專利名稱：利用α-亞麻酸抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用α-亞麻酸抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
亞麻酸英文名，linolenic acid，是一種含有三個(gè)雙鍵的多不飽和脂肪酸。因雙鍵位置不同分為α-亞麻酸和γ-亞麻酸。α -亞麻酸，化學(xué)分子式為順-9-順-12-順-15——十八碳三烯酸(C18H3tlO2)，分子量278. 43。CAS :463-40-1 ；結(jié)構(gòu)式α -亞麻酸是人體必須脂肪酸的一種，它也是植物受到脅迫時(shí)產(chǎn)生信號(hào)分子的一種前體分子。黃曲霉毒素是自然界存在的毒性和致癌性最高的化合物之一。農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染嚴(yán)重威脅食品安全，而且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)黃曲霉菌和毒素的研究近半個(gè)世紀(jì)，已經(jīng)闡明了與毒素合成有關(guān)的基因簇，并且發(fā)現(xiàn)除了外界環(huán)境因子外，脂類在黃曲霉毒素合成的過(guò)程中也起著重要的作用。早期研究顯示脂類合成與毒素合成密切相關(guān)。脂肪酸合成的第一步就是在乙酰輔酶A羧化酶的作用下，將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)楸］o酶Α。有研究顯示在毒素合成過(guò)程中需要丙二酰輔酶A參與并由此形成毒素合成的重要前體己二酰輔酶Α。反之，脂類的分解代謝同樣參與調(diào)節(jié)毒素合成。有研究選取含油量不同的植物種子，檢測(cè)它們對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒量與作物含油量呈正相關(guān)的關(guān)系， 例如在含油量最高的花生中檢測(cè)到最高量的毒素；另外，比較植物種子粉末脫脂與否對(duì)毒素合成的影響發(fā)現(xiàn)，未脫脂的比脫脂的種子粉末更促進(jìn)毒素合成。棉花種子存儲(chǔ)的脂類作為唯一碳源僅會(huì)少量促進(jìn)黃曲霉菌產(chǎn)毒，但將脂質(zhì)成分去除則會(huì)明顯抑制毒素合成。以上研究說(shuō)明，脂類對(duì)于黃曲霉菌產(chǎn)毒是必要條件但非充分條件?，F(xiàn)在研究認(rèn)為植物脂類成分中的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸直接或間接地誘導(dǎo)毒素合成，其分子機(jī)制并不清楚，一種假說(shuō)認(rèn)為黃曲霉菌將從植物種子中獲取的脂類前體存儲(chǔ)在胞質(zhì)內(nèi)的脂肪體中，通過(guò)氧化產(chǎn)生乙酰輔酶Α，最終產(chǎn)生黃曲霉毒素。另外，脂肪酸的氧化產(chǎn)物作為信號(hào)分子同樣參與調(diào)控毒素合成。長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸在氧氣的作用下，會(huì)產(chǎn)生一類叫做Oxylipins的次生代謝物。Oxylipins可以作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)動(dòng)物、植物、真菌發(fā)育的許多過(guò)程，其中包括調(diào)節(jié)動(dòng)物的再生、植物的防御反應(yīng)以及真菌的生命周期控制和次生代謝。真菌中的Oxylipins主要通過(guò)脂肪酸氧化酶催化產(chǎn)生，在構(gòu)巢霉菌中發(fā)現(xiàn)三個(gè)脂肪酸氧化酶(pp0A，pp0B，pp0C)負(fù)責(zé)Oxylipins的合成。植物來(lái)源的Oxylipins主要通過(guò)三個(gè)途徑產(chǎn)生脂氧化酶(LOX)生物合成途徑；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的細(xì)胞色素P450酶；雙氧化酶。真菌的Oxylipins主要由亞油酸、亞麻酸及油酸產(chǎn)生；而植物的Oxylipins主要由亞麻酸、亞油酸及十六碳三烯酸氧化產(chǎn)生。Oxylipins在植物和病原菌的互作中扮演重要的角色。真菌侵染植物種子后，種子應(yīng)激性地激活轉(zhuǎn)錄脂氧化酶基因，導(dǎo)致Oxylipins水平發(fā)生變化，植物脂氧化酶(LOX)分別氧化亞麻酸和亞油酸形成13S-HP0DE 或13S-HP0TE，隨后被進(jìn)一步代謝為茉莉酸，茉莉酸誘導(dǎo)編碼植物防御蛋白或防御性次生代謝物的基因表達(dá)。Oxylipins同樣參與調(diào)控毒素合成。茉莉酸甲酯是植物中發(fā)現(xiàn)的一種茉莉酸，有關(guān)茉莉酸甲酯對(duì)毒素合成的影響有截然相反的報(bào)道，而13S-HP0DE或13S-HP0TE本身及其衍生的醛類代謝物抑制毒素合成，其異構(gòu)體9S-HP0DE卻促進(jìn)黃曲霉毒素形成。但是對(duì)于這些Oxylipins產(chǎn)物的作用機(jī)制并不是很清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在抑制黃曲
霉毒素產(chǎn)生中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生中的應(yīng)用。所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素Bl或黃曲霉毒素G1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在制備抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了 α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在制備抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素Bl或黃曲霉毒素Gl。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的黃曲霉培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的黃曲霉培養(yǎng)方法，包括如下步驟用添加 α -亞麻酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)黃曲霉，得到培養(yǎng)物。所述α -亞麻酸在添加α -亞麻酸的培養(yǎng)基中的濃度為0. 005毫克/毫升_5毫
克/毫升。所述α -亞麻酸在添加α -亞麻酸的培養(yǎng)基中的濃度為0. 005毫克/毫升、0. 05
毫克/毫升、0. 5毫克/毫升或5毫克/毫升。IL所述培養(yǎng)基按照如下方法制備將50克葡萄糖、3克(NH4)2S04、2克 MgSO4 · 7H20、10 克 KH2PO4,700 毫克 Na2B4O7 · IOH20,680 毫克 NaMoO4 · 2H20、10 毫克 FeSO4 · 7H20、300 毫克 CuSO4 · 5Η20、1· 76 克 ZnSO4 · 7Η20 和 110 毫克 MnSO4 · H2O 溶于水中， 再加入16克瓊脂，用水補(bǔ)至1升，得到所述培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)溫度為，所述培養(yǎng)時(shí)間為3天。所述培養(yǎng)為在培養(yǎng)容器與外界進(jìn)行氣體交換條件下進(jìn)行。所述培養(yǎng)容器與外界進(jìn)行氣體交換是通過(guò)在所述培養(yǎng)容器的開(kāi)口處覆蓋透氣膜實(shí)現(xiàn)的。所述黃曲霉為黃曲霉(Aspergillusflavus)CGMCC NO. 3. 2890 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，α-亞麻酸可以抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，避免黃曲霉毒素對(duì)人類的危害，本研究利用代謝組學(xué)手段，通過(guò)比較亞麻酸處理和不處理對(duì)產(chǎn)毒與否的全景代謝物變化，從代謝水平上了解毒素產(chǎn)生與脂肪酸的關(guān)系，尋找與毒素合成相關(guān)的代謝途徑， 并通過(guò)阻斷合成途徑減少毒素的合成。


圖1為不同濃度α -亞麻酸處理組黃曲霉毒素的含量。圖2為不同時(shí)間α -亞麻酸處理組黃曲霉毒素的含量。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、α -亞麻酸抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生黃曲霉Aspergillus flavus (CGMCC NO. 3.沘90)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物所菌種保藏中心；菌種的啟動(dòng)培養(yǎng)將-80°C甘油凍存的菌種取少量均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上活化，在37°C透氣條件下培養(yǎng)4天，可以觀察到綠色的孢子產(chǎn)生。PDA培養(yǎng)基的制備方法如下稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛(煮沸30分鐘，能被玻璃棒戳破即可)，用四層紗布過(guò)濾，再加20g葡萄糖和15g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，透氣膜封口，高壓(121°C )滅菌15分鐘后取出，分裝到一次性塑料培養(yǎng)皿(9厘米直徑)，每個(gè)皿倒入25毫升無(wú)菌培養(yǎng)基，4°C冰箱貯存孢子計(jì)數(shù)(比濁法)將黃曲霉孢子用0. 05% Tween20水反復(fù)沖洗，孢子最終呈分散顆粒，倍比稀釋，分別用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并取2. 5毫升倒入比色杯中，于600nm處測(cè)定光吸收(0D值)，建立孢子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)孢子只需測(cè)定OD6tltlnm光吸收，通過(guò)計(jì)算確定孢子數(shù)。用Tween20(0.05%)水稀釋獲得密度為IX IO6孢子/毫升的孢子懸液，懸液當(dāng)天配置當(dāng)天使用。一、α -亞麻酸抑制黃曲霉菌產(chǎn)生黃曲霉毒素1升GMS固體合成培養(yǎng)基按照如下方法制備將50克葡萄糖、3克(NH4)2S04、 2 克 MgSO4 · 7H20、10 克 KH2PO4,700 毫克 Na2B4O7 · IOH20,680 毫克 NaMoO4 · 2H20、10 毫克 FeSO4 · 7H20、300 毫克 CuSO4 · 5Η20、1· 76 克 ZnSO4 · 7Η20 和 110 毫克 MnSO4 · H2O 溶于水中， 再加入16克瓊脂，用水補(bǔ)至1升，得到下層GMS固體合成培養(yǎng)基；除將16克瓊脂換成7克瓊脂外，用同樣的方法制備得到上層GMS固體合成培養(yǎng)基。將不同量的α-亞麻酸(購(gòu)于西域科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)463-40-1)溶于無(wú)水乙醇，待乙醇揮發(fā)干后添加到上層GMS固體合成培養(yǎng)基中，使α -亞麻酸在上層GMS固體合成培養(yǎng)基(上層GMS固體合成培養(yǎng)基的體積以其熔化狀態(tài)計(jì))中的濃度分別為0毫克/ 毫升、0. 005毫克/毫升、0. 05毫克/毫升、0. 5毫克/毫升、5毫克/毫升，分別得到5種培養(yǎng)基含有0毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基、含有0. 005毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基、含有0. 05毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基、含有0. 5毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基、 含有5毫克/毫升α-亞麻酸的培養(yǎng)基。分別將黃曲霉孢子懸液接種到以上5種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的體積以其熔化狀態(tài)計(jì)) 上培養(yǎng)，具體分為5組培養(yǎng)0毫克/毫升組(對(duì)照)接種黃曲霉孢子懸液于3毫升含有0毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基中，使黃曲霉孢子的終濃度為OXlO5孢子/毫升)；
0. 005毫克/毫升組接種黃曲霉孢子懸液于3毫升含有0. 005毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基中，使其終濃度為O XIO5孢子/毫升)；0.05毫克/毫升組接種黃曲霉孢子懸液于3毫升含有0.05毫克/毫升α-亞麻酸的培養(yǎng)基中，使其終濃度為O XIO5孢子/毫升)；0. 5毫克/毫升1組接種黃曲霉孢子懸液于31毫升含有0. 5毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基中，使其終濃度為O XIO5孢子/毫升)；5毫克/毫升組接種黃曲霉孢子懸液于3毫升含有5毫克/毫升α -亞麻酸的培養(yǎng)基中，使其終濃度為O XIO5孢子/毫升)。以上以上5組的培養(yǎng)容器均為一次性塑料培養(yǎng)皿(直徑為6cm)，用透氣膜將培養(yǎng)皿封閉2層，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，提取以上5組培養(yǎng)物的黃曲霉毒素用于檢測(cè)不同濃度的α-亞麻酸對(duì)黃曲霉毒素形成的影響。黃曲霉毒素提取方法分別將以上5組培養(yǎng)皿中的上層培養(yǎng)物全部取出，轉(zhuǎn)移至 50毫升的離心管中，分別加入2毫升的氯仿，漩渦震蕩30秒后，超聲波輔助提取20分鐘， 12，000RPM離心10分鐘，取氯仿相，分別得到5組黃曲霉毒素的提取物，采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。采用上述培養(yǎng)方法和黃曲霉毒素提取方法，分別提取在上述上層GMS固體合成培養(yǎng)基上添加0毫克/毫升(對(duì)照)和5毫克/毫升α-亞麻酸處理后的樣品培養(yǎng)1天、2 天、3天、4天和5天后中的黃曲霉毒素，采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。用HPLC方法檢測(cè)上述不同濃度α _亞麻酸處理組的氯仿相中所含黃曲霉毒素的量以及不同時(shí)間α-亞麻酸處理組的氯仿相中所含黃曲霉毒素的量。檢測(cè)方法如下梯度洗脫3 分鐘 55 % H2O, 20 % CH3CN, 25 % CH3OH ；3. 1 分鐘 62 % H2O, 38 % CH3OH ；6 分鐘 62 % H2O, 38% CH3OH ；流速1毫升/min，柱溫設(shè)定40°C，10微升進(jìn)樣量，DAD檢測(cè)器檢測(cè)360nm處的吸收值，色譜柱Zortax SB 4. 6X150mm 5um。此處用的標(biāo)品為標(biāo)準(zhǔn)毒素物質(zhì)aflatoxins Bl和Gl的混合物(濃度均為10微克/毫升)，購(gòu)于Sigma。標(biāo)品為黃曲霉毒素Bl的保留時(shí)間為4. 95分鐘，黃曲霉毒素Gl的保留時(shí)間為 3. 731分鐘。樣品中黃曲霉毒素Bl的保留時(shí)間為4. 87分鐘，黃曲霉毒素Gl的保留時(shí)間為 3. 69分鐘。不同濃度α-亞麻酸處理組黃曲霉毒素的含量如圖1所示，其中圖1中A為不同濃度α-亞麻酸處理組黃曲霉毒素Bl的含量，圖1中B為不同濃度α-亞麻酸處理組黃曲霉毒素Gl的含量。結(jié)果顯示，與對(duì)照(0毫克/毫升組)相比，加入不同濃度的α-亞麻酸均能明顯抑制黃曲霉毒素的合成，以5毫克/毫升組最為顯著。黃曲霉毒素Bl的含量分別為0毫克/毫升組為8. 64士0. 18微克/毫升，0. 005毫克/毫升組為9. 31 士 1. 24微克/ 毫升，0. 05毫克/毫升組為7. 15士0. 39微克/毫升，0. 5毫克/毫升組為3. 86士0. 12微克 /毫升，5毫克/毫升組為0.沈士0. 19微克/毫升；黃曲霉毒素Gl的含量分別為0毫克/ 毫升組為1.48士0. 12微克/毫升，0. 005毫克/毫升組為1. 25士0. 14微克/毫升，0. 05毫克/毫升組為1.對(duì)士0. 15微克/毫升，0. 5毫克/毫升組為0. 57士0. 04微克/毫升，5毫克/毫升組為0. 12 士0. 09微克/毫升。
不同時(shí)間α -亞麻酸處理黃曲霉毒素的含量如圖1所示，其中圖1中A為不同時(shí)間 α-亞麻酸黃曲霉毒素Bl的含量，圖1中B為不同時(shí)間α-亞麻酸處理黃曲霉毒素Gl的含量。結(jié)果如圖2中A(黃曲霉毒素Bi)和圖2中B(黃曲霉毒素Gl)所示，與對(duì)照(0毫克/ 毫升組)相比，加入5毫克/毫升α -亞麻酸處理后的樣品培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天后黃曲霉毒素的合成都明顯受到抑制。0毫克/毫升組(對(duì)照)培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和 5天樣品中黃曲霉毒素Bl的含量分別為0微克/毫升、3. 48士0. 18微克/毫升、4. 4士0. 47 微克/毫升、3. 23士0. 61微克/毫升、2. 65士0. 25微克/毫升；而5毫克/毫升組培養(yǎng)1天、 2天、3天、4天和5天樣品中黃曲霉毒素Bl的含量分別為0微克/毫升、0. 27士0. 17微克 /毫升、0. 36士0. 18微克/毫升、0. 4士0. 31微克/毫升、0. 27士0. 26微克/毫升。0毫克/ 毫升組培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天樣品中黃曲霉毒素Gl的含量分別為0微克/毫升、 0. 64士0. 04微克/毫升、0. 76士0. 07微克/毫升、0. 67士0. 03微克/毫升、0. 55士0. 1微克 /毫升；而5毫克/毫升組培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天樣品中黃曲霉毒素Gl的含量分別為0微克/毫升、0. 15士0. 04微克/毫升、0. 16士0. 03微克/毫升、0. 17士0. 04微克/毫升、0. 14士0. 02微克/毫升。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，α-亞麻酸作為脂類信號(hào)分子的前體，能夠有效抑制黃曲霉在葡萄糖合成培養(yǎng)基上合成黃曲霉毒素。
權(quán)利要求
1.α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生中的應(yīng)用。
2.α -亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在制備抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素Bl或黃曲霉毒素G1。
4.一種抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的黃曲霉培養(yǎng)方法，包括如下步驟用添加α-亞麻酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)黃曲霉，得到培養(yǎng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述α -亞麻酸在添加α -亞麻酸的培養(yǎng)基中的濃度為0. 005毫克/毫升_5毫克/毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述α -亞麻酸在添加α -亞麻酸的培養(yǎng)基中的濃度為0. 005毫克/毫升、0. 05毫克 /毫升、0. 5毫克/毫升或5毫克/毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于 所述培養(yǎng)溫度為^°C，所述培養(yǎng)時(shí)間為3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于 所述培養(yǎng)為在培養(yǎng)容器與外界進(jìn)行氣體交換條件下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)容器與外界進(jìn)行氣體交換是通過(guò)在所述培養(yǎng)容器的開(kāi)口處覆蓋透氣膜實(shí)現(xiàn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一所述的方法，其特征在于 所述黃曲霉為黃曲霉(Aspergillus flavus)CGMCC NO. 3. 2890
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用α-亞麻酸抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的方法。本發(fā)明提供了α-亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了α-亞麻酸和/或其類似物和/或其衍生物在制備抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，α-亞麻酸可以抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，避免黃曲霉毒素對(duì)人類的危害，本研究利用代謝組學(xué)手段，通過(guò)比較亞麻酸處理和不處理對(duì)產(chǎn)毒與否的全景代謝物變化，從代謝水平上了解毒素產(chǎn)生與脂肪酸的關(guān)系，尋找與毒素合成相關(guān)的代謝途徑，并通過(guò)阻斷合成途徑減少毒素的合成。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102212481SQ20111009514
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者劉春明, 張晉丹, 晏石娟 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所