專利名稱：調(diào)節(jié)植物脅迫抗性的cbf轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物抗逆性相關(guān)的CBF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因，尤其涉及從沙冬青 (Ammopiptanthus mongolicus)中所分離到的調(diào)節(jié)植物脅迫抗性的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因及其編碼蛋白，本發(fā)明還涉及它們在提高植物脅迫抗性中的應用，屬于與植物耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低溫和干旱是全球性的影響植物生長、限制作物產(chǎn)量的非生物脅迫因子。低溫寒害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種嚴重自然災害，世界每年因此造成的損失十分巨大，據(jù)估計達2000 億美元。植物抗寒性機理研究不僅在理論上有重要意義，在生產(chǎn)上也有廣泛的應用價值。 通過低溫寒害的研究不僅可以知道植物是如何感受環(huán)境因子的變化并產(chǎn)生相對應的抗性， 而且對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐具有重要的指導作用。因此，培育具有抗寒能力的作物成為農(nóng)業(yè)上的一個重要課題。傳統(tǒng)的植物育種方法培育出了許多的抗寒品種，以化學調(diào)控的方法來提高植物的抗寒力也有一定的效果，而植物基因工程的發(fā)展則為培養(yǎng)抗寒作物提供了一條嶄新的途徑。在植物抗寒分子生物學研究中，人們鑒定和分離了一些抗寒基因和蛋白， 如擬南芥中的C0R15a，苜蓿的casl5，小麥的wcal20，大麥的HVAl (Thomashow MF. Plant cold acclimation :Freezing tolerance genes and regulation mechanisms. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 1999,50 :571 599.), 以及從北極海域魚類分離的抗凍基因AFP(Chakrabartty A, et al. Structure-function relationships in a winter flounder antifreeze polypeptide. J Biol Chem 1989, 264(18) :11307 1131 。人們將這些基因轉(zhuǎn)入植物中希望能提高作物的抗寒能力，但單個基因的轉(zhuǎn)入往往結(jié)果不理想，僅能部分改善抗寒能力。作物的抗寒性狀是由多基因控制的，只有成簇抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，才能有效提高作物的抗寒能力，因此克隆并鑒定調(diào)控抗寒功能基因表達的轉(zhuǎn)錄因子成為這一研究領(lǐng)域的熱點。轉(zhuǎn)錄因子，也稱反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制其他基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子有兩種不同的類型。一種叫做普遍性轉(zhuǎn)錄因子 (general transcription factor)，能激活所有啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，另一種叫做特異性轉(zhuǎn)錄因子(specific transcription factor)，只能激活特定基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。植物許多誘導型基因定時、定量及定位表達，都由特定的轉(zhuǎn)錄因子與特定的順式作用元件相互作調(diào)控。近年來，相繼從高等植物中分離出一系列調(diào)控低溫、干旱、高鹽、激素、病原反應及發(fā)育等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，轉(zhuǎn)錄因子一般由DNA結(jié)合區(qū) (DNA-binding domain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(transcription regulation domain)、寡聚化位點 (oligomerization site)以及核定位信號(nuclear localization signal, NLS)四個功能區(qū)組成(吳乃虎.基因工程原理(下冊)(第二版).北京科學出版社.2002)。這些功能區(qū)決定轉(zhuǎn)錄因子的功能、特性、核定位以及調(diào)控作用等，通過這些功能區(qū)與啟動子順式作用元件結(jié)合或與其它蛋白的相互作用來激活或抑制基因的表達。CBFs(C-r印eat Binding Factors)就是這樣的一類轉(zhuǎn)錄因子，通過在植物冷馴化過程中的表達來提高植物的抗寒能力。CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠識別CRT/DRE元件，調(diào)控多個與同類性狀有關(guān)的基因表達，在提高植物對環(huán)境脅迫耐性的分子育種中，改良或增強一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力，可以使植物的耐逆性得到較為綜合的改良。許多熱帶起源的植物，如西紅柿、玉米、水稻、棉花，都不能忍受冷環(huán)境，0°C 12°C就能造成傷害，這些植物中也相繼證實有CBF基因存在。CBF 是一個基因家族，其成員的表達機制不同。CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子特異識別結(jié)合CRT/DRE元件， 調(diào)控一系列干旱低溫應答基因表達，這些基因所編碼的產(chǎn)物使植物適應或抵御逆境。另外， 超表達CBF3的擬南芥耐旱耐寒，而耐性的提高，不僅與CRT/DRE基因的表達增強有關(guān)，還與脯氨酸和糖含量的升高有關(guān)。植物在長期的進化過程中，在低溫、干旱等環(huán)境脅迫下，會誘導多種基因表達并發(fā)生一系列的生理生化變化，從而對脅迫作出積極反應。逆境脅迫誘導表達的基因產(chǎn)物，按其作用可分成兩大類。作物的抗寒和耐旱性狀由多基因控制，只有成簇抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，才能有效提高作物的抗寒和耐旱能力。CBF轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下激活，調(diào)控一系列低溫干旱應答基因表達，使植物適應或抵御逆境。有研究證明，CBF冷反應途徑的組成因子在開花植物中高度保守，轉(zhuǎn)CBF的轉(zhuǎn)基因植株對低溫、干旱和鹽脅迫的抗性明顯增強。中國北方寒冷地區(qū)主要的糧食作物(如水稻、小麥)、經(jīng)濟作物(如棉花、煙草) 在生長發(fā)育期都存在低溫寒害問題，而這些作物的抗寒機制的研究非常有限。研究CBF在這些作物中家族成員數(shù)量，不同CBF基因問如何相互作用以及與冷、干旱等逆境的關(guān)系， CBF啟動子區(qū)域有哪些基元和核心序列等方面開展研究將對實際生產(chǎn)有很重要的現(xiàn)實指導
眉、ο沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是一種國家重點保護的珍稀瀕危豆科植物，也是迄今為止中國溫帶荒漠的唯一珍貴常綠灌木。沙冬青是優(yōu)良的固沙植物，具有抗熱、抗旱、抗寒、耐鹽堿、耐貧瘠、耐沙埋、抗風蝕等特性，適應性很強，能在地表溫度高達 70°C，氣溫在-20 -30°C，年降雨量不足200mm的環(huán)境中正常生長，因此是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源，是進行抗寒/抗旱研究的理想材料。目前關(guān)于沙冬青的研究主要在生理生化層面上，還沒有關(guān)于基因調(diào)控的報道。針對它開展CBFs基因的研究，并與喜溫作物棉花的 CBFs基因相比較，預計有可能解析和發(fā)現(xiàn)一些新的基因、調(diào)控元件和調(diào)控機理，對了解不同植物的CBFs基因及其調(diào)控網(wǎng)絡以及通過基因工程改良作物的抗逆能力有重要的理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種來源于沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)能夠識別CRT/DRE元件、提高植物對環(huán)境脅迫抗性的CBF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明目的之二是提供含有上述編碼基因的表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。本發(fā)明目的之三是將所述的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因應用于提高或改善植物的抗逆性。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種從沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中所分離的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因，其核苷酸為(a)、(b)或(c)所示(a)、SEQ ID No. 1 所示的核苷酸；(b)、編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸的核苷酸；(c)、與SEQ ID NO 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸為SEQ ID N0:2所示。所述“嚴謹雜交條件”意指在所屬領(lǐng)域中已知的低離子強度和高溫的條件。通常，在嚴謹條件下，探針與其靶序列雜交的可檢測程度比與其它序列雜交的可檢測程度更高(例如超過本底至少2倍。嚴謹雜交條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境條件下將會不同，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。通過控制雜交的嚴謹性或洗滌條件可鑒定與探針100%互補的靶序列。對于核酸雜交的詳盡指導可參考有關(guān)文獻(Tijssen， Techniques in Biochemistry and Moolecular Biology Hybridization with Nucleic Probes, “ Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays. 1993)。更具體的，所述嚴謹條件通常被選擇為低于特異序列在規(guī)定離子強度 PH下的熱熔點(Tm)約5-10°C。Tm為在平衡狀態(tài)下50%與目標互補的探針雜交到目標序列時所處的溫度(在指定離子強度、PH和核酸濃度下)(因為目標序列過量存在，所以在1下在平衡狀態(tài)下50%的探針被占據(jù))。嚴謹條件可為以下條件其中在pH 7.0到8.3下鹽濃度低于約1. OM鈉離子濃度，通常為約0. 01到1. OM鈉離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短探針(包括(但不限于)10到50個核苷酸)而言為至少約30°C，而對于長探針(包括 (但不限于)大于50個核苷酸)而言為至少約60°C。嚴謹條件也可通過加入諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交而言，正信號可為至少兩倍的背景雜交，視情況為10倍背景雜交。例示性嚴謹雜交條件可如下50%甲酰胺，5乂33(和SDS，在42°C 下培養(yǎng)；或5XSSC，1% SDS，在65°C下培養(yǎng)，在0. 2 X SSC中洗滌和在65°C下于0. SDS中洗滌。所述洗滌可進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的從沙冬青中所分離的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因為SEQ ID No. 1所示的核苷酸。本發(fā)明目的之二是提供由上述轉(zhuǎn)錄因子基因所編碼的能夠識別CRT/DRE元件、提高植物對環(huán)境脅迫抗性的CBF轉(zhuǎn)錄因子，其氨基酸為(a)或(b)所示(a)、SEQ ID No. 2 所示的氨基酸；(b) JfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示CBF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體；優(yōu)選的，本發(fā)明所述的CBF轉(zhuǎn)錄因子為SEQ ID No. 2所示的氨基酸。所述的“多個”通常意味著28個，優(yōu)選為M個，這取決于CBF轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的“替換”是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的“缺失”是指氨基酸殘基數(shù)量的減少，也即是分別缺少其中的一個或多個氨基酸殘基；所述的“插入”是指氨基酸殘基序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基。本發(fā)明所述的蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn)生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備CBF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列變體或片段，其中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習知。其中，保守的取代是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。因此，本發(fā)明所述的CBF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因包括天然存在的序列和變體兩種形式?！白凅w”意指基本相似的序列，對于多核苷酸，變體包含天然多核苷酸中一個或多個位點處一個或多個核苷酸的缺失、插入或/和替換。對于多核苷酸，保守的變體包括由于遺傳密碼的簡并性而不改變編碼的氨基酸序列的那些變體。諸如此類天然存在的變體可通過現(xiàn)有的分子生物學技術(shù)來鑒定。變體多核苷酸還包括合成來源的多核苷酸，例如采用定點誘變所得到的仍編碼SEQ ID No. 2所示的氨基酸的多核苷酸變體，或者是通過重組的方法 (例如DNA改組)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以下分子生物技術(shù)手段來篩選或評價變體多核苷酸所編碼蛋白的功能或活性DNA結(jié)合活性，蛋白之間的相互作用，瞬時研究中基因表達的激活情況或轉(zhuǎn)基因植物中表達的效應等。本發(fā)明提供了一種提高植物對環(huán)境脅迫抗性的方法，包括將本發(fā)明CBF轉(zhuǎn)錄因子基因引入到植物或植物細胞中，能夠有效提高目標植物對環(huán)境脅迫的抗性；例如。可以將本發(fā)明CBF轉(zhuǎn)錄因子基因引入到目標植物細胞中，培育篩選得到對環(huán)境脅迫的抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述的環(huán)境脅包括干旱、低溫等逆境。本發(fā)明還提供了含有所述CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達載體以及含有該表達載體的宿主細胞。將所述CBF轉(zhuǎn)錄因子基因可操作的與表達調(diào)控元件相連接，得到可以在植物中表達該基因的植物表達載體?！翱刹僮鞯倪B接”指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作的連接的元件可為鄰接或非鄰接的。該植物表達載體可以由5'端非編碼區(qū)，SEQ ID No. 1所示的核苷酸和3‘非編碼區(qū)組成，其中，所述的5'端非編碼區(qū)可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子可以是組成性啟動子、誘導型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的 3'非編碼區(qū)可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農(nóng)桿菌的Ti-質(zhì)粒，例如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將SEQ ID No. 1所示的核苷酸進行優(yōu)化以增強在植物中的表達。例如。可采用目標植物的偏愛密碼子進行優(yōu)化來合成多核苷酸以增強在目標植物中的表達。該植物表達載體還可含有用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的選擇性標記基因。選擇性標記基因用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞或組織。標記基因包括編碼抗生素抗性的基因以及賦予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的標記基因還包括表型標記，例如半乳糖苷酶和熒光蛋白寸。本發(fā)明還涉及將所述的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因引入到植物中以提高植物的脅迫抗性； 所述的“引入”指將CBF轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)氲街参锛毎麅?nèi)部這樣的方式將多核苷酸或多肽遺傳轉(zhuǎn)化到植物中。將所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法為本領(lǐng)域所習知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時轉(zhuǎn)化法和病毒介導法等?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指被引入的多核苷酸構(gòu)建體整合至植物細胞的基因組中并能通過其子代遺傳；“瞬時轉(zhuǎn)化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暫時性表達或存在。
轉(zhuǎn)化方案以及將所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物(單子葉植物或雙子葉植物)或植物細胞的類型而變化。將所述多核苷酸或多肽引入植物細胞的合適方法包括顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移以及高速彈道轟擊等。在特定的實施方案中，可利用多種瞬時轉(zhuǎn)化法將本發(fā)明的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因提供給植物。在其它實施方案中，本發(fā)明的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因可通過將植物與病毒或病毒核酸接觸來引入到植物中，通常，這樣的方法涉及將本發(fā)明的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因構(gòu)建體引入病毒DNA 或RNA分子中。利用常規(guī)方法可使已轉(zhuǎn)化的細胞再生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株(McCormick et al. Plant Cell Reports. 1986. 5 :81-84)。本發(fā)明可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于單子葉植物或雙子葉植物。更優(yōu)選的，所述的目標植物包括農(nóng)作物、蔬菜或觀賞植物、果樹等，例如， 可以是玉米、水稻、高梁、小麥、大豆、馬鈴薯、大麥、番茄、菜豆、花生、甘蔗或棉花等。本發(fā)明一個最優(yōu)選的整體技術(shù)方案的詳述本發(fā)明采用RACE策略，克隆并鑒定了一個沙冬青CBF全長基因(AmCBF) (SEQ ID NO. 3)，半定量RT-PCR實驗證明該基因受低溫誘導，在冷處理Ih開始有表達，2h后表達量達最高。經(jīng)過生物信息學分析，AmCBF基因編碼蛋白(SEQ ID NO. 2)具有AP2結(jié)構(gòu)域和CBF 家族中保守特征多肽序列，屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子家族中的CBF基因家族。根據(jù)蛋白比對和蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，AmCBF與CBF在AP2結(jié)構(gòu)域存在個別氨基酸位點的差異，推測可能會影響CBF轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合能力。將AmCBF基因構(gòu)建到CaMV35S啟動子驅(qū)動的植物表達載體，以葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，并進行轉(zhuǎn)基因分子鑒定。在冷處理后，轉(zhuǎn)AmCBF基因煙草的脯氨酸和可溶性糖含量都比野生型有明顯的提高。這說明AmCBF的表達促進COR等基因的轉(zhuǎn)錄，進而引起脯氨酸和可溶性糖這樣的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成。脯氨酸和可溶性糖都是滲透調(diào)節(jié)劑，可以提高原生質(zhì)的滲透壓，防止水分散失，防止細胞內(nèi)各種酶蛋白在滲透脅迫下脫水，維持細胞膜和蛋白質(zhì)正常功能和活性，進而增強植物耐逆性。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草電解質(zhì)滲漏率在0 -6°C — 直低于野生型煙草，在_8°C大幅度上升，表明在_8°C轉(zhuǎn)基因煙草細胞膜開始受到破壞，細胞內(nèi)溶物釋放，胞外溶液電導率大幅提高。而野生型煙草在_6°C電導率就已經(jīng)很高，細胞膜已經(jīng)受破壞。說明轉(zhuǎn)AmCBF煙草耐冷性有明顯提高。轉(zhuǎn)AmCBF基因煙草的耐旱性試驗表明，轉(zhuǎn)基因植株的干旱耐受性明顯比野生型強。在PEG模擬的干旱條件，無論是強啟動子還是弱啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草都表現(xiàn)出比野生型更強的耐干旱能力。業(yè)已證明低溫和脫水反應的信號傳導途徑具有許多共同之處，形成復雜的相互聯(lián)系的信號網(wǎng)絡(Yang Tff, Zhang LJ, Zhang TG, Zhang H，Xu SJ, An LZ. Transcriptional regulation network of cold-responsive genes in higher plants. Plant Science 2005,196(6) :987 995.)。因此，在轉(zhuǎn)基因煙草植株中 AmCBF 超表達綜合地激活了低溫馴化反應中的多個組分的表達，脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量也明顯上升，使轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性有明顯的提高。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。
術(shù)語“重組宿主細胞株”或“宿主細胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細胞，而不管使用何種方法進行插入以產(chǎn)生重組宿主細胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導、f配對或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞，宿主細胞還可為單子葉或雙子葉植物細胞。術(shù)語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括 PNA(肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人，Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608(1985)；和 Cassol 等人，(1992) ；Rossolini 等人，Mol Cell. Probes 8 :91-98(1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用以意指氨基酸殘基的聚合物。艮口， 針對多肽的描述同樣適用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述術(shù)語適用于天然產(chǎn)生氨基酸聚合物以及其中一個或一個以上氨基酸殘基為非天然編碼氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，其包括全長蛋白(即抗原)，其中氨基酸殘基經(jīng)由共價肽鍵連接。


圖 1 3，race 的片段 M IOObp Ladder，1 :3，race 第一輪擴增片段，2 :3，race 第二輪擴增片段。圖 2 5，race 的片段 M IOObp Ladder, 1 :5，race 第一輪擴增片段，2 :5，race 第二輪擴增片段。圖3沙冬青CBF全長基因序列及DNAMAN分析得到的蛋白質(zhì)序列。圖4CBF蛋白保守序列比對結(jié)果；黑點所示為CBF保守特征序列，直線所示為AP2 結(jié)構(gòu)域。圖5沙冬青CBF系統(tǒng)發(fā)育樹。圖6沙冬青CBF低溫誘導下半定量RT-PCR結(jié)果；㈧AmCBF基因3’端片段擴增結(jié)果(B) β-actin擴增結(jié)果。圖7植物表達載體的構(gòu)建示意圖。圖8⑶S組織化學染色；1-4 :35S: AmCBF轉(zhuǎn)基因煙草；5 野生型對照。圖9轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定；1-8 :35S:AmCBF轉(zhuǎn)基因植株；9 質(zhì)粒對照；10 野生型煙草對照；11 水對照。圖10轉(zhuǎn)基因煙草的半定量RT-PCR鑒定；1_5 :35S:AmCBF轉(zhuǎn)基因植株；6 野生型對照。圖11相對電導率法檢測轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性。
圖12游離脯氨酸含量檢測結(jié)果。圖13可溶性糖含量檢測結(jié)果。圖14轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例1. 1實驗材料1. 1. 1植物材料植物材料為蒙古沙冬青幼苗，種子由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所裴新梧研究員提供。種子經(jīng)50 60°C溫水浸種Mh，去除秕粒，冷水浸泡1晝夜，期間換清水2 3 次。吸脹后種子撈至0. 5% KMn04溶液浸泡消毒30min，清水洗凈，放入育苗培養(yǎng)箱，上覆紗布。每天向紗布噴水2 3次，經(jīng)常翻動種子，使之出芽均勻，保持溫度20 25°C，4 6 天全部出芽完畢。挑選種子播種于育苗容器，每盆2 3粒，上覆蛭石1 1. 5cm，適量補水，7 10天后出苗完成。將沙冬青幼苗放置于低溫光照培養(yǎng)箱，在溫室中生長14d的沙冬青幼苗，放入低溫培養(yǎng)箱，光照強度3001ux，分別在4°C處理0，15min, 30min, lh，2h，4h，8h， 16h，Mh，各提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA為模板，在3’端附近片段設計特異引物進行 RT-PCR擴增實驗，內(nèi)參基因為β-actin。由實驗室保存的栽培型煙草NC89作為植物轉(zhuǎn)化材料。1.1. 2引物和測序引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成(1)，測序工作由三博遠志生物技術(shù)有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學院重大科學工程樓開放實驗室完成。表1合成引物列表
權(quán)利要求
1.分離的CBF轉(zhuǎn)錄因子基因，其特征在于，其核苷酸為(a)、(b)或(c)所示(a)、SEQID No. 1所示的核苷酸；(b)、編碼SEQID No. 2所示氨基酸的核苷酸；(C)、與SEQ ID NO: 1的互補序列在嚴謹雜交條件能夠進行雜交的核苷酸，該核苷酸所編碼蛋白具有CBF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性。
2.分離的CBF轉(zhuǎn)錄因子全基因，其特征在于其為SEQID No. 3所示的核苷酸。
3.權(quán)利要求1所述CBF轉(zhuǎn)錄因子基因所編碼蛋白，其特征在于，其氨基酸為(a)或(b) 所示(a)、SEQID No. 2所示的氨基酸;(b)JfSEQ ID No. 2所示的氨基酸通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/ 和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No. 2所示CBF轉(zhuǎn)錄因子功能或活性的蛋白變體。
4.含有權(quán)利要求1或2所述基因或全基因的表達載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于所述表達載體是植物表達載體。
6.含有權(quán)利要求4或5所述表達載體的宿主細胞。
7.權(quán)利要求1所述的基因或權(quán)利要求2所述全基因在提高植物對環(huán)境脅迫抗性中的應用。
8.按照權(quán)利要求7所述的應用，包括構(gòu)建含有權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述全基因的植物表達載體；將所構(gòu)建的植物表達載體引入到植物或植物細胞中，培育篩選得到對環(huán)境脅迫抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
9.權(quán)利要求3所述的蛋白在提高植物對環(huán)境脅迫抗性中的應用。
10.按照權(quán)利要求7、8或9所述的應用，其特征在于所述的環(huán)境脅迫包括干旱或低
全文摘要
本發(fā)明公開了調(diào)節(jié)植物脅迫抗性的CBF轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因和應用。本發(fā)明采用 RACE策略從沙冬青中克隆并鑒定了一個CBF全長基因，半定量RT-PCR實驗證明該基因受低溫誘導在冷處理1h開始有表達，2h后表達量達最高。經(jīng)生物信息學分析，AmCBF基因編碼蛋白具有AP2結(jié)構(gòu)域和CBF家族中保守特征多肽序列，屬于AP2/EREBP類轉(zhuǎn)錄因子家族中的CBF基因家族。與野生型煙草相比，在冷處理后轉(zhuǎn)AmCBF基因煙草葉片的電解質(zhì)滲漏率明顯降低，脯氨酸含量、可溶性糖含量都有明顯提高，證明耐寒性增強。耐旱性實驗表明,轉(zhuǎn)基因煙草的干旱耐受能力也有很大提高。實驗結(jié)果表明AmCBF能夠響應逆境信號并發(fā)揮作用。
文檔編號C12N1/15GK102191254SQ201110095268
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者張晗, 程紅梅, 郭惠明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所