專利名稱：：新穎的甘露聚糖酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文提供的技術(shù)涉及微生物甘露聚糖酶的經(jīng)改進(jìn)的變體，更具體地，涉及展示出甘露聚糖酶活性作為其主要酶活性的微生物酶；涉及編碼所述甘露聚糖酶的核酸分子，含有所述核酸的載體、宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)甘露聚糖酶的方法；包含所述甘露聚糖酶的組合物；用于制備和生產(chǎn)此類酶的方法；以及涉及使用此類酶用于食品和飼料加工，用于咖啡萃取和咖啡廢料加工，作為食品和飼料的補(bǔ)充劑，用于紙漿的酶輔助漂白，在紡織工業(yè)中作為漂白和/或脫衆(zhòng)劑，用于通過水力壓裂(hydraulicfracturing)進(jìn)行油井和氣井增產(chǎn)(oilandgaswell)，作為去垢劑，作為烘焙成分，用于除去生物膜以及用于遞送系統(tǒng)中，用于谷粒加工，或用于用以生產(chǎn)生物燃料的可再生資源的加工，以及用于紡織、探油、清潔、洗滌、去垢劑以及纖維素纖維加工工業(yè)的方法。
背景技術(shù)：
：內(nèi)-i3_l，4-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶；EC3.2.I.78)在基于甘露聚糖的多糖中催化甘露糖苷鍵的隨機(jī)水解。大多數(shù)甘露聚糖酶將寡糖降解為DP4(Biely和Tenkanen(1998)Enzymologyofhemicellulosedegradation,頁(yè)25-47,在Harman和Kubiceck(ed)TrichodermaandGliocladium,卷2,Taylor和FrancisLtd.London中)，但是，其已在甘露三糖上顯示出殘余活性，這指示了針對(duì)甘露糖結(jié)合在蛋白質(zhì)上的至少四個(gè)亞位點(diǎn)。水解的主要終產(chǎn)物通常是甘露二糖和甘露三糖，雖然也產(chǎn)生顯著量的甘露糖。一些甘露聚糖酶能降解結(jié)晶甘露聚糖。除水解外，若干甘露聚糖酶(包括來自里氏木霉的β_甘露聚糖酶)已顯示出作為糖苷鍵受體的甘露糖或甘露二糖形成轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物。甘露聚糖酶已分離自多種廣泛的生物，包括細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物。雖然大多是細(xì)胞外的，一些β_甘露聚糖酶看起來是與細(xì)胞關(guān)聯(lián)的。它們的表達(dá)通常是在甘露聚糖或半乳甘露聚糖上的生長(zhǎng)所誘導(dǎo)的，但是，來自里氏木霉的β_甘露聚糖酶還可被纖維素誘導(dǎo)，雖然其表達(dá)被葡萄糖和其它單糖遏制。經(jīng)常在相同生物中發(fā)現(xiàn)具有不同等電點(diǎn)的多種甘露聚糖酶，它們分別代表了來自不同基因的產(chǎn)物或來自相同基因的不同產(chǎn)物。通常，甘露聚糖酶具有40°C至70°C之間的溫和的溫度最優(yōu)值，除了來自嗜熱生物的一些β_甘露聚糖酶(Politz等人(2000)Ahighlythermostableendo-1,4-β-mannanasefromthemarinebacteriumRhodothermusmarinus；Appl.Microbiol.Biotechnol.53:715-721)。pH最優(yōu)值在中性或酸性區(qū)中，例如對(duì)于來自里氏木霉的β-甘露聚糖酶而言ρΗ5·O(Arisan-Atac等人(1993)Purificationandcharacterisationofaβ-mannanaseofTrichodermareeseiC-30；Appl.Microbiol.Biotechnol.39:58-62)。酶的分子量在30kD和80kD的范圍內(nèi)。WO002008009673公開了里氏木霉甘露聚糖酶的變體，其改進(jìn)了熱穩(wěn)定性和低PH/胃蛋白酶抗性，以用于水解含有半乳甘露聚糖的植物材料(例如，棕櫚仁渣(palmkernelexpelIer,PKE))以及用于動(dòng)物飼料。例如，熱穩(wěn)定性是在包含高溫的造粒流程之前摻入飼料混合物中的飼料添加劑所需要的。此外，作為飼料添加劑應(yīng)用的甘露聚糖酶需要是低PH穩(wěn)定和胃蛋白酶穩(wěn)定的，其必須在低pH下具有活性，以在(例如單胃動(dòng)物的)胃中高效工作。但是，在飼料工業(yè)中的趨勢(shì)是日益增加造粒溫度。目前，目標(biāo)是在90°C至95°C造粒溫度左右的酶穩(wěn)定性，以使得能在所有工業(yè)相關(guān)的飼料生產(chǎn)車間使用酶。因此，具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的甘露聚糖酶的可用性將是高度有利的，因?yàn)槠湓试S在具有高操作溫度的車間中也使用該酶。
發(fā)明內(nèi)容在第一個(gè)方面，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式提供了甘露聚糖酶變體，其具有與親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同的氨基酸序列，并且具有一種或多種有利的性質(zhì)。此類性質(zhì)可包括但不限于有益的熱穩(wěn)定性；溫度/活性曲線；PH/活性曲線；比活性；以及pH/蛋白酶-敏感性。在另一方面，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式涉及包含下述甘露聚糖酶的甘露聚糖酶變體，所述甘露聚糖酶在選自66、215或259構(gòu)成的組的一處或多處位置上含有取代，其中每個(gè)位置對(duì)應(yīng)于親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)的位置。在另一方面，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式涉及具有下述氨基酸序列的甘露聚糖酶變體，所述氨基酸序列與親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同，其較之SEQIDNO1的氨基酸序列包含變異201S、207F和274L以及位于對(duì)應(yīng)于位置66、215或259的一處或多處位置上的至少一種變異。在還一方面，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式提供了編碼本文公開的甘露聚糖酶變體的核酸，以及包含此類核酸的載體和宿主細(xì)胞。在其它一些實(shí)施方式中，序列被用于生產(chǎn)甘露聚糖酶變體的工藝中。此外，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式一般地涉及甘露聚糖酶變體用于消化半乳甘露聚糖的用途，特別是催化基于甘露聚糖的多糖中甘露糖苷鍵的隨機(jī)水解。有利地，本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體可用于工業(yè)應(yīng)用，包括例如，用于淀粉液化和用于增強(qiáng)半乳甘露聚糖在食品和動(dòng)物飼料中的消化的方法。有利地，根據(jù)本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式的甘露聚糖酶變體可用于并且用于酒精發(fā)酵工藝和/或生產(chǎn)，用于咖啡萃取和咖啡廢料加工，作為食品和飼料的補(bǔ)充劑，用于紙漿的酶輔助漂白，在紡織工業(yè)中作為漂白和/或脫漿劑，用于通過水力壓裂進(jìn)行油井和氣井增產(chǎn)，作為去垢劑，作為烘焙成分，用于除去生物膜以及用于遞送系統(tǒng)中，用于谷粒加工，或用于用以生產(chǎn)生物燃料的可再生資源的加工，以及用于紡織、探油、清潔、洗滌、去垢劑以及纖維素纖維加工工業(yè)。在其它一些方面，本文公開內(nèi)容涉及包含本文所述的甘露聚糖酶變體的酶組合物，其中所述酶組合物可用于或用于商業(yè)應(yīng)用。在一種實(shí)施方式中，酶組合物可以是動(dòng)物飼料組合物。在其它一些實(shí)施方式中，酶組合物可用于淀粉水解(例如液化)工藝。在一種有利的實(shí)施方式中，變體和/或酶組合物可用于酒精發(fā)酵工藝。在另一些實(shí)施方式中，包含本文公開內(nèi)容所包括的甘露聚糖酶的酶組合物將包括另外的酶，例如植酸酶、葡糖淀粉酶、α淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶及其組合。在另一方面，本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式涉及在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)甘露聚糖酶變體的方法，所述方法通過這樣來進(jìn)行用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體有利地包括在宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，在允許所述甘露聚糖酶表達(dá)的合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)所述甘露聚糖酶。該方法還可包括回收生產(chǎn)的甘露聚糖酶。在一種實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是真菌，例如木霉屬(Trichoderma)(例如里氏木霉)，酵母，細(xì)菌或植物細(xì)胞。在本文公開內(nèi)容的一種有利的實(shí)施方式中，甘露聚糖酶變體具有SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8或SEQIDNO9的序列或其變體、經(jīng)修飾的形式、同源體、融合蛋白、功能等同物或片段。在詳細(xì)描述本文公開內(nèi)容之前，應(yīng)當(dāng)理解，本文公開內(nèi)容不僅限于所描述的設(shè)備的特定組成部分或者所描述的方法的工藝步驟，因?yàn)榇祟愒O(shè)備和方法是可變的。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方式的目的，其并不意味著限制。應(yīng)當(dāng)注意，在用于本申請(qǐng)文件和所附權(quán)利要求中時(shí)，單數(shù)形式“一個(gè)/種”和“這個(gè)/種”(“a”、“an”和“the”)包括單數(shù)和復(fù)數(shù)指代，除非上下文有明確其它指示。此外還要理解，當(dāng)給出數(shù)值界定的參數(shù)范圍時(shí)，所述范圍被視為包括這些界定值。為在不過度加長(zhǎng)申請(qǐng)文件的情況下提供全面的公開內(nèi)容，申請(qǐng)人在此通過引用并入上文提到的每篇專利和專利申請(qǐng)，特別是WO2008/009673的公開內(nèi)容。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示了野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)。圖2顯示了WO2008/009673中公開的里氏木霉甘露聚糖酶變體V_31的氨基酸序列(SEQIDNO2)ο圖3顯示了WO2008/009673中公開的另一里氏木霉甘露聚糖酶變體V-31/S3R的氣基酸序列(SEQIDNO3)ο圖4顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的一種有利的甘露聚糖酶變體TM-I的氨基酸序列(SEQIDNO4)ο圖5顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體TM-I(SEQIDNO4)的核酸序列(SEQIDNO5)ο圖6顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的另一有利的甘露聚糖酶TM-100變體的氨基酸序列(SEQIDNO6)。圖7顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的另一有利的甘露聚糖酶變體TM-108的氨基酸序列(SEQIDNO7)ο圖8顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的另一有利的甘露聚糖酶變體TM-CBD-148的氨基酸序列(SEQIDNO8)ο圖9顯示了根據(jù)本文公開內(nèi)容的另一有利的甘露聚糖酶變體TM-144的氨基酸片列(SEQIDNO9)。圖10顯示了在熱穩(wěn)定性和活性方面對(duì)親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶與S3R變體的比較。圖11顯示了纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)的氨基酸序列。發(fā)明詳述本文公開了里氏木霉甘露聚糖酶(EC3.2.I.78)的變體以及編碼可用于工業(yè)應(yīng)用(包括用于蛋白水解、生物質(zhì)降解和用于增強(qiáng)食品和/或動(dòng)物飼料中含有的半乳甘露聚糖的消化的方法)的甘露聚糖酶的核酸。特別地，根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體較之所用的親本甘露聚糖酶，顯示出特別改進(jìn)的熱穩(wěn)定性、PH/胃蛋白酶穩(wěn)定性以及同時(shí)改進(jìn)的或保持的比活性。這些特征使得它們特別有用于動(dòng)物飼料、食品中的工業(yè)應(yīng)用以及一般而言的植物材料中的半乳甘露聚糖降解。本文公開內(nèi)容揭示了具有源于SEQIDNO:I所示氨基酸序列的氨基酸序列的酶或其變體、經(jīng)修飾的形式、同源體、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一種或多種插入、缺失或突變或其任何組合的酶。根據(jù)本文公開內(nèi)容的同源甘露聚糖酶包含優(yōu)選與SEQIDNOI、更優(yōu)選與SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO8或SEQIDNO9具有至少70%的序列同一性或優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的任何酶。本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體具有甘露聚糖酶活性，并且具有由于包含一處或多處變異(包括取代、插入和缺失)而不同于親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO:I)的氨基酸序列。在一種有利的實(shí)施方式中，甘露聚糖酶變體的氨基酸序列較之SEQIDNO:1的氨基酸至少包含變異201S、207F和274L，以及位于對(duì)應(yīng)于位置66、215或259的一處或多處位置上的至少一種變異。例如，有利地，甘露聚糖酶變體中的變異可選自66P、215T和259R構(gòu)成的組。本文公開內(nèi)容的一種有利的實(shí)施方式是根據(jù)SEQIDNO:4的甘露聚糖酶變體或其變體、經(jīng)修飾的形式、同源體、融合蛋白、功能等同物或片段，或包含一種或多種插入、缺失或突變或其任何組合的甘露聚糖酶變體，以及與SEQIDNO4的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性的甘露聚糖酶，其中所述最小百分比同一性和/或同源性為至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。在另一些有利的實(shí)施方式中，根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體除包含變異201S、207F和274L之外以及對(duì)應(yīng)于位置66、215或259的一處或多處位置上的變異之外還包含位置3和/或181上的變異(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1的氨基酸序列的位置而言)。例如，位置3上的變異是3R，位置181上的變異是181A或181H(181/A/H)。在另一些有利的實(shí)施方式中，根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體包含變異201S、207F和274L以及至少還包含位于位置66、215和259上的變異(較之SEQIDNO1的氨基酸序列而言)。在一種有利的實(shí)例中，位置66、215和259上的變異分別是66P、215T和259R。在另一實(shí)施方式中，較之SEQIDNO:I的氨基酸序列，甘露聚糖酶變體除包含變異201S、207F和274L以及位置66、215和259上的變異之外，還包含位置上的變異，優(yōu)選地，181A/H。在一種有利的實(shí)施方式中，甘露聚糖酶變體還包含位置3上的變異，例如3R。在一種有利的實(shí)施方式中，根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體的氨基酸序列至少包含變異201S、207F和274L，以及至少還包含在對(duì)應(yīng)于位置66、215或259的一處或多處位置上的變異，以及下述一種或多種額外的變異，其中變異位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344(較之SEQ.IDNO1的氨基酸序列)。例如，變異是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。本文公開內(nèi)容的一些有利實(shí)施方式是下述甘露聚糖酶變體,所述變體與根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶至少具有最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性為至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。一些有利的實(shí)施方式是下述甘露聚糖酶變體，所述變體具有甘露聚糖酶活性，以及具有與親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNOI)不同的氨基酸序列，其中所述甘露聚糖酶變體的氨基酸包含變異201S、207F和274L，以及至少還包含選自下組的變異，所述組由1)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L13)F3IY/S66P/Q97R/N173H/V181H/A2I5T/Q259R/N282D14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D18)F3IY/S66P/N173H/V181H/A2I5T/Q259R/N282D19)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L20)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D21)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D22)F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D23)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D24)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D25)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S26)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D27)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S28)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S29)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S30)S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R31)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S32)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R33)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S34)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280L35)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L36)F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D37)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D38)F3IY/S66P/Q97R/V181H/A2I5T/Q259R/N282D39)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S40)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S41)S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D42)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S43)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D44)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D45)S66P/V181H/A215T/Q259R46)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D47)F3IY/S66P/N173T/V181H/A2I5T/Q259R/N282D48)F3IY/S66P/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280R/N344D49)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D50)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S51)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S52)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R53)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S54)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D55)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D56)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R57)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S58)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S59)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S60)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S61)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S62)S66P/A215T/Q259R63)S3R/S66P/A215T/Q259R構(gòu)成。本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式還包括序列I)至63)中示出的任何甘露聚糖酶的變體，所述變體具有甘露聚糖酶活性，并且具有下述氨基酸序列，所述氨基酸序列較之序列I)至63)示出的每種甘露聚糖酶變體具有至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少95%、至少96%，至少97%，至少98%和至少99%的百分比序列同一性和/或百分比同源性。本文公開內(nèi)容的另一些實(shí)施方式是選自下組的核酸分子，所述組由a)編碼根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體的核酸分子；b)編碼根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體的衍生物的核酸分子，優(yōu)選地所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守取代；C)核酸分子，其是SEQIDNO:5所示的核酸分子的片斷、變體、同源體、衍生物或片段；d)核酸分子，其能在嚴(yán)格條件下與a)_c)中任何核酸分子雜交；e)核酸分子，其能在嚴(yán)格條件下與a)_c)中任何核酸分子的互補(bǔ)序列雜交；f)核酸分子，其與a)_e)中任何核酸分子具有至少95%的序列同一性,并且編碼甘露聚糖酶，g)核酸分子，其與a)_e)中任何核酸分子具有至少70%的序列同一性,并且編碼甘露聚糖酶，h)或a)_g)中任何核酸分子的互補(bǔ)序列構(gòu)成。本文公開內(nèi)容的其它一些實(shí)施方式是包含編碼根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體的核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。此外，一些實(shí)施方式是用于制備根據(jù)本文公開內(nèi)容的甘露聚糖酶變體的方法，所述方法包括培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)物中分離經(jīng)修飾的甘露聚糖酶。除非本文另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本文公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。Singleton，等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,20ED.，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)和Hale&Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)為技術(shù)人員提供了本文公開內(nèi)容中所使用的很多術(shù)語(yǔ)的通用詞典。本文公開內(nèi)容并不受本文公開的示例性方法和材料的限制，與本文所描述的這些相似或等同的任何方法和材料均可用于實(shí)踐或測(cè)試本文公開內(nèi)容的實(shí)施方式。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另有指明，分別地，核酸序列以5’至3’方向從左到右書寫；氨基酸序列以氨基到羧基方向從左到右書寫。本文提供的標(biāo)題并不是對(duì)本文公開內(nèi)容的多個(gè)方面或?qū)嵤┓绞降南拗?，本文公開內(nèi)容應(yīng)當(dāng)參照作為整體的申請(qǐng)文件。因此，下面即將定義的術(shù)語(yǔ)將參照作為整體的申請(qǐng)文件而被更完整地定義。在本文公開內(nèi)容的一種實(shí)施方式中，甘露聚糖酶顯示出較之W02008/009673公開的甘露聚糖酶酶而言特別改進(jìn)的熱穩(wěn)定性，以及同時(shí)還顯示出改進(jìn)的或保持的比活性。這些特征使得它們特別有用于動(dòng)物飼料、食品中的工業(yè)應(yīng)用以及特別有用于一般而言的植物材料中的半乳甘露聚糖降解。因此，本文公開內(nèi)容還涉及在里氏木霉生產(chǎn)甘露聚糖酶的方法，所述甘露聚糖酶在如動(dòng)物的胃和上部腸(upperintesine)以及禽類的嗉囊、胃和上部腸中存在的低pH值下具有活性。本文公開內(nèi)容的另一目標(biāo)是提供可在造粒之前加入到動(dòng)物飼料中的甘露聚糖酶，以允許精確和可再生的酶劑量，并且避免飼料制備中額外的噴霧步驟。術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖酶”指能水解由甘露糖單位構(gòu)成的多糖鏈(甘露糖聚合物(mannopolymer)或多聚甘露糖(polymannose))的酶?！案事毒厶敲浮币虼税瑑?nèi)切甘露聚糖酶和外切甘露聚糖酶兩者，它們分別在聚合物的內(nèi)部和從聚合物的末端來切割甘露糖聚合物。術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖酶的功能等同物”或“其功能等同物”表示，該酶必須具有與里氏木霉甘露聚糖酶大致相同的功能特征。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)修飾的形式”或“變體”表示，該酶已從其原始形式(親本/野生型，Wt)經(jīng)過修飾，但保留了與里氏木霉甘露聚糖酶相同的酶促功能特征。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”包含通過在C-和/或N-末端共價(jià)融合額外的氨基酸序列而衍生自親本甘露聚糖酶或其任何變體的所有蛋白。額外的氨基酸序列的來源和組成是天然來自任何活的生物或病毒的或可以是非天然的。術(shù)語(yǔ)“功能片段”或“有效片段”表示里氏木霉甘露聚糖酶或其衍生物的保留了大致相同的酶促功能或效果的片段或部分。根據(jù)本文公開內(nèi)容的術(shù)語(yǔ)“同源甘露聚糖酶”包含與親本甘露聚糖酶具有至少70%或者優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、97%或99%的序列同一性的任何酶。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”對(duì)應(yīng)任何長(zhǎng)度和任何序列的任何遺傳材料，包含單鏈和雙鏈的DNA和RNA分子，包括調(diào)控元件、結(jié)構(gòu)基因、基因的組、質(zhì)粒、完整基因組及其片段。術(shù)語(yǔ)多核苷酸或多肽中的“位置”表示分別在多核苷酸或多肽的序列中特定的單個(gè)堿基或氨基酸。術(shù)語(yǔ)“多肽”包括蛋白質(zhì)例如酶，抗體等沖等長(zhǎng)度的多肽，例如肽抑制劑，細(xì)胞因子等；以及短至氨基酸序列長(zhǎng)度少于10的短肽，例如肽性受體配體，肽激素等。術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖酶變體”表示通過定點(diǎn)誘變或隨機(jī)誘變、插入、缺失、重組和/或任何其它蛋白工程化方法獲得的任何甘露聚糖酶分子，其導(dǎo)致產(chǎn)生氨基酸序列與親本甘露聚糖酶有所不同的甘露聚糖酶。根據(jù)本文公開內(nèi)容，術(shù)語(yǔ)“野生型甘露聚糖酶”、“野生型酶”或“野生型”描述了具有在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的甘露聚糖酶或其片段?！坝H本甘露聚糖酶”可以是經(jīng)分離的野生型甘露聚糖酶或其片段，或選自甘露聚糖酶文庫(kù)的一種或多種甘露聚糖酶變體。術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖酶文庫(kù)”描述了至少一種甘露聚糖酶變體或甘露聚糖酶的混合物，其中每種單種甘露聚糖酶，每種甘露聚糖酶變體分別被不同的多核苷酸序列編碼。術(shù)語(yǔ)“基因文庫(kù)”指編碼甘露聚糖酶文庫(kù)的多核苷酸的文庫(kù)。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)分離的”描述了與其天然來源分開的任何分子。術(shù)語(yǔ)“突變”指對(duì)單個(gè)或多個(gè)核苷酸三聯(lián)體的取代或替換、對(duì)一個(gè)或多個(gè)密碼子的插入或缺失、不同基因之間的同源或異源重組、在編碼序列任一端的額外編碼序列融合，或額外編碼序列的插入或這些方法的任何組合，它們導(dǎo)致產(chǎn)生編碼想要的蛋白的多核酸序列。因此，術(shù)語(yǔ)“突變”還指經(jīng)一種或多種上述改變修飾的多核酸序列編碼的多肽序列中的所有改變。氨基酸殘基按照下表I中縮寫為單字母編碼或三字母編碼。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”或“核酸”意欲表示任何單鏈或雙鏈的cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA、PNAS或LNA來源的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”指下述條件，在這樣的條件下，探針將與其靶亞序列雜交，而不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同情況下將有所不同。較長(zhǎng)的序列在較高的溫度下特異性雜交。通常，嚴(yán)格條件被選擇為比給定離子強(qiáng)度和PH下針對(duì)特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm是平衡時(shí)與靶序列互補(bǔ)的探針有50%與靶序列雜交的溫度(在給定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)。(因?yàn)榘行蛄型ǔ＿^量存在，在Tm下，平衡時(shí)探針的50%被占據(jù))。通常，嚴(yán)格條件將是下述這些，其中，鹽濃度低于大約I.OMNa離子，通常，于pH7.O至8.3大約O.01至I.OMNa離子(或其它鹽)，溫度為針對(duì)短探針(例如10至50個(gè)核苷酸)至少大約30°C和針對(duì)更長(zhǎng)的探針至少大約60°C。嚴(yán)格條件還可通過添加去穩(wěn)定試劑(例如甲酰胺等等)來獲得。術(shù)語(yǔ)“核酸分子的片段”意欲表示包含根據(jù)要求保護(hù)的序列之一的核酸分子的亞組(subset)的核酸。這同樣適用于術(shù)語(yǔ)“核酸分子的片斷(fraction)”。術(shù)語(yǔ)“核酸分子的變體”在本文中指與根據(jù)要求保護(hù)的序列之一的核酸分子結(jié)構(gòu)和生物活性上基本相似的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“核酸分子的同源體”指下述核酸分子，其序列較之根據(jù)要求保護(hù)的序列之一的核酸分子而言具有一個(gè)或多個(gè)添加的、缺失的、取代的或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸，并且一直存在如下前提同源體保持了與后者(即根據(jù)要求保護(hù)的序列之一的核酸分子)基本相同的結(jié)合性質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“衍生物”在本文中使用時(shí)指與靶核酸序列(如根據(jù)要求保護(hù)的序列之一的核酸分子)具有相似的結(jié)合特征的核酸分子。表I:氨基酸縮寫縮寫__氨基酸「AAla丙氨酸-;------CCys半胱氨酸PAsp天冬氨酸_EGlu谷氨酸_FPhe苯丙氨酸GGly甘氨酸_HHis組氨酸_IHe異亮氨酸KLys賴氣酸_LLeu亮氨酸_MMet甲疏氨酸NAsn天冬酰胺PPro脯氨酸_QGIn谷氨酰胺RArg精氨酸_SSer絲氨酸_TThr蘇氨酸_VVal纈氛酸_WTrp色氨酸_YTyr酪氨酸_使用下述命名規(guī)則來描述突變或變異位置；取代的氨基酸殘基。根據(jù)該命名規(guī)貝U，例如，在位置20用甘氨酸殘基取代丙氨酸殘基被表示為20G。當(dāng)給定位置的氨基酸殘基被兩個(gè)或多個(gè)備選氨基酸殘基取代時(shí)，這些殘基被逗號(hào)或斜線分開。例如，在位置30用甘氨酸或谷氨酸取代丙氨酸被表示為20G/E，或20G，20E。此外，還可使用下述命名規(guī)則蛋白骨架中的氨基酸殘基；位置；取代的氨基酸殘基。根據(jù)該命名規(guī)則，例如，在位置20用甘氨酸殘基取代丙氨酸殘基被表示為Ala20Gly或A20G，或20G。在同樣的位置缺失丙氨酸被顯示為Ala20*或A20插入另外的氨基酸殘基(例如甘氨酸)被表示為Ala20AlaGly或A20AG。缺失連續(xù)一段氨基酸殘基(例如位置20的丙氨酸和位置21的甘氨酸之間)被表示為Λ(Ala20-Gly21)或Λ(A20-G21)。當(dāng)序列較之用于編號(hào)的親本蛋白含有缺失時(shí)，在此類位置(例如缺失的位置20中的丙氨酸)的插入被表示為*20Ala或*20A。多個(gè)突變被加號(hào)或斜線分開。例如，位置20和21中分別取代丙氨酸和谷氨酸為甘氨酸和絲氨酸的兩個(gè)突變被表示為A20G+E21S或A20G/E21S。當(dāng)給定位置上的氨基酸殘基被兩個(gè)或多個(gè)備選的氨基酸殘基取代時(shí)，這些殘基被逗號(hào)或斜線分開。例如，用甘氨酸或谷氨酸取代位置30的丙氨酸被表示為A20G，E或A20G/E或A20G，、A20E。當(dāng)本文中鑒定了適于修飾的位置但沒有建議任何特定的修飾的話，應(yīng)當(dāng)理解，任何氨基酸殘基可取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提到位置20的丙氨酸的修飾但無特指時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，丙氨酸可被缺失或取代為任何其它氨基酸殘基(即，R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V中的任一)。術(shù)語(yǔ)“保守突變”或“保守取代”分別表示本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為是對(duì)第一突變來說保守的氨基酸突變?！氨Ｊ亍痹诒疚纳舷挛闹斜硎驹诎被崽卣鞣矫嫦嗨频陌被帷Ｈ绻?，例如，突變導(dǎo)致特定位置上產(chǎn)生脂肪族氨基酸殘基(例如Leu)對(duì)非脂肪族氨基酸殘基(例如Ser)的取代，則用不同的脂肪族氨基酸(例如Ile或Val)在相同位置進(jìn)行取代被稱為保守突變。其它氨基酸特征包括殘基的大小、疏水性、極性、電荷、PK值和本領(lǐng)域已知的其它氨基酸特征。因此，保守突變可包括取代，例如堿性取代堿性、酸性取代酸性、極性取代極性，等等。由此衍生的氨基酸的組可能由于結(jié)構(gòu)原因而是保守的。這些組可被描述為Venn圖表的形式(LivingstoneC.D.和BartonG.J.(1993)"Proteinsequencealignmentsastrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation〃Comput.ApplBiosci.9:745-756；TaylorW.R.(1986)"Theclassificationofaminoacidconservation"J.Theor.Biol.119;205_218)。保守取代可例如根據(jù)下表來進(jìn)行，下表描述了通常被接受的氨基酸Venn圖表分組。表2Venn圖表分組的氨基酸權(quán)利要求1.甘露聚糖酶變體，其較之甘露聚糖酶SEQIDNO3而言具有至少3°C的改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。2.權(quán)利要求I的甘露聚糖酶變體，其中所述改進(jìn)的熱穩(wěn)定性在大約4°C至大約9.3°C的范圍內(nèi)。3.權(quán)利要求I或2的甘露聚糖酶變體，其中所述改進(jìn)的熱穩(wěn)定性在大約5.7V至大約9.3°C的范圍內(nèi)。4.甘露聚糖酶變體，其較之甘露聚糖酶SEQIDNO:3而言具有至少107%的改進(jìn)的比活性。5.權(quán)利要求4的甘露聚糖酶變體，其中所述改進(jìn)的比活性在大約107%至大約212%的范圍內(nèi)。6.甘露聚糖酶變體，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有與親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶變體的氨基酸包含變異201S、207F和274L，以及位于對(duì)應(yīng)于位置66、215或259的一處或多處位置的變巳升。7.權(quán)利要求6的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體還包含變異3R。8.權(quán)利要求6或7的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體還包含變異181A/H。9.權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體至少包含位于對(duì)應(yīng)于位置66、215和259的位置處的變異。10.權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體至少包含位于對(duì)應(yīng)于位置3、66、215和259的位置處的變異。11.權(quán)利要求6至8中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體至少包含位于對(duì)應(yīng)于位置3、66、181、215和259的位置處的變異。12.權(quán)利要求6至11中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中位于位置66、215或259中一處或多處的變異分別是66P、215T和259R。13.權(quán)利要求6至12中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中位于位置3、66、215或259中一處或多處的所述變異分別是3R、66P、215T和259R。14.權(quán)利要求6至13中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中位于位置3、66、215或259中一處或多處的所述變異分別是3R、66P、181A/H、215T和259R。15.權(quán)利要求6至14中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中所述甘露聚糖酶變體還包含一處或多處另外的變異，其中所述變異位置是31、97、113、146、149、173、181、280、282、331或344。16.權(quán)利要求6至15中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶變體，其中所述變異是31Y、97R、113Y、146Q、149K、173H/T、181H/A、280S/L/R、282D、331S或344D。17.甘露聚糖酶，其與權(quán)利要求I至16的甘露聚糖酶具有至少最小百分比序列同一性和/或百分比同源性，其中所述最小百分比同一性和/或同源性為至少50%，至少60%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少93%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%。18.甘露聚糖酶變體，其具有甘露聚糖酶活性，并且具有與親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)不同的氨基酸序列，其中，所述甘露聚糖酶變體的氨基酸包含變異201S、207F和274L，以及至少地選自下組的變異，所述組由DF31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S2)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S3)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D4)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S5)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D6)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L7)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R8)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S9)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R10)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D11)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D/N331S12)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L13)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D14)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D15)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R16)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D17)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280L/N282D18)F31Y/S66P/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D19)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280L20)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D21)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D22)F31Y/S66P/Q97R/N173T/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D23)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D24)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D25)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S26)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N282D27)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N331S28)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280R/N282D/N331S29)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S30)S66P/Q97R/N113Y/N173T/V181A/A215T/Q259R31)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S32)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R33)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S34)F3IY/S66P/Q97R/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280L35)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L36)F31Y/S66P/Q97R/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D37)S66P/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D38)F3IY/S66P/Q97R/V181H/A2I5T/Q259R/N282D39)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S40)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S41)S66P/V181H/A215T/Q259R/N282D42)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/K146Q/V181H/A215T/Q259R/Q280L/N331S43)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/N282D44)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/N282D45)S66P/V181H/A215T/Q259R46)S66P/Q97R/N113Y/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D47)F3IY/S66P/N173T/V181H/A2I5T/Q259R/N282D48)F3IY/S66P/N1I3Y/V181H/A2I5T/Q259R/Q280R/N344D49)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D50)F31Y/S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S51)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S52)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R53)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S54)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D55)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280R/N282D56)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R57)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/N331S58)F31Y/S66P/Q97R/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N282D/N331S59)S66P/N113Y/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S60)S66P/Q97R/N113Y/N173H/V181A/A215T/Q259R/Q280S/N331S61)F31Y/S66P/Q97R/Q149K/N173H/V181H/A215T/Q259R/Q280S/N331S62)S66P/A215T/Q259R63)S3R/S66P/A215T/Q259R構(gòu)成。19.核酸分子，其選自下組，所述組由i)編碼根據(jù)權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)的甘露聚糖酶的核酸分子；j)編碼根據(jù)權(quán)利要求1-18中任意一項(xiàng)的經(jīng)修飾的甘露聚糖酶的衍生物的核酸分子，優(yōu)選地所述衍生物中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守取代；k)核酸分子，其是SEQIDNO:5所示的核酸分子的片斷、變體、同源體、衍生物或片段；I)核酸分子，其能在嚴(yán)格條件下與a)_d)中任何核酸分子雜交；m)核酸分子，其能在嚴(yán)格條件下與a)-d)中任何核酸分子的互補(bǔ)序列雜交；n)核酸分子，其與a)-f)中任何核酸分子具有至少95%的序列同一性，并且編碼甘露聚糖酶；0)核酸分子，其與a)_f)中任何核酸分子具有至少70%的序列同一性，并且編碼甘露聚糖酶；P)或a)_h)中任何核酸分子的互補(bǔ)序列構(gòu)成。20.包含權(quán)利要求19的核酸分子的載體。21.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求20的載體轉(zhuǎn)化和/或包含權(quán)利要求19的核酸分子。22.SEQIDNO5的核酸分子。23.用于制備根據(jù)權(quán)利要求I至18中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的甘露聚糖酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)物中分離所述經(jīng)修飾的甘露聚糖酶。24.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至18中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的甘露聚糖酶。25.權(quán)利要求24的組合物，其適用于食品和飼料加工，作為食品和飼料的補(bǔ)充劑，用于酶輔助的紙漿漂白，用于通過水力壓裂的油井和氣井增產(chǎn)，作為去垢劑，用于除去生物膜，或者用于遞送系統(tǒng)中。26.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)修飾的甘露聚糖酶的用途用于食品和飼料加工，用于咖啡萃取，用于咖啡廢料加工，籲作為食品和飼料的補(bǔ)充劑，用于酶輔助的紙漿漂白，籲作為紡織工業(yè)中的漂白劑和/或脫漿劑，用于通過水力壓裂的油井和氣井增產(chǎn)，籲作為去垢劑，用于除去生物膜，用于遞送系統(tǒng)中，和/或用于加工意欲用于生產(chǎn)生物燃料的可再生資源。全文摘要本文公開內(nèi)容提供了新穎的甘露聚糖酶變體，其具有不同于親本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列，并且其具有一種或多種有利的性質(zhì)，例如改進(jìn)的熱穩(wěn)定性；溫度/活性曲線；pH/活性曲線；比活性；以及pH/蛋白酶敏感性。新穎的甘露聚糖酶變體可用于并且用于酒精發(fā)酵工藝和/或生產(chǎn)，用于咖啡萃取和咖啡廢料加工，作為食品和飼料的補(bǔ)充劑，用于酶輔助的紙漿漂白，在紡織工業(yè)中作為漂白和/或脫漿劑，用于通過水力壓裂進(jìn)行油井和氣井增產(chǎn)，作為去垢劑，作為烘焙成分，用于除去生物膜以及用于遞送系統(tǒng)中，用于谷粒加工，或用于用以生產(chǎn)生物燃料的可再生資源的加工，以及用于紡織、探油、清潔、洗滌、去垢劑以及纖維素纖維加工工業(yè)。文檔編號(hào)C12N5/00GK102712881SQ201080061452公開日2012年10月3日申請(qǐng)日期2010年11月24日優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日發(fā)明者O·肯施申請(qǐng)人:巴斯夫歐洲公司