同濃度的 Kuffer細(xì)胞的增殖沒有顯著的影響。組內(nèi)比較，不同濃度的Kuffer細(xì)胞對肝細(xì)胞的遷移也沒有顯著的影響。具體比較如圖4所示的肝細(xì)胞的遷移及其對枯否細(xì)胞增殖的影響分析圖。因此，在肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞的Millicell小室共培養(yǎng)時，肝細(xì)胞和Kuffer細(xì)胞的濃度均可采用IX IO5個/mL，兩種細(xì)胞彼此之間不影響細(xì)胞的增殖和細(xì)胞的遷移。4、采用MTT法檢測不同濃度LPS對肝細(xì)胞增殖的影響用胰蛋白酶溶液消化單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，以1 X IO4個/孔的密度接種于96孔板中，每孔體積200 μ L0 37°C 培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液；然后加入含有10%胎牛血清及不同濃度LPS(1 104ng/mL的梯度濃度)的RPMI-1640培養(yǎng)基200 μ L，對照組加入等量的助溶劑DMSO ；37°C培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20 μ L ；37°C繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液， 每孔加入150 μ L DMSO,振動10 15min，使結(jié)晶物充分溶解，30min后，全自動酶標(biāo)儀490nm 處測定各孔吸光值，記錄結(jié)果。各組與對照組比較，判斷LPS對肝細(xì)胞增殖的影響。MTT增殖實驗結(jié)果如圖5所示，其中橫坐標(biāo)為LPS的含量，縱坐標(biāo)為增加率，在濃度為1 50ng/mL的濃度范圍內(nèi)，LPS對肝細(xì)胞的沒有顯著的作用，但是隨著濃度的增加，LPS 對肝細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，與空白對照組相比有顯著性差異。5、采用MTT法檢測不同濃度LPS對Kupffer細(xì)胞增殖的影響，并檢測LPS對 Kupffer細(xì)胞分泌TNF- α的影響用含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液消化單層培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，以IX IO5個/mL的密度接種于24孔板中， 每孔體積500 μ L。37°C培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，然后加入含有10%胎牛血清及不同濃度 LPS (1 104rig/mL的梯度濃度)的RPMI-1640培養(yǎng)基lmL，對照組加入等量的助溶劑DMSO ； 37°C培養(yǎng)lld，培養(yǎng)期間隔天換液，收集被替換的培養(yǎng)基。另設(shè)置LPS(5ng/mL)附加實驗組， 除換液方法不一樣以外(隔天換培養(yǎng)基一半，收集被替換的培養(yǎng)基)，其它操作相同。在培養(yǎng)Ild之后，MTT法檢測不同濃度LPS對KupfTer細(xì)胞增殖的影響；取隔天替換的培養(yǎng)基，ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中前炎癥因子TNF-α的含量，按照試劑盒的使用說明進(jìn)行操作。MTT增殖實驗結(jié)果如圖6所示，其中橫坐標(biāo)為LPS的含量，縱坐標(biāo)為增加率；在濃度為1 lOOng/mL的濃度范圍內(nèi)，LPS對Kupffer細(xì)胞增殖沒有顯著的作用，但是隨著濃度的增加，LPS對Kupffer細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，但與空白對照組相比，沒有顯著性差異。采用ELISA法測定培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量，結(jié)果如圖7所示的不同LPS的添加量在2 12天培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量分析；靜息狀態(tài)下，Kupffer細(xì)胞分泌較少量的 TNF- α (85. 7 69. 2pg/mL)，10 μ g/mL 的 LPS 能顯著刺激 Kupffer 細(xì)胞 TNF- α 的分泌(589. 6士29. 7pg/mL)，隨著時間的增加，其分泌量迅速減少，在dll時，其分泌量僅為 65. 9 士8. 5pg/mL。5ng/mL 的 LPS 刺激 Kupffer 細(xì)胞 TNF- α 的分泌量在 212. 4 86. 8pg/ mL之間，隨著時間的增加，其分泌量逐漸減少。而附加組(5ng/mL的LPS，隔天換一半的培養(yǎng)基)在d3 dll間，其細(xì)胞上清液中一直保持較高濃度的、較穩(wěn)定量的TNF-a (207. 3 116. 8pg/mL)。6、肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立以及不同濃度LPS對共培養(yǎng)模型中 AST、ALT、GGT 的影響根據(jù)以上細(xì)胞增殖及遷移實驗和ELISA的實驗結(jié)果，建立如圖8所示的肝細(xì)胞和 Kupffer細(xì)胞在Millicell小室的共培養(yǎng)模型在Millicell雙層培養(yǎng)室中添加培養(yǎng)基和5 50ng/mL的LPS，在上層培養(yǎng)小室1 中培養(yǎng)Kuffer細(xì)胞，在下層培養(yǎng)小室2中培養(yǎng)肝細(xì)胞；在培養(yǎng)箱中37°C、5% CO2靜置培養(yǎng)， 隔天更換一半新鮮的培養(yǎng)基，并保持LPS的濃度。用含0. 02% EDTA的胰蛋白酶溶液消化單層培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配成單個細(xì)胞懸液，以IX IO5個/mL的密度接種于24孔板中， 每孔體積500 μ L。37°C培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，然后加入含有10%胎牛血清及不同濃度 LPS (1 104rig/mL的梯度濃度)的RPMI-1640培養(yǎng)基lmL，對照組加入等量的助溶劑DMSO ； 37°C培養(yǎng)lld，培養(yǎng)期間隔天換液，收集被替換的培養(yǎng)基。另設(shè)置LPS(5ng/mL)附加實驗組， 除換液方法不一樣以外(隔天換培養(yǎng)基一半，收集被替換的培養(yǎng)基)，其它操作相同。取隔天替換的培養(yǎng)基，采用試劑盒檢測共培養(yǎng)上清液中AST、ALT和GGT的含量，具體按照試劑盒的使用說明進(jìn)行操作。不同濃度的LPS在2 12天對AST、ALT和GGT的含量的變化影響分別如圖9a、圖9b、圖9c所示。不同濃度的LPS對肝細(xì)胞的增殖均沒有顯著的影響，各實驗組中不同濃度的LPS均可引起共培養(yǎng)模型中AST、ALT和GGT的含量的升高， 當(dāng)LPS的濃度大于lOOng/mL時，細(xì)胞產(chǎn)生了大量的酶，但是隨著時間的增加，細(xì)胞上清液中酶的活性顯著降低。綜合考慮LPS對三種酶活性的影響，確定添加LPS的濃度為5ng/mL。共培養(yǎng)模 型的培養(yǎng)基添加為含有5ng/mL的LPS、10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，5% CO2 培養(yǎng)箱37°C靜置培養(yǎng)，隔天更換一半培養(yǎng)基。在這種環(huán)境下，共培養(yǎng)模型能夠持續(xù)的分泌 TNF-α等炎癥細(xì)胞因子并產(chǎn)生AST、ALT和GGT等酶，在共培養(yǎng)上清液中能一直保持較高濃度的、較穩(wěn)定量的TNF- α，并保持AST、ALT和GGT等酶的活性。從而更好地模擬肝臟受到病毒感染之后，產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷。
建立共培養(yǎng)模型的具體操作過程為在Millicell雙層培養(yǎng)室的上層培養(yǎng)Kuffer 細(xì)胞(培養(yǎng)濃度為IO5個/mL)，在下層培養(yǎng)肝細(xì)胞(培養(yǎng)濃度為IO5個/mL)；以10% FCS 的RPMI-1640培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，于實驗的第3天開始更換含有5ng/mL的LPS、10% FCS的 RPMI-1640培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱37°C靜置培養(yǎng)，隔天更換一半培養(yǎng)基，更換的培養(yǎng)基中含有10% FCS和5ng/mL LPS的RPMI-1640培養(yǎng)液。7、采用共培養(yǎng)模型對秦巴山區(qū)的部分中藥材進(jìn)行的初步篩選部分中藥材的處理方法及過程如下。淫羊藿8倍量75%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇得醇提物；黨參8倍量75%乙醇加熱回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇得醇提物；白芍10倍量70 %乙醇加熱回流提取2次，每次2h，合并提取液，過濾，濾液通過 DlOl大孔吸附樹脂，先用0. 5%氨水洗柱，再用水洗至中性，再用70%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1. 20 1. 25，得浸膏，浸膏于70°C減壓干燥，即得白芍總皂苷(其中芍藥苷的含量約為31. 0% )；丹參丹參藥材中加入7倍體積95%乙醇提取2次，每次提取2d，合并上清液、減壓濃縮，干燥，得到丹參脂溶部分。白術(shù)取粒度為80目的白術(shù)(炒)粉末，置索氏提取器中，加入3倍量的石油醚， 于水浴鍋上回流提取2次，每次提取12h，合并提取液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得白術(shù)脂溶部分。人參人參藥材加入20倍體積70%乙醇，水浴回流提取2次，提取溫度為70°C，提取時間為3h，合并兩次提取液，離心、過濾、濃縮，加入95%乙醇置于4°C 2h，離心、過濾、回收乙醇、用乙醚萃取脫脂，水層用水飽和正丁醇反復(fù)萃取，正丁醇層減壓回收正丁醇，冷凍干燥得人參總皂苷。取上述各樣品以適量二甲基亞砜助溶，用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成濃度分別為 lmg/mL的溶液，0.22μπι的微孔濾膜過濾除菌，得樣品溶液。對照組加入等量的助溶劑 DMSO0采用共培養(yǎng)模型，37°C培養(yǎng)2d后，吸棄上下小室的培養(yǎng)液，上、下室同時加入分別含有10%小牛血清、5ng/mL LPS及不同濃度的樣品(1 100 μ g/mL，DMSO助溶)的 RPMI-1640培養(yǎng)液500 μ L，陽性對照組為聯(lián)苯雙酯(10 μ g/mL, DMSO助溶)，陰性對照組加入等量的助溶劑DMS0。隔天換液，吸棄上、下室各一半溶液，并加入各組含藥培養(yǎng)基。于培養(yǎng)的第11天觀察細(xì)胞形態(tài)變化，吸取上、下小室的培養(yǎng)液，分別測定培養(yǎng)液中TNF-α、AST、 ALT、GGT等酶的活性及細(xì)胞因子的量。TNF-α的測定采用ELASA試劑盒，AST、ALT及GGT 的活性均按試劑盒操作說明書測定。實驗結(jié)果如表1所示。表1中藥提取物對共培養(yǎng)模型中細(xì)胞因子和酶活性的影響(Mean士SD，η = 5)
權(quán)利要求
1.一種肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，在Mi 11 icel 1雙層培養(yǎng)室中添加培養(yǎng)基和1 lOOng/mL的LPS，在上層培養(yǎng)Kuffer細(xì)胞，在下層培養(yǎng)肝細(xì)胞；在培養(yǎng)箱中37°C、5% CO2靜置培養(yǎng)，隔天更換一半新鮮的培養(yǎng)基，并保持LPS的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)基為含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，添加的LPS的濃度為5ng/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的肝細(xì)胞的培養(yǎng)濃度為1 X IO5個/mL，Kuffer細(xì)胞的培養(yǎng)濃度為1 X IO5個/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的肝細(xì)胞是通過將體外傳代培養(yǎng)2 3的肝細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于Millicell雙層培養(yǎng)室的下層。
5.如權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的 Kuffer細(xì)胞是通過將體外單層培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞成細(xì)胞懸液接種于MiIlicell雙層培養(yǎng)室的上層。
6.如權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的 Millicell雙層培養(yǎng)室在上層與下層之間設(shè)置的半透膜的孔徑為8 μ m。
7.權(quán)利要求1所述的肝細(xì)胞與KupfTer細(xì)胞共培養(yǎng)體系應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的蹄選。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗免疫性肝損傷藥物的篩選，是篩選能夠降低肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系中AST、ALT、GGT、TNF-α的活性及免疫因子分泌量的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系及其應(yīng)用，該共培養(yǎng)體系是在Millicell雙層培養(yǎng)室中，在培養(yǎng)基上添加1～100ng/ml的LPS，在Millicell雙層培養(yǎng)室的上層培養(yǎng)Kuffer細(xì)胞，在下層培養(yǎng)肝細(xì)胞；隔天更換一半新鮮的培養(yǎng)基，保持LPS的濃度。本發(fā)明提供的肝細(xì)胞與Kupffer細(xì)胞共培養(yǎng)體系，是在體外條件下，Kupffer細(xì)胞受到LPS的刺激之后，持續(xù)的分泌炎癥細(xì)胞因子(如TNF-α)，肝細(xì)胞在此環(huán)境中，可產(chǎn)生大量的酶(如AST、ALT和GGT)，以此來模擬體內(nèi)肝組織受到病毒感染之后，產(chǎn)生免疫/炎癥應(yīng)答，導(dǎo)致免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的肝損傷；并以藥物對免疫因子分泌量及酶活性的影響，應(yīng)用于抗免疫性肝損傷藥物的篩選。
文檔編號C12N5/071GK102220281SQ20111009814
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者劉海靜, 張秉華, 戴涌, 李霞, 王發(fā), 王嫦鶴, 賈麗華, 郭歡迎 申請人:陜西省食品藥品檢驗所