專利名稱：一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法
一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
酯香物質(zhì)是飲料酒中主要的風味物質(zhì)，較高的酯含量不僅賦予飲料酒重要的酯香，同時能有效地擴張、松馳神經(jīng)，可減少喝酒引起的副作用。國內(nèi)普通白酒和黃酒是以純種培養(yǎng)的釀酒酵母為主進行發(fā)酵的，其特點是發(fā)酵周期短、原料出酒率高，但由于釀酒酵母產(chǎn)酯香物質(zhì)的能力極低，致使成品酒品質(zhì)較差。高檔飲料酒，如黃酒、白酒等，酯香物質(zhì)含量較高的主要原因是采用自然網(wǎng)羅微生物制曲發(fā)酵，通過自然制曲網(wǎng)羅的產(chǎn)酯能力較強的漢遜酵母和假絲酵母等生香微生物來提高酒中酯含量，而這些野生酵母的存在嚴重影響原料出酒率，其酒精發(fā)酵效率不到釀酒酵母的三分之一，因而導致我國高檔白酒和黃酒耗糧高、 生產(chǎn)周期長、效率低、成本高。如何提高酒中酯香物質(zhì)的含量，一直是我國普通白酒、黃酒企業(yè)和相關(guān)科研單位研究的重要課題。目前提高普通白酒酯含量的主要方法有如下三種一是固液結(jié)合法，用液態(tài)法生產(chǎn)酒基，用固態(tài)法的酒糟、酒尾或成品酒來提高質(zhì)量；二是調(diào)香法，用天然香料調(diào)制或用純化學藥品按某一名酒的香味成分組成來進行調(diào)香；三是全液法，在發(fā)酵醪中加入產(chǎn)香微生物，己酸菌發(fā)酵液或?qū)⒓核岚l(fā)酵液經(jīng)化學，生物法酯化后，再加到發(fā)酵醪中。這些提高酒中酯香物質(zhì)含量的方法大多是從工藝水平上進行的，雖然酯含量有一定提高，但酒質(zhì)與高檔名酒相差仍很大，特別是化學藥品的加入存在安全隱患。研究表明，乙酸酯類，如乙酸乙酯(溶劑類香氣)，乙酸異戊酯(香蕉風味)和苯乙基酯(花香、玫瑰香)，是酒中主要的風味活性酯。這些酯類的形成是在酵母代謝時在酵母內(nèi)合成的，形成的酯一部分通過細胞擴散到發(fā)酵液中，一部分被酵母吸附，留在細胞體內(nèi)。參與乙酸酯合成的酶主要是醇乙?；D(zhuǎn)移酶(AATase)，該酶催化乙醇和乙酰輔酶 A形成乙酸酯。該酶是一種巰基酶，有三種不同的類型AATase I、Lg-AATase I和AATase II，分別由ATF1、Lg-ATFl和ATF2編碼。而由IAHl編碼的酯酶是乙酸異戊酯水解的關(guān)鍵酶，該酶可以催化乙酸異戊酯水解成乙酸和異戊醇。綜上所述，黃酒和白酒是我國的特色酒種，普通酒原料出酒率高，但酯香物質(zhì)含量低，成品酒質(zhì)量較差；高檔酒酯香物質(zhì)含量高、品質(zhì)好，但原料出酒低，生產(chǎn)成本高。目前國內(nèi)提高飲料酒酯香物質(zhì)含量的方法仍存在很多問題。因此，要從根本上解決釀酒酵母的產(chǎn)酯能力還是需要利用分子生物學育種技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)酯的釀酒酵母工業(yè)菌株。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析，提供一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌株及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌，所述酯釀酒酵母基因工程菌(Saccharomyces cerevisiae)EY-13,已于2010年11月17日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號)，保藏號為CGMCC No 4350， 建議命名為釀酒酵母。一種所述高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下1)將pPGKl質(zhì)粒上的PGKl啟動子和終止子基因酶切下來后再與pUC19質(zhì)粒連接得到 pUC-PGKl ；2)將用PCR方法獲得的來源于釀酒酵母編碼酯水解酶IAHl基因的同源片段IAH 連接到 pUC-PGKl 上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將用PCR方法獲得的來源于釀酒酵母的編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶ATFl基因插入到 PGKl啟動子和終止子之間，得到pUC-PGKl-IAH-ATFl ；4)將來源于pUG6上的kan抗性基因連接到pUC-PGKl-IAH-ATFl上，得到質(zhì)粒 pUC-PGK1-IAH-ATF1-kan ；5)將構(gòu)建的載體質(zhì)粒pUC-PGKl-IAH-ATFl-kan用Bpull02I酶切，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株，將a型和α型基因工程單倍體融合，得到釀酒酵母基因工程菌。該構(gòu)建方法的具體操作過程如下l)pUC19_PIAK 質(zhì)粒的構(gòu)建Hind III酶切pPGKl質(zhì)粒，釋放出約1.81Λ大小的PGKl片段，用Hind III酶切載體 口肌19，用 T4DNA 連接酶連接 PGKl/Hind III 禾口 pUC19/Hind III，構(gòu)成質(zhì)粒 pUC_P，BamH I 分別酶切IAHl同源片段和質(zhì)粒pUC-P，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)pUC-PI，Xho I分別酶切ATFl基因和質(zhì)粒pUC-PI，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)粒pUC-PIA，以pUC-PIA為模板，根據(jù)PGKl和ATFl序列設(shè)計相應(yīng)引物驗證ATFl方向，KpnI分別酶切Kan基因和質(zhì)粒pUC-PIA， 用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)粒pUC-PIAK ；2)重組釀酒酵母單倍體的構(gòu)建Bpul 1021 (Blp I)酶切質(zhì)粒pUC_PIAK，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母a 型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。根據(jù)釀酒重組位點兩端的基因序列和插入載體質(zhì)粒pUC-PIAK的序列，分別設(shè)計兩組上下游引物，分別以生長較好的a型和α型單倍體轉(zhuǎn)化子基因組為模板，分別進行PCR 擴增，驗證重組子，引物序列為一組上游引物 ΙΑΚΓ F TAGTCTGTTTGAGCAGTCCTACCCT一組下游引物 ΙΑΚΓ R GAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCT二組上游引物 ΙΑΚ2，F(xiàn) GGCATTTGGCCAATTTCAAGGATCC二組下游弓丨物 ΙΑΚ2，R TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG一組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 2kb的特異性條帶， 其大小與預期相當；二組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 3kb的特異性條帶，其大小與預期相當。說明PUC-PIAK片段已成功重組到釀酒酵母單倍體基因組中。3)重組釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建
將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選重組釀酒酵母基因工程菌(雙倍體)。重組釀酒酵母基因工程菌的驗證提取重組釀酒酵母基因工程菌的基因組并以其為模板，以ΙΑΚΓ F和ΙΑΚ1’ R， ΙΑΚ2’ F和ΙΑΚ2，R作為引物進行PCR擴增。一組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 2kb的特異性條帶， 其大小與預期相當；二組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 3kb的特異性條帶，其大小與預期相當，說明PUC-PIAK片段已成功重組到釀酒酵母基因組中，重組釀酒酵母基因工程菌構(gòu)建成功。一種所述高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌，應(yīng)用于傳統(tǒng)黃酒工藝和傳統(tǒng)白酒工藝的發(fā)酵。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明選用來自于釀酒酵母的PGKl作為啟動子，在過表達釀酒酵母編碼醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶ATFl基因的同時，將釀酒酵母基因組中編碼酯水解酶的IAHl基因敲除，獲得了高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌EY-13(CGMCC No 4350)。本發(fā)明所獲得的釀酒酵母工程菌 Saccjaromyces cerevisiae EY-13 (保藏號CGMCC No4350)與初始的釀酒酵母菌(受體菌 Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，模擬黃酒發(fā)酵后，異戊醇含量降低了約50%，乙酸乙酯含量提高了將近20倍，乙酸異戊酯的含量提高到100mg/L，乙酸異丁酯含量提高到5 7mg/L ；模擬白酒發(fā)酵后，總酯提高了 4倍，其中乙酸乙酯提高了近35倍，為釀酒工業(yè)生產(chǎn)提供了優(yōu)良菌株。

圖1為pUC-PIAK質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖。圖2為pUC-PIAK質(zhì)粒的驗證電泳圖。圖3為載體pUC-PIAK與酵母基因組的同源重組路線圖。圖4為重組釀酒酵母單倍體的驗證電泳圖，其中a)為a型重組單倍體驗證結(jié)果； b)為α型重組單倍體驗證結(jié)果。圖5為重組釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建路線圖。圖6為重組釀酒酵母基因工程菌的驗證電泳圖。圖7為發(fā)酵工藝路線圖。
具體實施方式本發(fā)明所述的重組釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為EY-13， 已于2010年11月17日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號)，保藏號為CGMCC No4350，建議命名為釀酒酵母。本發(fā)明所使用的釀酒酵母雙倍體菌體是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為公知方法。
實施例1 高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建l)pUC19_PIAK 質(zhì)粒的構(gòu)建Hind III酶切pPGKl質(zhì)粒，釋放出約1.81Λ大小的PGKl片段；用Hind III酶切載體 pUC19 ；用 T4DNA連接酶連接 PGKl/Hind III 和 pUC19/Hind III，構(gòu)成質(zhì)粒 pUC_P ；BamH I分別酶切IAHl同源片段和質(zhì)粒pUC-P ；用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)pUC_PI ；Xho I分別酶切ATFl基因和質(zhì)粒pUC-PI ；用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)粒pUC-PIA。以pUC-PIA為模板，根據(jù)PGKl和ATFl序列設(shè)計相應(yīng)引物驗證ATFl方向；KpnI分別酶切Kan基因和質(zhì)粒 pUC-PIA ；用T4DNA連接酶連接，構(gòu)成質(zhì)粒pUC-PIAK，構(gòu)建流程如圖1所示。圖2為pUC-PIAK 質(zhì)粒的驗證電泳圖其中泳道1為5000bp DNALadder Marker ；泳道2為受體菌基因組PCR 擴增同源片斷IAH ；泳道3為pUC-PIAK質(zhì)粒PCR擴增同源片斷IAH ；泳道4為受體菌基因組PCR擴增ATFl ；泳道5為pUC-PIAK質(zhì)粒PCR擴增ATFl ；泳道6為pUC-PIAK質(zhì)粒，PGK上游引物+ATFl下游引物PCR擴增結(jié)果；泳道7為pUC-PIAK質(zhì)粒，PGK上游引物+ATFl上游引物PCR擴增結(jié)果；泳道8為pUC-PIAK質(zhì)粒，PGK上游引物+下游引物PCR擴增結(jié)果；泳道 9為pUG6質(zhì)粒PCR擴增Kan ；泳道10為pUC-PIAK質(zhì)粒PCR擴增Kan ；泳道11為1Kb DNA Ladder Marker ；泳道12為載體pUC19單酶切線性結(jié)果；泳道13為pUC-PIAK質(zhì)粒單酶切線性結(jié)果。2)重組釀酒酵母單倍體的構(gòu)建Bpu 11021 (Blp I)酶切質(zhì)粒pUC-PIAK ；用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。同源重組過程如圖3所示。根據(jù)釀酒重組位點兩端的基因序列和插入載體質(zhì)粒pUC-PIAK的序列，分別設(shè)計兩組上下游引物，分別以生長較好的a型和α型單倍體轉(zhuǎn)化子基因組為模板，分別進行PCR 擴增，驗證重組子，引物序列為 一組上游引物 IAKl，F(xiàn) TAGTCTGTTTGAGCAGTCCTACCCT一組下游引物 ΙΑΚΓ R GAACCTCAGTGGCAAATCCTAACCT二組上游引物 ΙΑΚ2，F(xiàn) GGCATTTGGCCAATTTCAAGGATCC二組下游弓丨物 ΙΑΚ2，R TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG一組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 2kb的特異性條帶， 其大小與預期相當；二組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 3kb的特異性條帶，其大小與預期相當。說明PUC-PIAK片段已成功重組到釀酒酵母單倍體基因組中。電泳結(jié)果如圖4所示，其中(a)為a型重組單倍體驗證結(jié)果；(b)為α型重組單倍體驗證結(jié)果。圖4為重組釀酒酵母單倍體的驗證電泳圖，其中a)為a型重組單倍體驗證結(jié)果； b)為α型重組單倍體驗證結(jié)果。圖4中M為5000bp DNALadder Marker，泳道1為受體菌 a/ α型單倍體一組PCR陰性對照；泳道2為a/ α型重組單倍體一組PCR產(chǎn)物；泳道3為受體菌a/ α型單倍體二組PCR陰性對照；泳道4為a/ α型重組單倍體二組PCR產(chǎn)物。3)重組釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生孢實驗篩選重組釀酒酵母基因工程菌(雙倍體)。圖5為重組釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建過程路線圖。重組釀酒酵母基因工程菌的驗證提取重組釀酒酵母基因工程菌的基因組并以其為模板，以ΙΑΚΓ F和IAK1，R， IAK2’ F和IAK2，R作為引物進行PCR擴增。一組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 2kb的特異性條帶， 其大小與預期相當；二組的PCR產(chǎn)物經(jīng)0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳，可看到一條約1. 3kb的特異性條帶，其大小與預期相當，說明PUC-PIAK片段已成功重組到釀酒酵母基因組中，重組釀酒酵母基因工程菌構(gòu)建成功。電泳結(jié)果如圖6所示。圖6為重組釀酒酵母基因工程菌的驗證電泳圖，圖6中M為5000bp DNALadder Marker,泳道1為受體菌一組PCR陰性對照；泳道2為工程菌一組PCR產(chǎn)物；泳道3為受體菌二組PCR陰性對照；泳道4為工程菌二組PCR產(chǎn)物。實施例2 模擬黃酒發(fā)酵實驗1)發(fā)酵工藝路線見圖7。2)工藝條件浸米條件25 30°C，浸漬72h ；蒸煮條件常壓蒸30min左右，顆粒均勻、內(nèi)心無白；前酵條件J8°C，5天。3)配料粳米=IOOg ；熟麥曲=IOg ；水:105ml，所述水包括清水60ml、漿水45ml，不包括浸米吸水和蒸飯吸水；接種量10% (20mL)。按上述模擬工藝對釀酒酵母工程菌EY-13及其單倍體(a型和α型)和出發(fā)菌株 (Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)及其單倍體(a型和α型)分別進行半固態(tài)發(fā)酵實驗；發(fā)酵期間每隔1 振蕩并稱重，記錄失重；發(fā)酵結(jié)束后，停止培養(yǎng)并稱重；測定發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛?、酒精體積分數(shù)以及主要香氣成分含量，以發(fā)酵能力、殘?zhí)菨舛群彤a(chǎn)物生成量表征其綜合性能，結(jié)果見表1。表1釀酒酵母受體菌和釀酒酵母工程菌的黃酒發(fā)酵性能
權(quán)利要求
1.一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌，其特征在于所述酯釀酒酵母基因工程菌 (.Saccharomyces cerevisiae)YX~l ,,已于2010年11月17日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No 4350，建議命名為釀酒酵母。
2.一種如權(quán)利要求1所述高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下1)將pPGKl質(zhì)粒上的PGKl啟動子和終止子基因酶切下來后再與pUC19質(zhì)粒連接得到 pUC-PGKl ；2)將用PCR方法獲得的來源于釀酒酵母編碼酯水解酶IAIR基因的同源片段以//連接到 pUC-PGKl 上，得到 pUC-PGKl-/A7 ；3)將用PCR方法獲得的來源于釀酒酵母的編碼醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶JTFl基因插入到PGKl 啟動子和終止子之間，得到pUC-PGK 1-IAH-A TFl ；4)將來源于pUG6上的kan抗性基因連接到pUC-PGKI-JAYjTFl上，得到質(zhì)粒 pUC-PGK 1-IAH-A TFl ~kan ；5)將構(gòu)建的載體質(zhì)粒pUC-PGKl-JAYjTFl-h/ 用φ 1102Ι酶切，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株， 將a型和α型基因工程單倍體融合，得到釀酒酵母基因工程菌。
3.—種如權(quán)利要求1所述高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌，其特征在于應(yīng)用于傳統(tǒng)黃酒工藝和傳統(tǒng)白酒工藝的發(fā)酵。
全文摘要
一種高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌，所述酯釀酒酵母基因工程菌EY-13，已于2010年11月17日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo4350，建議命名為釀酒酵母；其構(gòu)建方法是通過選用來自于釀酒酵母的PGK1作為啟動子，在過表達釀酒酵母編碼醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶ATF1基因的同時，將釀酒酵母基因組中編碼酯水解酶的IAH1基因敲除來實現(xiàn)。本發(fā)明所獲得的釀酒酵母工程菌與初始的受體菌相比，模擬黃酒發(fā)酵后，異戊醇含量近一半，乙酸乙酯含量提高20倍，乙酸異戊酯的含量為100mg/L，乙酸異丁酯含量為5~7mg/L；模擬白酒發(fā)酵后，總酯提高了4倍，乙酸乙酯提高了35倍，為釀酒工業(yè)生產(chǎn)提供了優(yōu)良菌株。
文檔編號C12N15/54GK102199556SQ20111009487
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月15日
發(fā)明者孫溪, 張建煒, 張翠英, 王文陽, 肖冬光, 葛梟雄, 郭學武 申請人:天津科技大學 被以下專利引用 (1),