專利名稱：一種高產(chǎn)乳酸的釀酒酵母工程菌的構建及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)乳酸工程菌及其構建方法，屬于遺傳工程領域。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)乳酸工程菌的應用，特別是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，屬于發(fā)酵工程領域。
背景技術：
作為一種重要的平臺化合物，L-乳酸的需求隨著石油資源的逐漸枯竭而不斷增加。在目前的L-乳酸合成工藝中，以生物質為原料采用微生物發(fā)酵(乳酸菌和霉菌)的工藝具有廣泛的應用。然而由于乳酸菌營養(yǎng)需求高和難以耐受惡劣環(huán)境脅迫，以及霉菌易形成菌絲團和副產(chǎn)物較多等原因，限制了 L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，釀酒酵母作為單細胞生物，能利用簡單的培養(yǎng)基進行快速生長使其為工業(yè)化生產(chǎn)所青睞。通過整合表達乳酸脫氫酶(Idh)于Mccharomy cescerevisiae中可以使L-乳酸得到積累，但副產(chǎn)物乙醇的含量還是很高，為此需要借助基因工程策略，通過游離表達的方式，將源于Sti^ptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)表達于整合了 Idh的工程菌中，在沒有進一步敲除PDC5 和增加Idh拷貝數(shù)的情況下，通過調節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實現(xiàn)碳代謝流的重新分配， 促進目的產(chǎn)物L-乳酸的積累并大幅度降低副產(chǎn)物乙醇的積累量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過調節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實現(xiàn)碳代謝流的
重新分配，提供一種高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌。所述工程菌過量表達源于Sti^ptococcus pneumoniae的NADH氧化酶基因nox。 通過調節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實現(xiàn)了碳代謝流的重新分配，促進L-乳酸的積累并大幅度降低副產(chǎn)物乙醇的積累量。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種上述產(chǎn)乳酸工程菌的構建方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案為1)分別提取含nox基因的質粒和含Idh基因的質粒。對兩質粒雙酶切、回收、純化，連接。2)將步驟1)連接產(chǎn)物轉化到JM109感受態(tài)細胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板， 挑取轉化子。3)提取質粒酶切驗證。4)將構建好的質粒由LiAc法轉化導入受體菌中，涂布Trp缺陷平板。5)驗證所述工程菌。6)胞內(nèi) NADH/NAD+ 的測定。7) NADH氧化酶的測定。步驟4)中所述受體菌為整合了 Idh基因的酵母工程菌。本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種所述高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應用。
發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的工藝為30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)所述工程菌至對數(shù)中期，以8% 接種量接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)100小時；發(fā)酵參數(shù)為pH 5. 5，通氣量1. 5L/min，溶氧 50%。本發(fā)明通過游離表達的方法，獲得一株高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇的工程菌。本發(fā)明提供的工程菌生產(chǎn)乳酸工藝簡單易行，發(fā)酵IOOh后，目的產(chǎn)物L-乳酸積累量達到20g/L，而副產(chǎn)物乙醇濃度降為8. 2g/L。


圖1 :pY14MET25-nox質粒圖譜和nox酶切驗證
A :pY14MET25-nox 質粒圖譜
B :nox酶切驗證
Marker =Ikb marker 1-2 未酶切質粒對照3_4 酶切后的質粒
圖2 :nox過量表達對S. cerevisiae生理代謝的影響
A :nox表達前后NADH/NAD+的值對比
B :nox表達前后NADH氧化酶活性對比
C :nox表達前后L-乳酸積累量曲線對比
D :nox表達前后乙醇積累量曲線對比
圖3 代謝工程策略對碳代謝流分配的影響
B 整合了 Idh的工程菌碳流分配
C :nox過量表達后工程菌碳流分配
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明發(fā)明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中有未注明具體條件的實驗方法，基本上是按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。實施例1高產(chǎn)乳酸低產(chǎn)乙醇工程菌的構建1、構建帶有l(wèi)dh-nox基因的質粒提取質粒ρ (212-ηοχ和ρΥ14ΜΕΤ25。用BamHI和Mil酶對兩質粒雙酶切(圖 1A)、回收、純化，連接(16°C過夜)。2、將步驟1)連接產(chǎn)物轉化將連接產(chǎn)物轉化到JM109感受態(tài)細胞中后，涂布帶有氨芐抗性的LB平板，經(jīng)37°C 過夜培養(yǎng)。3、提取質粒酶切驗證挑取轉化子提取質粒酶切驗證，發(fā)現(xiàn)均為陽性克隆。表明pY13MET25-nOX (圖1B) 已構建成功。4、將構建好的質粒由LiAc法轉化導入受體菌中，涂布Trp缺陷平板。長出菌落后傳代3次以上。5、驗證所述工程菌。挑取適量轉化子接種于種子培養(yǎng)基，提取質粒酶切驗證，得到所需菌株CEN.PK2-1C[LDH]-nox。 實施例2胞內(nèi)NADH/NAD+的測定和NADH氧化酶的測定1、胞內(nèi) NADH/NAD+ 的測定取30mL處于對數(shù)生長中期的細胞發(fā)酵液，于10000rpm、4°C下離心lOmin，去除上清液，并迅速置于液氮中以阻斷微生物代謝，取出置于-20°C保存?zhèn)溆谩：塑账岬奶崛“凑誐anley的處理方法。采用高效液相色譜(HPLC)測定，色譜分析條件為=Agilent ZORBAXSB-Aq C18 反相柱(250mmX4. 6mm)；流動相磷酸鹽緩沖液(10. 93g NaH2PO4 禾口 3. (MgNa2HPO4溶于純水中，加入四丁基溴化銨3. 22g，調節(jié)pH為6. 5，真空抽濾后定容至1L) 和乙腈配比為86 14;流速lmL/min;檢測波長254nm;柱溫35°C。所有樣品和標準品均用0. 22 μ m濾膜過濾后進樣10 μ L分析。NAD+、NADH在5min內(nèi)可以得到分離。胞內(nèi)NADH 和NAD+濃度至少是三次獨立提取過程的平均值。2、NADH氧化酶的測定參照Lopez de Felipe F 的方法。實施例3發(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)乳酸從新鮮斜面接一環(huán)S. cerevisiae入種子培養(yǎng)基YPD (80mL SC/250mL錐形瓶)，于 30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)中期(Mh)后，以8%接種量(ν/ν)接入裝有700mLYNB培養(yǎng)基的1.3L發(fā)酵罐(NEW Brun Swick/BLO FLO 110)中。發(fā)酵初始pH為5. 5，發(fā)酵過程中以8mol/L的NaOH維持pH保持5. 5。通氣量為1. 5L/min，溶氧控制為50%。發(fā)酵IOOh后， 目的產(chǎn)物L-乳酸積累量達到20g/L，而副產(chǎn)物乙醇濃度降為8. 2g/L。YPD種子培養(yǎng)基組成為(g/L)酵母膏10，葡萄糖20，蛋白胨20YNB 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L) :CaC034. 5，YNB (without (NH4) 2504) 1. 7，尿素 1，乙醇 5，葡萄糖70。實施例4L-乳酸、乙醇及葡萄糖的檢測L-乳酸和乙醇濃度的測定采用Agilent A1200高效液相色譜(HPLC)儀測定。色譜條件色譜柱AminexHPX-87H (Bio-Rad)流動相0.005mol/L H2SO4流速0. 6mL/min柱溫35°C進樣量5yL檢測器示差折光樣品制備5mL發(fā)酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，取上清液移入試管中以備測 L-乳酸、乙醇和殘余葡糖糖時用。測L-乳酸時，取ImL上清液移入IOmL容量瓶中，去離子水定容至刻線，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。結果表明n0X的過量表達，經(jīng)高效液相色譜檢測，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NADH和NAD+的濃度分別為0. 476 μ mol/g DCff和5. 944 μ mol/g DCW，未表達nox前胞內(nèi)NADH和NAD+的濃度分別為 0. 243 μ mol/g DCW 禾口 8. 103 μ mol/g DCW，胞內(nèi) NADH/NAD+ 比例降為 0. 03 (圖 2A)，經(jīng)酶活測定發(fā)現(xiàn)，NADH氧化酶活性提高到10. 7U/mg蛋白，是CEN. PK2-1C [LDH]的2. 9倍(圖2B)。 與CEN. PK2-1C[LDH]比較，nox的表達使突變株CEN. PK2-lC[LDH]-nox積累L-乳酸的能力提高了 33% (20g/L，圖2C)，而乙醇濃度下降了 49%，僅為8.2g/L(圖2D)。分析圖2C-D數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，隨著nox的過量表達(I)L-乳酸對葡萄糖產(chǎn)率系數(shù)由0. 165g/g提高到0. 289g/ g ；⑵而乙醇對葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)則從0. 183g/g降低為0. 119g/g ； (3) L-乳酸/乙醇的比例提高了 2. 6倍。 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
權利要求
1.一種產(chǎn)乳酸工程菌，其特征在于過量表達了源于Mi^ptococcus pneumoniae的 NADH氧化酶基因nox，通過調節(jié)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平，實現(xiàn)了碳代謝流的重新分配，促進 L-乳酸的積累并大幅度降低了副產(chǎn)物乙醇的積累量。
2.權利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)提取帶有nox基因的質粒和帶有LDH基因的質粒，對兩質粒雙酶切、回收、純化，連接；2)將步驟1)連接產(chǎn)物轉化到JM109感受態(tài)細胞中，涂布帶有氨芐抗性的LB平板，挑取轉化子；3)提取質粒酶切驗證；4)將構建好的質粒由LiAc法轉化導入受體菌中，涂布Trp缺陷平板；5)驗證所述工程菌；6)胞內(nèi)NADH/NAD+的測定；7)NADH氧化酶的測定。
3.根據(jù)權利要求2所述的構建方法，其特征在于步驟4)中所述受體菌為整合了LDH基因的酵母工程菌。
4.根據(jù)權利要求3所述的構建方法，其特征在于所述酵母菌為產(chǎn)乳酸，但副產(chǎn)物乙醇較高的酵母菌。
5.權利要求1所述產(chǎn)乳酸工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酸中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)的工藝為30°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)所述工程菌至對數(shù)中期，以8%接種量接種入發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)100小時；發(fā)酵參數(shù)為 pH5. 5，通氣量 1. 5L/min，溶氧 50%。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種高產(chǎn)乳酸工程菌及其構建方法和應用，屬于遺傳發(fā)酵工程領域。本發(fā)明通過游離表達的方式，將源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)過量表達于整合了乳酸脫氫酶(LDH)的工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]中，構建了L-乳酸合成能力進一步提高的基因工程菌S.cerevisiae CEN.PK2-1C[LDH]-nox。所述菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵100h后，發(fā)酵液中L-乳酸產(chǎn)量比出發(fā)菌株增加了33％，達到20g/L，而乙醇積累量則下降了49％，為8.2g/L，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/81GK102212489SQ201110091340
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權日2011年4月13日
發(fā)明者劉立明, 王菲菲, 趙亮亮, 陳堅 申請人:江南大學