專利名稱：一種應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種將糖化酶、a淀粉酶和異淀粉酶重組于釀酒 酵母基因組，然后利用釀酒酵母基因組，直接利用淀粉為原料生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常應(yīng)用的酒精生產(chǎn)菌，但是釀酒酵母 缺乏水解淀粉的酶類(a _淀粉酶和糖化酶)，不能直接利用淀粉；天然的淀粉質(zhì)原料中，支 鏈淀粉的含量約占70% 95%。支鏈淀粉難于糖化，而異淀粉酶(亦稱a-l，6-葡萄糖苷 酶，支鏈淀粉酶)能夠水解支鏈淀粉分支點(diǎn)的a-l，6-葡萄糖苷鍵，催化支鏈淀粉、糖原及 某些分支糊精中的a-l，6糖苷鍵的斷裂反應(yīng)，而釀酒酵母也不能產(chǎn)生異淀粉酶。目前應(yīng)用 淀粉生產(chǎn)乙醇是在應(yīng)用酵母發(fā)酵淀粉之前或者在發(fā)酵過(guò)程中添加a -淀粉酶、糖化酶和異 淀粉酶，但是這些酶(a-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶)的生產(chǎn)需要人力、物力和耗能，導(dǎo)致 利用淀粉生產(chǎn)乙醇的生產(chǎn)成本過(guò)高，影響利用淀粉生產(chǎn)乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的方法，為應(yīng)
用淀粉生產(chǎn)乙醇提供一種用釀酒酵母工程菌同步轉(zhuǎn)化支鏈淀粉為直鏈淀粉以及同步糖化
淀粉生產(chǎn)乙醇的方法。 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案 —種應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的方法，其步驟如下 1、從大麥基因組中擴(kuò)增a淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增糖化酶基因，從 解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因； 2、構(gòu)建由釀酒酵母的磷酸甘油酸鹽激酶基因啟動(dòng)子(pPGK)分別調(diào)控a淀粉酶基
因和糖化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，構(gòu)建由釀酒酵母的交配信息素啟動(dòng)子(pMF-a)調(diào)
控異淀粉酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為釀酒酵母基因組(重組子)； 3、用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因驗(yàn)證重組子分別合成a淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶
的基因特異引物，分別以重組子和沒(méi)有轉(zhuǎn)化這些基因的釀酒酵母(宿主菌)基因組DNA為
模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)宿主菌沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶而重組子能擴(kuò)增出目標(biāo)
大小的PCR擴(kuò)增帶證明所測(cè)的目標(biāo)基因是已經(jīng)重組于重組子的基因組； 4、用測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物各種酶的活性的方法篩選出每種酶活力大于1. 2 ii /ml發(fā)酵液
的重組子為工程菌； 5、將淀粉蒸煮使糊化。 6、以糊化的淀粉為原料，應(yīng)用所構(gòu)建并篩選出的釀酒酵母工程菌于28-3(TC進(jìn)行 發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。 本發(fā)明采用了直接同步剪切淀粉支鏈和糖化淀粉的方式生產(chǎn)乙醇，省略了需要生 產(chǎn)成本較高的系列酶(異淀粉酶、a-淀粉酶和糖化酶)的生產(chǎn)過(guò)程，能夠在較大的程度上
3降低利用淀粉生產(chǎn)乙醇的成本，為利用淀粉生產(chǎn)乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供可靠保證。
具體實(shí)施例方式
下面才用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例一 1.從大麥基因組中擴(kuò)增a淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增糖化酶基因，從 解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因。 2.構(gòu)建由釀酒酵母的磷酸甘油酸鹽激酶基因啟動(dòng)子(pPGK)分別調(diào)控a淀粉酶基 因和糖化酶基因，由釀酒酵母的交配信息素啟動(dòng)子(pMF-a)調(diào)控異淀粉酶基因的釀酒酵 母表達(dá)載體。并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母基因組(重組子)； 3.用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因驗(yàn)證重組子合成a淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶的基 因特異引物，分別以重組子和沒(méi)有轉(zhuǎn)化這些基因的釀酒酵母(宿主菌)基因組DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)宿主菌沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶而重組子能擴(kuò)增出目標(biāo)大小 的PCR擴(kuò)增帶證明所測(cè)的目標(biāo)基因是已經(jīng)重組于重組子的基因組； 4、用測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物各種酶的活性的方法篩選出每種酶活力> 1. 2ii /ml發(fā)酵液的
重組子為工程菌； 5.將淀粉蒸煮使糊化。 6.以糊化的淀粉為原料，應(yīng)用所構(gòu)建并篩選出的釀酒酵母工程菌于2『C進(jìn)行發(fā)
酵生產(chǎn)乙醇。 實(shí)施例二 1.從大麥基因組中擴(kuò)增a淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增糖化酶基因，從 解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因。 2.構(gòu)建由釀酒酵母的磷酸甘油酸鹽激酶基因啟動(dòng)子(pPGK)分別調(diào)控a淀粉酶基 因和糖化酶基因，由釀酒酵母的交配信息素啟動(dòng)子(pMF-a)調(diào)控異淀粉酶基因的釀酒酵 母表達(dá)載體。并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母基因組(重組子)； 3.用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因驗(yàn)證重組子合成a淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶的基 因特異引物，分別以重組子和沒(méi)有轉(zhuǎn)化這些基因的釀酒酵母(宿主菌)基因組DNA為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)宿主菌沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶而重組子能擴(kuò)增出目標(biāo)大小 的PCR擴(kuò)增帶證明所測(cè)的目標(biāo)基因是已經(jīng)重組于重組子的基因組； 4、用測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物各種酶的活性的方法篩選出每種酶活力> 1. 2ii /ml發(fā)酵液的
重組子為工程菌； 5.將淀粉蒸煮使糊化。 6.以糊化的淀粉為原料，應(yīng)用應(yīng)用所構(gòu)建并篩選出的釀酒酵母工程菌于3(TC進(jìn) 行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
權(quán)利要求
一種應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，其步驟如下1)、從大麥基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增糖化酶基因，從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因；2)、構(gòu)建由釀酒酵母的磷酸甘油酸鹽激酶基因啟動(dòng)子分別調(diào)控α淀粉酶基因和糖化酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，構(gòu)建由釀酒酵母的交配信息素啟動(dòng)子調(diào)控異淀粉酶基因的釀酒酵母表達(dá)載體，并將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化為釀酒酵母基因組；3)、用PCR方法擴(kuò)增目標(biāo)基因驗(yàn)證重組子分別合成α淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶的基因特異引物，分別以重組子和沒(méi)有轉(zhuǎn)化這些基因的釀酒酵母基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)宿主菌沒(méi)有擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶而重組子能擴(kuò)增出目標(biāo)大小的PCR擴(kuò)增帶證明所測(cè)的目標(biāo)基因是已經(jīng)重組于重組子的基因組；4)、用測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物各種酶的活性的方法篩選出每種酶活力大于1.2μ/ml發(fā)酵液的重組子為工程菌；5)、將淀粉蒸煮使糊化；6)、以糊化的淀粉為原料，應(yīng)用所構(gòu)建并篩選出的釀酒酵母工程菌于28-30℃進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，首先從大麥基因組中擴(kuò)增α淀粉酶基因，從黑曲霉菌基因組中擴(kuò)增糖化酶基因，從解淀粉假單胞桿菌基因組中擴(kuò)增異淀粉酶基因；利用α淀粉酶基因、糖化酶基因和異淀粉酶基因構(gòu)建成釀酒酵母工程菌；將淀粉蒸煮使糊化后，以糊化的淀粉為原料，應(yīng)用所構(gòu)建并篩選出的釀酒酵母工程菌于28-30℃進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。本發(fā)明采用了構(gòu)建釀酒酵母工程菌而同步剪切淀粉支鏈，以及同步糖化淀粉生產(chǎn)乙醇的方法，省略了需要生產(chǎn)成本高的系列酶的生產(chǎn)，能夠較大程度地降低利用淀粉生產(chǎn)乙醇的成本，解決應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇的高成本問(wèn)題，有利于促進(jìn)應(yīng)用淀粉生產(chǎn)乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12R1/865GK101717795SQ20091025389
公開(kāi)日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者劉振旺, 張澤華, 張?zhí)碓? 張愛(ài)聯(lián), 易小平, 羅進(jìn)賢, 譚燕華 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所