一種發(fā)酵生產(chǎn)混合醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程和發(fā)酵工程復(fù)合技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種生物法發(fā)酵生產(chǎn)混 合醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著化石能源日近枯竭，通過微生物利用可再生資源來生產(chǎn)燃料備受關(guān)注。生物 法制備燃料下醇是利用產(chǎn)下醇梭菌（丙酬下醇梭菌、拜氏梭菌等)在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行 的，其主要產(chǎn)物是下醇、丙酬和乙醇，它們的比例通常是6: 3:1，簡稱A肥發(fā)酵。使用傳統(tǒng)的 ABE發(fā)酵，下醇在總?cè)軇┲幸话阒徽?0%，比例偏低，對后期下醇回收、分離的成本形成巨大 的挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593和肥STE 255具有次級 醇脫氨酶基因（sa化)可W合成大約lOOmM的異丙醇。異丙醇作為一種重要的有機(jī)化工原料 和有機(jī)溶劑，在農(nóng)藥、醫(yī)藥、電子、日用化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的用途，同時(shí)也可作為一種性能 優(yōu)越的燃料。將A肥發(fā)酵產(chǎn)物中的丙酬轉(zhuǎn)化為異丙醇從而能夠?qū)崿F(xiàn)混合醇聯(lián)產(chǎn)（IBE發(fā)酵）， 可有效降低分離過程的成本，提高生物燃料的市場競爭力。
[0003] 目前，Simon Duss自aux等人在敲除了下酸激酶基因的ATCC 824(已表達(dá)外源sa化 基因）中實(shí)現(xiàn)了混合醇的生產(chǎn)，但該菌株在最優(yōu)條件下仍然不能將丙酬完全轉(zhuǎn)化成異丙醇。 (Simon Duss有aux.et al..Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 for the high-yield production of a biofuel composed of an isopropanol/butanol/ethanol mixture.Metab.Eng.2013,18,1-8.)cFlorent Colias等 在Closhidium acetobutylicum ATCC 824中表達(dá)異丙醇合成基因，并且共表達(dá)了adc、 ctfA/B基因進(jìn)一步地強(qiáng)化了異丙醇通路，發(fā)酵后仍能檢測到最高有0.9g/L的丙酬存在 (Coll曰S et 曰1..Simultaneous production of isoprop曰nol,but曰nol,ethanol and 2, 3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 engineered strains.AMB Express 2012,2:45)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是針對現(xiàn)有混合醇生產(chǎn)菌株生長及產(chǎn)醇能力低的問題，提供了一種高效發(fā) 酵生產(chǎn)混合醇的方法。利用該方法進(jìn)行厭氧發(fā)酵，可W提高混合醇產(chǎn)量和生產(chǎn)能力，并實(shí)現(xiàn) 丙酬至異丙醇的完全轉(zhuǎn)化。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0006] 一、構(gòu)建重組菌株：W實(shí)驗(yàn)室自主篩選獲得的丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutyli州m)XY16(保藏號為CCTCC N0:M 201001)為出發(fā)菌株，表達(dá)外源次級醇脫氨酶 后，得到能夠發(fā)酵生產(chǎn)混合醇的重組菌株Clostridi皿acetobutyli州m XY16(pSADH)。
[0007] 進(jìn)一步地，所述具體步驟如下：
[000引（1)構(gòu)建次級醇脫氨酶基因的表達(dá)載體pIMPl-p憂-sa化；
[0009] (2)將步驟（1)得到的穿梭載體pIMPl-ptb-sa化采用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到丙酬下醇 梭菌Closhidium acetobutylicum XY16中，獲得sa化基因表達(dá)的重組菌株Closhidium acetobutylicum XY16(pSADH)。
[0010] 二、生產(chǎn)混合醇:在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入巧離子來提高菌株胞內(nèi)產(chǎn)醇期的還原力供 給，進(jìn)而增加混合醇的產(chǎn)量。
[0011] 進(jìn)一步地，其步驟如下：
[0012] 方法一、在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化巧。巧離子是NADK的誘導(dǎo)劑，能促進(jìn) NAD+向NADP+轉(zhuǎn)化，NADP+進(jìn)而轉(zhuǎn)化為NADPH。增強(qiáng)了輔酶NADPH的供給，異丙醇的合成途徑是 需要依賴于還原力NADPH，進(jìn)而可恢復(fù)細(xì)胞生長，同時(shí)能提高異丙醇的產(chǎn)量。
[0013] 方法二、在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的碳酸巧。碳酸巧一方面可W提供增強(qiáng)還 原力提高的金屬離子巧離子；另一方面碳酸根可W在培養(yǎng)基中起到緩沖作用，中和發(fā)酵過 程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，更有利于異丙醇、混合醇產(chǎn)量的提高。
[0014] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的一種高效發(fā)酵生產(chǎn)混合醇的方法有完全轉(zhuǎn)化丙酬至 異丙醇的特點(diǎn)，并且本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了NADPH在異丙醇制備過程中的重要性。還原力NADH、 NADPH作為電子載體參與了胞內(nèi)的生物合成W及能量轉(zhuǎn)換過程。調(diào)控胞內(nèi)還原力供給可W 有效地提高微生物的代謝性能，胞內(nèi)的NAD(P)H/NAD(P)+比值代表了菌體所處環(huán)境的氧化 還原態(tài)勢，因此可W通過調(diào)節(jié)發(fā)酵體系中的氧化還原狀態(tài)來調(diào)控菌體細(xì)胞內(nèi)還原力的平 衡，進(jìn)而調(diào)節(jié)菌體的生長及代謝能力。NADH的產(chǎn)生是通過糖酵解由NAD+轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的，其消耗 主要用于產(chǎn)物的合成。NADPH則是首先是在NADK的作用下由NAD+轉(zhuǎn)化為NADP+，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為 NADPH。還原力在丙酬下醇梭菌的代謝過程中有至關(guān)重要的作用。
[0015] 本發(fā)明通過提高混合醇生產(chǎn)菌株在產(chǎn)醇期的還原力的供給，使菌株胞內(nèi)NADH/NAD +、NADPH/NADP+的比例在產(chǎn)醇期呈現(xiàn)上升趨勢。而混合醇的合成是需要消耗大量的還原力， 調(diào)控后增加的還原力供給能提高混合醇的產(chǎn)量。當(dāng)加入2g/L的氯化巧時(shí)，巧離子能夠促進(jìn) NA護(hù)向NADP+的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)了異丙醇通路的NADPH的供給，發(fā)酵培養(yǎng)7化后檢測到下醇產(chǎn)量為 3.35g/L，異丙醇的產(chǎn)量達(dá)到1.71g/L，混合醇總產(chǎn)量是6.04g/L。當(dāng)加入lOg/L的碳酸巧時(shí)， 在碳酸根的緩沖作用下，巧離子的存在更激活了 NAD+向NADP+的轉(zhuǎn)化，發(fā)酵培養(yǎng)7化后檢測到 下醇產(chǎn)量為10.43g/L，異丙醇的產(chǎn)量為6.06g/L，混合醇總產(chǎn)量達(dá)到17.77g/L。
【附圖說明】
[0016] 圖1是出發(fā)菌株上罐發(fā)酵結(jié)果。
[0017] 圖2是重組菌株上罐發(fā)酵結(jié)果。
[0018] 圖3是重組菌株生產(chǎn)混合醇的代謝流程圖。
[0019] 圖4是NA畑、NADPH的合成代謝與分解代謝途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0021] 實(shí)施例1:
[0022] 本實(shí)施例說明丙酬下醇梭菌(Clostridium acetobut}di州m)XY16(pSADH)重組菌 株的構(gòu)建方法。
[0023] 1.表達(dá)載體pIMPl-p憂-sa化的構(gòu)建
[0024] 用Nde I單酶切載體pIMPl-ptb，酶切線性化產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒（Takara)化后， sa化(GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號是AF157307.2的從2351到3406之間的1056bp序列）通過一 步克隆連接(Clo址xpress)。將一步克隆連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli D冊a(本 實(shí)驗(yàn)室），涂布到含有l(wèi)OOug/ml氨節(jié)霉素抗性LB平板，37 °C培養(yǎng)12-1化，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液 體含有l(wèi)OOug/ml氨節(jié)霉素 LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒(AXYGEN)，經(jīng)測 序驗(yàn)證獲得能夠利用P憂啟動子表達(dá)sa化的載體pIMPl-p憂-sa化。
[00巧]2.甲基化表達(dá)載體pIMPl-p憂-sa化
[00%] 利用CaCl2法制備E.coli Top 10/pAN2(本實(shí)驗(yàn)室）感受態(tài)，將表達(dá)載體pIMPl- ptb-sa化利用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌化.coli )Τορ 10，由于pAN2質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性，故 涂布到含有l(wèi)OOug/ml氨節(jié)霉素和lOug/ml四環(huán)素雙抗性LB平板，37°C培養(yǎng)12-1化，挑取陽性 轉(zhuǎn)化子，接到液體含有l(wèi)OOug/ml氨節(jié)霉素和lOug/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，37°C、200巧m、培 養(yǎng)12h，提取甲基化缺失載體pIMPl-ptb-sa化(pAN2質(zhì)粒含有一個(gè)枯草芽抱桿菌隧菌體基 因，能編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，能實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒在大腸桿菌中的甲基化）。
[0027] 3.電轉(zhuǎn)化甲基化的載體pi MPl-ptb-sadh至丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)XY16。
[00%] 1)在電轉(zhuǎn)化的前一天晚上，把培養(yǎng)基和EPB放在厭氧箱里，也可將培養(yǎng)基和EPB用 無菌氮?dú)馀叛?。另外，要提前一天將電轉(zhuǎn)杯放在-20°C冷凍。
[00巧]2)將丙酬下醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)XYl6接種至CGM培養(yǎng)基（酵母 粉0.3%，蛋白腺0.5%，可溶性淀粉1 %，乙酸錠0.2%，氯化鋼0.2%，屯水合硫酸儀0.3%， 憐酸二氨鐘0.1 %，憐酸氨二鐘0.1 %，屯水合硫酸亞鐵0.01 %)37°C培養(yǎng)12h，W5%比例接 種到CGM培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)6-8h，接lOmL菌液到60血的2 X YTG中，（酵母粉16g/L，蛋白腺lOg/ L，葡萄糖5g/L，氯化鋼5g/L)，37°C培養(yǎng)至00600 = 1. 1。
[0030] 3)分別取15mL菌液到4個(gè)50mL的離屯、管中，4°C離屯、10分鐘，棄上清液。分別用 2.5mL的EPB (270mM薦糖，5mM化此P〇4，抑7.4)懸浮沉淀，懸浮后再放到冰上，拿出厭氧箱，4 °C離屯、10分鐘，棄上清液。用5mL的EPB懸浮四個(gè)管子里沉淀，將上述懸浮好的菌液收集到一 個(gè)管子里，懸浮后再放到冰上，拿出厭氧箱，4°C離屯、10分鐘。
[0031] 4)最后用2.3mL的EPB懸浮沉淀，懸浮后放在冰上。運(yùn)些細(xì)胞要做電轉(zhuǎn)，所W要一直 放在冰上，盡快使用，加2ug的已經(jīng)甲基化的質(zhì)粒到每一個(gè)0.4cm已經(jīng)冷凍了的電轉(zhuǎn)杯里。
[0032] 5)使用MicroPulserTM電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，條件為電壓2.0kV，電阻200Ω，電容25uF，電擊 后立刻加入ImL 37°C預(yù)熱的2XYTG培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到無菌離屯、管中，在37°C厭氧培養(yǎng)箱復(fù)蘇 4-6h〇
[0033] 6)取200ul上述菌液，涂布到含有l(wèi)Oug/ml紅霉素的CGM固體平板，37°C厭氧培養(yǎng)2- 3天。
[0034] 4.篩選sa化基因表達(dá)的重組菌株
[0035] 挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子，使用紅霉素引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PC閲金證，篩選出陽 性轉(zhuǎn)化子。得到重組菌株。
[0036] 實(shí)施例2:
[0037]本實(shí)例說明出發(fā)菌株厭氧發(fā)酵60h生產(chǎn)ABE的能力考察(利用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，轉(zhuǎn) 速120巧m，通氮?dú)猓?br>[003引種子培養(yǎng)基為:酵母粉0.3 %，蛋白腺0.5 %，可溶性淀粉1 %，乙酸錠0.2 %，氯化鋼 0.2 %，屯水合硫酸儀0.3 %，憐酸二氨鐘0.1 %，憐酸氨二鐘0.1 %，屯水合硫酸亞鐵0.01 %。
[0039] P2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6%，乙酸錠0.22%，憐酸二氨鐘0.05%，憐酸氨二鐘 0.05 %，氯化鋼0.001 %，屯水合硫酸