專利名稱：母系誘導(dǎo)的動物不育的制作方法
母系誘導(dǎo)的動物不育相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2009年11月23日提交的美國臨時申請?zhí)?1/263,468的優(yōu)先權(quán)，其公開的內(nèi)容在此整體并入。對在聯(lián)邦政府資助的研究與發(fā)展下做出的發(fā)明權(quán)利的聲明本發(fā)明部分由美國科學(xué)和技術(shù)研究院先進(jìn)技術(shù)項目(NIST-ATP)協(xié)議#70NANB3H3043和美國國家科學(xué)基金會SBIR基金#0912837的政府基金資助。發(fā)明背景 存在對控制入侵物種和害蟲例如魚類、兩棲動物、軟體動物、甲殼類動物(crustaceans)和昆蟲的技術(shù)的需要，該技術(shù)能替代用于大規(guī)模釋放的輻射誘導(dǎo)的不育雄性?？煽康牟挥夹g(shù)對基因工程的應(yīng)用以使有益物種改進(jìn)性狀(例如，疾病抗性、改良生長或發(fā)育、殺蟲劑抗性、破壞疾病傳播機(jī)制)同樣是有價值的。傳統(tǒng)上，商業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖中已通過三倍體誘導(dǎo)(增加一套額外的染色體)來產(chǎn)生不育的魚類。然而，通常認(rèn)為三倍性能對許多物種的性能產(chǎn)生負(fù)面影響，并且最優(yōu)方案是物種依賴性的。該技術(shù)的應(yīng)用勞動量大，而且難以保證100%的魚是三倍體并因此是不育的。更簡單的解決方案是用轉(zhuǎn)基因或突變介導(dǎo)不育。已提議并測試了幾種轉(zhuǎn)基因方法來實現(xiàn)不育，但是時至今日，這些方法充其量是部分成功的。生理、細(xì)胞和分子水平上的不育尚未被證實(Thresheret al. (2009)Aquaculture 290:104-09 以及 Wong&vanEenennaam(2008)Aquaculture 275 :1-12)。主要障礙在于需要暫時逆轉(zhuǎn)不育以繁殖品系。期望的是不需要在每一代都重復(fù)處理的解決方案。以開發(fā)轉(zhuǎn)基因不育魚為目的的大部分研究集中于使參與性腺生長、分化和成熟的激素失活的方法。所推薦的激素靶標(biāo)包括促性腺激素釋放激素、卵泡刺激素和促黃體激素。這些關(guān)鍵基因的沉默原則上應(yīng)能導(dǎo)致性不成熟和不育的魚類，其生育力可通過外源遞送缺失的激素來挽救。雖然理論上是巧妙的，但是該方法中存在許多固有的困難。首要問題是在一些魚類基因組中存在多種激素基因家族成員。此外，這些激素具有生育力以外的生物功能。最后，在依賴于敲低技術(shù)的模型中，不育并非100%，并且生育力的降低在性別和建群系之間不同。沉默內(nèi)源性生殖基因的備選方法是產(chǎn)生具有這樣的基因的轉(zhuǎn)基因系，該基因經(jīng)設(shè)計能破壞早期胚胎發(fā)育模式形成中關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，致使胚胎死亡。該方法利用基因敲低技術(shù)如反義RNA和dsRNA，或者利用成形基因的錯誤表達(dá)。將這些胚胎破壞物置于胚胎特異性啟動子的控制下，所述胚胎特異性啟動子在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)。為實現(xiàn)可逆性并允許品系繁殖，將構(gòu)建體設(shè)計為使細(xì)菌阻抑系統(tǒng)置于啟動子和關(guān)鍵發(fā)育基因破壞物之間。該系統(tǒng)利用商購的Tet-響應(yīng)PhCMV*_ll啟動子。理論上，如果胚胎發(fā)育過程中短時間施加藥物(如四環(huán)素或其衍生物)阻斷破壞物基因的表達(dá)并提供對繁殖的可逆控制，則魚類可圈養(yǎng)繁殖。至今，已證明致力于產(chǎn)生不育系不能成功。難以形成這些品系可能是由于Tet響應(yīng)啟動子易泄露，導(dǎo)致胚胎破壞物基因的低水平表達(dá)以及隨后對建群系產(chǎn)生的選擇。所述系統(tǒng)還需要使用細(xì)菌基因和啟動子系統(tǒng)，這使商業(yè)化的管理審查過程變得復(fù)雜。該方法的其他缺點是需要使用四環(huán)素(或其衍生物)，這將增加生產(chǎn)成本并產(chǎn)生環(huán)境危害。本發(fā)明克服了以前方法的許多缺點。本發(fā)明提供了能夠使不同種類的脊椎動物和無脊椎動物有效絕育的轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺。另外，轉(zhuǎn)基因系可易于繁殖而無需使用有潛在毒性或有害的物質(zhì)。本技術(shù)可使有益物種的商業(yè)生產(chǎn)利潤更高且在環(huán)境方面更有利。例如，養(yǎng)殖的水生物種的絕育將1)防止基因流向野生種群以及養(yǎng)殖的非本地物種在新的生境建群(生物限制)；2)用改進(jìn)的遺傳學(xué)保護(hù)有價值的品系；3)通過減少性腺發(fā)育和性別分化消耗的能量或者通過允許產(chǎn)生全雄性種群而提高性能。如果物種的雄性比雌性生長更迅速，則全雄性種群是有利的?；?00%有效的絕育方法將使轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā) 具有降低的風(fēng)險，并且有顯著改善目前限制技術(shù)的前景因而，本發(fā)明提供明顯的優(yōu)勢，包括(i) 100%的有效性；(ii)相對其他方法更低的成本(無需勞動力或處理以使品系繁殖或絕育)所表達(dá)的基因產(chǎn)物不會負(fù)面影響宿主性能或不需要使用具有潛在的健康或環(huán)境風(fēng)險的有毒基因或試劑；(vi)該策略在不同生物中應(yīng)用廣泛；(Vii)利用同一構(gòu)建體的靶物種范圍廣；以及(Viii)轉(zhuǎn)基因系易于繁殖。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因譜系終結(jié)雌性的組合物和方法，所述譜系終結(jié)雌性將產(chǎn)生不育子代。還提供了使用轉(zhuǎn)基因雄性繁殖轉(zhuǎn)基因系的組合物和方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了母系不育構(gòu)建體(MSC)，即表達(dá)構(gòu)建體，其包含(i)MSC啟動子；(ii)能夠消除原始生殖細(xì)胞(PGC)的多核苷酸序列；以及(iii)至少一種生殖細(xì)胞特異性順式作用元件，其中將和(iii)可操作地連接。在一些實施方案中，MSC啟動子是母系啟動子,例如來自askopos(kop)或zona pellucida(zpc)基因的啟動子。在一些實施方案中，生殖細(xì)胞特異性順式作用元件包含生殖系基因的3’UTR序列，例如來自 dead-end (dnd)或 nanos(nos)基因的 3，UTR 序列。在一些實施方案中，能夠消除PGC的多核苷酸序列是促凋亡序列。在一些實施方案中，促凋亡序列直接起作用使PGC凋亡，并且編碼促凋亡蛋白，如Bax、Bak、Bok、Bad、Bik、Puma、Noxa或效應(yīng)半胱天冬酶(caspase)。在一些實施方案中，促凋亡序列間接起作用，例如通過減少抗凋亡基因例如bcl-2、bcl-xl、bcl-w的表達(dá)。在一些實施方案中，促凋亡序列通過減少PGC的正確遷移或特化所必需的基因例如CXCR4-0、胰島素樣受體lb、fox Cl或nanos的表達(dá)而間接起作用。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了攜帶上文所述的MSC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。在一些實施方案中，MSC轉(zhuǎn)基因動物是譜系終結(jié)雌性。在一些實施方案中，MSC轉(zhuǎn)基因動物選自魚類、軟體動物、甲殼類動物、兩棲動物、昆蟲和節(jié)肢動物。在一些實施方案中，MSC轉(zhuǎn)基因動物攜帶至少一種額外的轉(zhuǎn)基因。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生譜系終結(jié)雌性的方法，所述方法包括以下步驟(i)將MSC導(dǎo)入動物祖細(xì)胞(例如胚胎細(xì)胞)，以產(chǎn)生在其生殖細(xì)胞中攜帶MSC的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物；(ii)培育步驟(i)的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物，以產(chǎn)生半合子MSC轉(zhuǎn)基因雄性；(iii)使MSC轉(zhuǎn)基因雄性與無MSC的雌性交配；以及(iv)選擇步驟(iii)的MSC轉(zhuǎn)基因雌性子代，以得到譜系終結(jié)雌性。在一些實施方案中，所述方法還包括使步驟(iv)的譜系終結(jié)雌性與雄性雜交，以產(chǎn)生不育子代的步驟。在一些實施方案中，譜系終結(jié)雌性攜帶至少一種額外的轉(zhuǎn)基因。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生不育的一代動物的方法，其包括使譜系終結(jié)雌性與雄性雜交，以產(chǎn)生不育子代。在一些實施方案中，不育子代攜帶至少一種額外的轉(zhuǎn)基因。在一些實施方案中，盡管全部子代都是不育的，但譜系終結(jié)雌性只有一半的子代遺傳了 MSC轉(zhuǎn)基因(圖I)。因為非轉(zhuǎn)基因但不育動物的種群是有價值的，所以在一些實施方案中，所述方法還包括檢測MSC轉(zhuǎn)基因的存在并將MSC轉(zhuǎn)基因不育子代和非MSC轉(zhuǎn)基因的不育子代分離。在一些實施方案中，使用熒光標(biāo)志物或顏色標(biāo)志物來檢測MSC轉(zhuǎn)基因(例如通過將額外的編碼標(biāo)志物的序列添加到MSC轉(zhuǎn)基因中)。在一些實施方案中，通過MSC 轉(zhuǎn)基因不育子代的死亡來檢測MSC轉(zhuǎn)基因(例如通過在條件或發(fā)育階段特異性啟動子控制下，將致死編碼序列添加到MSC轉(zhuǎn)基因中)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了使MSC轉(zhuǎn)基因動物繁殖的方法，其包括(i)將MSC導(dǎo)入動物祖細(xì)胞中，以產(chǎn)生在其生殖細(xì)胞中攜帶MSC的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物；(ii)培育步驟⑴的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物，以產(chǎn)生半合子MSC轉(zhuǎn)基因雄性；(iii)使MSC轉(zhuǎn)基因雄性與無MSC的雌性交配；以及(iv)選擇步驟(iii)的MSC轉(zhuǎn)基因雄性子代，以培育并繁殖出另一代MSC轉(zhuǎn)基因動物。附圖
簡述圖I :描述產(chǎn)生不育動物并繁殖MSC轉(zhuǎn)基因系的實例流程2 :來自攜帶轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因雌性的活胚胎的PGC的早期標(biāo)記。(A)ask0p0s eGFP-dnd 3’UTR ;或(B) zpc :eGFP_dnd 3’UTR。由轉(zhuǎn)基因雌性與野生雄性雜交得到的胚胎。在橢圓形階段之前，GFP均勻分布于胚盤(A和B1-2)中?？蓞^(qū)分生殖細(xì)胞與體細(xì)胞的最早時間點是在早期原腸胚形成過程中(受精后4小時，A2和B2)。A3，B3:處于晚期體質(zhì)形成的胚胎，以及A4, B4 :受:精后30-48小時(hpf)的胚胎。圖3 :轉(zhuǎn)基因雌性的熒光顯微鏡圖像。(A) I個月大的雌性的側(cè)視圖(zpc eGFP-dnd3’UTR)顯示GFP性腺穿過體壁。⑶和(C) 3個月大的雌性的解剖卵巢(askopos eGFP-dnd3' UTR)，其中在卵母細(xì)胞I期和II期觀察到GFP表達(dá)最強。圖4 Bax介導(dǎo)的PGC消除。(A)描述用于表達(dá)合成的帶帽bax dndmRNA的Litmus28i bax :dnd 3’UTR構(gòu)建體。(B)瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)(A)的Bax :dnd mRNA。(C)促凋亡斑馬魚Bax以劑量依賴的方式誘導(dǎo)死亡。(D-G) 24-hpf胚胎(D和F)和48_hpf胚胎(E和G)的熒光圖像。(D和E)給出模仿注射的胚胎(對照組)。(F和G)給出用合成的bax dnd3’ UTRmRNA注射的胚胎(測試組)。(H-J)測試組胚胎中早期體節(jié)發(fā)生過程中PGC集簇的慢速拍攝畫面(Time-lapse frame)。注意GFP在細(xì)胞邊緣擴(kuò)散,表明為凋亡小體特有的胞膜起泡⑶和隨后的分離成小的細(xì)胞碎片(I，J)。⑷基于對照組和測試組的20個胚胎的分析的性別比。(L) 3個月大的對照注射胚胎的解剖性腺。(M)bax:dnd 3’UTR RNA注射的胚胎的解剖性腺。圖5 (A) MSCzpc和MSCkop構(gòu)建體的不意圖。通過qRT-PCR使用bax和dnd之間的連接處的PCR來鑒定轉(zhuǎn)基因的魚。(B)從不同的雄性建群者(粗體)建立的轉(zhuǎn)基因MSC譜系圖。豎線代表單獨對MSC轉(zhuǎn)基因為陽性(黑色)或者對MSC和GFP轉(zhuǎn)基因均為陽性(綠色復(fù)縱線)的Fl子代基因型。Fl子代的表型性別和數(shù)量如以下所示雄性(ml，m2，m3...)和雌性(f 1，f2，f3...)。顯示來自不同F(xiàn)l系的F2雄性子代的百分比和F2后代的總數(shù)(n)。選擇圖中圈出的Fl雌性子代來研究母系遺傳的轉(zhuǎn)基因?qū)GC的影響(表達(dá)GFP)。(Cl)Fl雌性MSCzpc3的胚胎中的PGC顯示經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞的特征胞膜起泡(GFP在細(xì)胞邊緣擴(kuò)散)和形成凋亡小體(由箭頭顯示)。(C2)吖啶橙處理的源自Fl雌性MSCzpcll (f I)的胚胎的熒光顯微鏡圖。(D)顯示PGC可變?nèi)毕莸腇l雌性(f2)MSCzpc3的24hpf和48hpf胚胎的突光圖。48hpf時，A組中的胚胎顯示正常的PGC計數(shù),而B組顯示PGC數(shù)量減少及C組沒有可見的PGC。(E)不同MSC系的子代中GFP標(biāo)記的PGC的平均數(shù)量。源自MSC雌性(左)的胚胎顯示PGC顯著減少(高達(dá)90% )，而源自MSC雄性(右) 的胚胎顯示正常的PGC數(shù)量。將大約20個胚胎用于計算所測試的每一轉(zhuǎn)基因系的PGC的平均數(shù)量。豎線代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖6 :雄魚性腺的外觀。(A)不育(MSCzpc22)的魚和(B)來自具有0-3個PGC的MSCzp3組的低受精率的魚僅在一側(cè)顯示正常性腺而非正常的一對。(C-N)用蘇木精和伊紅(H&E)染色的性腺組織學(xué)切片。(C)不育，(D)野生型，及(E)萎縮性腺的橫切片。組織由基底膜圍繞的細(xì)管組成。細(xì)管內(nèi)，在野生型魚中可看到高密度的精子(S)，部分可育魚中可看到低密度的精子(S)，而在不育個體的小葉腔中未檢測到精子。塞爾托利細(xì)胞(Sertolicell)存在于細(xì)管內(nèi)，而萊迪希細(xì)胞(Leydig cell)存在于胞間隙。(F-N)Fl MSCzpc9雄性(F)和同胞雌性(I，L)，F(xiàn)1 MSCzpc22雄性(G)和同胞雌性(J，M)以及Fl MSCkop2雄性⑶和同胞雌性(K，N)的年齡匹配的F2不育和可育子代的縱切圖。圖7 :評估不育表型(A)消除成體生殖細(xì)胞的性腺(解剖自MSCzpc22系的F2不育魚)顯示出以與野生型精巢相似的水平表達(dá)雄性特異性標(biāo)志物sox 9a。相反地，我們并未檢測到卵巢濾泡標(biāo)志物cypl9ala的表達(dá)。每一實驗進(jìn)行一式三份。(B和C)成體生殖系缺陷的性腺未顯示生殖細(xì)胞特異性標(biāo)志物vasa的表達(dá)。(B)解剖自4條野生型魚(2條雄性和2條雌性)和3條不育魚的性腺組織的sox9a和vasa基因的RT-PCR分析。泳道I顯示無逆轉(zhuǎn)錄酶(無RT)的陰性對照。(C)對解剖自6條不育雄性、5條生育力降低的雄性以及野生型雄性和雌性對照的性腺進(jìn)行Q-RT-PCR分析。我們使用管家基因P -肌動蛋白來校正樣品之間的RNA水平。來自不育魚的樣品未檢測到vasa表達(dá)。來自生育率降低的的魚的性腺的vasa表達(dá)的相對水平低于野生雄性和雌性的60-90%。(D)Fl MSCzpc9、MSCzpc22和MSCkop2雌性的子代的受精率。紅色柱(上部，有的話)指示受精卵的數(shù)量，藍(lán)色柱顯示未受精的卵。圖8 : (Al和A2)將GFP報告基因構(gòu)建體融合到斑馬魚dnd3’UTR和nanos 3’UTR。(Z1-4)用 60pg 合成的帶帽 RNA eGFP dnd (Z1 20hpf-Z2 24hpf)和 eGFP nosl 3，UTR(Z3 4hpf，Z4 48hpf)注射的斑馬魚胚胎的熒光圖像。(T1-4)受精時用200pg合成的帶帽RNAeGFP :dnd(Tl，T2)和 eGFP :nosl(T3，T4)注射的 30 天大的鱒魚胚胎。(S1，S2)用 200pg 帶帽RNA eGFP nosl注射的20天大的鮭魚胚胎**。箭頭指示顯示相對于消化道(DT)的背側(cè)位置的GFP-PGC顯示自發(fā)熒光。給出30天大的眼點期的鱒魚胚胎*和20天大的去卵黃的鮭魚胚胎**的側(cè)視圖。隨著胚胎的發(fā)育，體細(xì)胞顯示減弱的熒光，而PGC中觀測到持續(xù)且加強的GFP。(Cl)驅(qū)動融合到斑馬魚nosl 3’UTR的大西洋鮭(Salmosalar) bax的表達(dá)載體。(C2)24hpf和48hpf時，GFP同窩雌性對照的斑馬魚胚胎(模仿注射)或用 IOpg合成的帶帽RNA ssbax nosl注射的斑馬魚胚胎的熒光圖像。(C3) 24和48hpf (n = 8)時，對照(藍(lán)色柱，右)和ssbax :nosl(紅色柱，左)注射的斑馬魚胚胎中PGC的平均數(shù)量。豎線代表標(biāo)準(zhǔn)差。發(fā)明詳述I 引言本發(fā)明提供了以經(jīng)濟(jì)有效的方式產(chǎn)生不育動物的組合物和方法。所述技術(shù)利用空間特異和時間特異地遞送能夠消除發(fā)育胚胎中的原始生殖細(xì)胞(PGC)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。沒有生殖細(xì)胞，胚胎長成不育動物。誘導(dǎo)不育的轉(zhuǎn)基因是需要三種元件的母系不育構(gòu)建體(MSC):驅(qū)動能消除PGC的多核苷酸序列的MSC啟動子，融合到生殖細(xì)胞特異的順式調(diào)控元件(如3’UTR)。無論父本是否攜帶MSC轉(zhuǎn)基因，存在MSC轉(zhuǎn)基因的雌性都將使其子代不育。 MSC轉(zhuǎn)基因雄性可與野生型雌性雜交以繁殖品系，并且這些子代并不是不育的。圖I說明MSC轉(zhuǎn)基因如何保持或用于產(chǎn)生不育動物。步驟I中，將轉(zhuǎn)基因?qū)胱婕?xì)胞(如胚胎干細(xì)胞)以產(chǎn)生MSC轉(zhuǎn)基因建群動物。使生殖系能遺傳MSC轉(zhuǎn)基因的建群動物與MSC陰性動物雜交，以產(chǎn)生MSC轉(zhuǎn)基因動物的Fl代(步驟2)。后代中轉(zhuǎn)基因的存在可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如PCR或?qū)⒕幋a容易顯現(xiàn)性狀的基因添加到MSC中)來檢測。將半合子MSC轉(zhuǎn)基因雄性用于繁殖品系(步驟3)。這是因為能消除PGC的序列在雄性生殖細(xì)胞中不表達(dá)。MSC轉(zhuǎn)基因雄性的子代的生殖細(xì)胞發(fā)育正常且是可育的。攜帶MSC轉(zhuǎn)基因的雌性是譜系終結(jié)雌性。如本文所解釋和說明的，消除PGC的序列從卵母細(xì)胞特異的啟動子在母本生殖細(xì)胞中表達(dá)。消除PGC的產(chǎn)物被傳遞給其子代，導(dǎo)致后代沒有生殖細(xì)胞。譜系終結(jié)雌性將產(chǎn)生不育后代，這與父本MSC狀態(tài)無關(guān)。譜系終結(jié)雌性的后代將是不育的，而不管它們是MSC陰性、半合子還是純合子。更具體地，所公開的系統(tǒng)允許空間和時間控制促死亡多核苷酸序列先在卵母細(xì)胞后在PGC(源自同一卵的發(fā)育胚胎)中表達(dá)。卵母細(xì)胞凋亡由多種促凋亡和抗凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控(參見，如 Moritaet al. (2000) Nat. Med. 6 :1109-14 ;Sasaki 和 Chiba (2004)Mol.Biol. Cell 15 :1387-96 ；Andersen et al. (2009)EMBO 28:3216-27)。卵母細(xì)胞抗凋亡的能力比許多細(xì)胞類型更強，并且bax單獨異常過表達(dá)不足以促進(jìn)卵母細(xì)胞凋亡。因而，轉(zhuǎn)基因可在兩種細(xì)胞類型中表達(dá)，但是僅僅導(dǎo)致消除PGC。利用存在于生殖質(zhì)RNA3’ UTR中的順式作用RNA元件，促凋亡活性可進(jìn)一步限于PGC。這些元件使RNA翻譯靶向PGC。首先，它們允許mRNA定位于被稱為生殖質(zhì)的特化胞質(zhì)區(qū)。該區(qū)被將來的PGC遺傳且是PGC特化所必需的(Yoon(1997)Development 124 3157-65 ；Koprunneret al. (2001)Genes&Dev. 15 :2877-85 ；ffeidingeret al. (2003)Cur.Biol. 13 ； 1429-34)。其次，它們抑制不能正確定位和遷移到體細(xì)胞的mRNA的多產(chǎn)性翻譯。第三，它們允許體細(xì)胞中的mRNA快速降解，同時使PGC中的那些相同mRNA穩(wěn)定(Wolke etal. (2002) Cur. Biol. 12 :289-94)。負(fù)責(zé)母系生殖細(xì)胞mRNA在PGC內(nèi)翻譯的機(jī)制的進(jìn)化保守性質(zhì)使得利用生殖細(xì)胞3’UTR遞送特定異源mRNA至PGC中特別有吸引力，并允許該方法應(yīng)用于廣泛范圍的宿主靶物種。
本發(fā)明提供了用于種群限制的有效方法。對于養(yǎng)殖物種而言，MSC轉(zhuǎn)基因雌性可產(chǎn)生多代不育子代，而MSC轉(zhuǎn)基因雄性可用于繁殖可育MSC轉(zhuǎn)基因種群。對于入侵和有害物種，在種群中一次釋放可育MSC轉(zhuǎn)基因雄性可導(dǎo)致幾代內(nèi)顯著減少或滅絕，這取決于所釋放個體的數(shù)量和內(nèi)生性種群的大小。在這種情況下，MSC轉(zhuǎn)基因雄性攜帶“Trojan基因”，其允許連續(xù)產(chǎn)生MSC轉(zhuǎn)基因雌性，并因而連續(xù)產(chǎn)生不育雄性。不育雄性與非轉(zhuǎn)基因雄性競爭雌性，并且下一代的規(guī)模將減少。利用不育雄性的大規(guī)模釋放可獲得相似的結(jié)果，例如MSC轉(zhuǎn)基因雌性的不育后代。大規(guī)模釋放不育雄性已成功用于減少利用照射作為絕育方法(不育昆蟲技術(shù)或SIT)的幾種昆蟲物種(如螺旋蠅(Screw-worm fly)、地中海實蠅(Medfly))的種群。II.定義如本文所使用，“表達(dá)構(gòu)建體”泛指重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列 允許特定核酸在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的的指定核酸元件。表達(dá)載體可為質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表達(dá)載體包括可操作地連接到啟動子的待轉(zhuǎn)錄的核酸?！澳赶挡挥龢?gòu)建體”(Maternal Sterility Construct, MSC)是指使在其生殖細(xì)胞中攜帶MSC的可育雌性動物的子代不育的表達(dá)構(gòu)建體。MSC包含三種元件驅(qū)動能消除PGC的多核苷酸序列(如促凋亡序列)表達(dá)的卵母細(xì)胞特異性啟動子，以及至少一種生殖細(xì)胞特異性順式作用元件，如存在于生殖細(xì)胞特異基因的3’ UTR中的那些元件。生殖細(xì)胞特異基因的3’UTR中的順式作用元件將mRNA引導(dǎo)至卵母細(xì)胞/合子的生殖質(zhì)，然后至PGC。雌性生殖細(xì)胞中MSC的存在使其子代的原始生殖細(xì)胞(PGC)凋亡，得到不育的一代?！皢幼印睆V泛定義為指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。啟動子可包括在轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列，例如對聚合酶II型啟動子來說，TATA元件。啟動子可為組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性的?！癕SC啟動子”驅(qū)動卵子發(fā)生過程中可操作連接的多核苷酸序列的表達(dá)。有兩種類型的MSC啟動子i)母系基因的啟動子和ii)用于卵子發(fā)生的啟動子。母系基因(如vasa和askopos)由母本在卵子發(fā)生過程中表達(dá)，并且基因產(chǎn)物(mRNA和蛋白)沉積或保留于成熟的卵中。母系基因產(chǎn)物參與早期發(fā)育的細(xì)胞命運決定和基本細(xì)胞功能。用于卵子發(fā)生的啟動子(例如zona pellucida啟動子)在卵子發(fā)生過程中表達(dá)，但相關(guān)基因產(chǎn)物并不是早期胚胎功能所必需的。如本文所使用，MSC啟動子還可包括來自昆蟲滋養(yǎng)細(xì)胞的那些啟動子。在一些昆蟲物種中，卵母細(xì)胞與滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，這通過胞質(zhì)橋為卵母細(xì)胞提供大量RNA和蛋白?！澳軌蛳忌臣?xì)胞(PGC)的多核苷酸序列”是指一旦從MSC表達(dá)就能夠?qū)е翽GC死亡的多核苷酸序列。這樣的多核苷酸可直接起作用，例如通過編碼促凋亡基因如bax。多核苷酸還能間接起作用。在一些實施方案中，多核苷酸序列包括能特異地減少抗凋亡基因如bcl-2表達(dá)的反義或抑制性多核苷酸(如siRNA或dsRNA)。還可通過阻斷正確遷移或發(fā)育來導(dǎo)致凋亡而間接地消除PGC。因而，能夠消除PGC的多核苷酸序列包括，例如減少趨化因子受體表達(dá)的多核苷酸和編碼顯性負(fù)性趨化因子受體(dominant negativechemokine receptor)的那些多核苷酸?！按俚蛲龆嗪塑账嵝蛄小笔侵冈诩?xì)胞中表達(dá)時能使細(xì)胞凋亡的多核苷酸序列。促凋亡多核苷酸序列可包含促凋亡因子(如Bax)的編碼序列或抗凋亡因子(如Bcl-2)的抑制性多核苷酸序列?！吧臣?xì)胞特異的順式元件”或“生殖細(xì)胞特異的3’UTR”是指在身體上將轉(zhuǎn)錄本引導(dǎo)至傳遞給PGC的一部分細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄序列的非翻譯區(qū)段。例如，包含生殖細(xì)胞特異性3’UTR且產(chǎn)生于卵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本將被引導(dǎo)至由將來的PGC遺傳的一部分細(xì)胞質(zhì)(生殖質(zhì))。形成合成的3’ UTR或使用不同3’ UTR來源的生殖細(xì)胞特異的順式元件的新組合以實現(xiàn)相同的效果是可能的。術(shù)語“可操作地連接”是指核酸表達(dá)控制序列(如啟動子或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點陣列)與第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。短語“編碼......的核酸序列”是指含有特定蛋白或肽的一級氨基酸序列的序列 信息的核酸，特異性抑制特定基因表達(dá)的抑制性多核苷酸序列或反式作用調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點。該短語特別包括天然序列或可被導(dǎo)入以符合特定宿主細(xì)胞的密碼子偏好性的序列的簡并密碼子(即編碼一個氨基酸的不同密碼子)。抑制性多核苷酸序列是抑制特定靶基因表達(dá)的序列。抑制性多核苷酸包括反義構(gòu)建體或表達(dá)反向序列(如siRNA、shRNA)和適配體的構(gòu)建體,如下文詳述。術(shù)語“重組”結(jié)合例如細(xì)胞或核酸、蛋白或載體使用時，表示該細(xì)胞、核酸、蛋白或載體已通過導(dǎo)入異源核酸或蛋白或改變天然核酸或蛋白來修飾，或者表示該細(xì)胞源自如此修飾的細(xì)胞。因而，例如，重組表達(dá)載體可包括在非重組細(xì)胞附近不存在的序列元件。“譜系終結(jié)雌性(lineage ending female) ”是在其生殖細(xì)胞中攜帶MSC轉(zhuǎn)基因的動物。譜系終結(jié)雌性的子代是不育的。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指在其基因組中攜帶異源多核苷酸序列(轉(zhuǎn)基因)的動物，所述異源多核苷酸序列(轉(zhuǎn)基因)通過本領(lǐng)域所熟知的重組技術(shù)有目的的導(dǎo)入。轉(zhuǎn)基因通常包括允許插入到宿主生物的基因組中的序列元件、啟動子和/或其他表達(dá)元件、編碼蛋白的基因或cDNA序列、或抑制另一基因表達(dá)的序列(如反義序列)?！敖ㄈ簞游?founder animal) ”是指由轉(zhuǎn)基因重組導(dǎo)入胚胎或其他祖細(xì)胞所得到的第一代動物。大多情況下，這樣的動物是嵌合體，使得只有一些細(xì)胞源自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。然而，從單個細(xì)胞或全部包括轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞群產(chǎn)生動物是可能的。如果建群動物是“生殖系轉(zhuǎn)化的”或在其生殖細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因，那么其可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的后代。使用術(shù)語“半合子的(hemizygous) ”和“純合子的(homozygous) ”來指二倍體生物，并且可指轉(zhuǎn)基因動物。如本文所使用，半合子轉(zhuǎn)基因動物攜帶一個拷貝的插入轉(zhuǎn)基因的染色體，但是配對的染色體并不具有轉(zhuǎn)基因。在一些情況下，涉及攜帶一個拷貝的轉(zhuǎn)基因染色體的動物時，術(shù)語雜合子與半合子可替換使用。在轉(zhuǎn)基因為純合子的動物中，兩個拷貝的染色體都包括轉(zhuǎn)基因，所以動物攜帶兩個拷貝的轉(zhuǎn)基因染色體。如本文所使用，術(shù)語“野生型”通常是指未攜帶MSC轉(zhuǎn)基因的動物。術(shù)語“不育的(sterile) ”是指與相同年齡、物種等的正常個體相比，產(chǎn)生后代的能力顯著降低的個體或個體群。術(shù)語“抑制”或“活化”或“調(diào)節(jié)”涉及表達(dá)或活性時，并非意圖作為絕對術(shù)語。例如，如果因子“不抑制”或“不活化”給定活性，其通常意指例如與對照或一系列對照相比，所述因子沒有顯著的作用。本文所使用的術(shù)語“減少”、“誘導(dǎo)”和“增加”及類似的相對術(shù)語是指相對于對照值減少、增加等。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定每種情況的合適對照。例如，如果因子被認(rèn)為抑制基因X的表達(dá)，那么與缺乏該因子時的水平相比，該因子存在時X表達(dá)的水平降低。如果因子被認(rèn)為在特定種群中誘導(dǎo)不育，則與缺乏該因子時的水平相比，該因子存在時不育水平將提高?！皩φ铡睒悠坊蛑凳侵赣米髋c測試樣品進(jìn)行比較的參照，通常為已知參照的樣品或 條件設(shè)置。例如，本發(fā)明中適當(dāng)?shù)膶φ諛悠房梢允牵鐏碓从谝吧蛣游锏男韵倩蛐韵偌?xì)胞。接著這樣的對照可與獲自攜帶MSC轉(zhuǎn)基因或其成分的動物或者懷疑攜帶MSC轉(zhuǎn)基因或其成分的動物的樣品相比。對照還可以代表由相似個體的種群(例如具有相似特征、年齡、體重等的野生型動物)獲得的平均值。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，可設(shè)計對照用于評估任何數(shù)量的參數(shù)。還可設(shè)計對照用于體外應(yīng)用，例如在培養(yǎng)的細(xì)胞中測試各種構(gòu)建體的活性。III.重組技術(shù)本發(fā)明涉及重組遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，例如用于制備MSC的技術(shù)。公開本發(fā)明中使用的一般方法的基礎(chǔ)教程包括 Sambrook&RusselI,Molecular Cloning,A LaboratoryManual (分子克隆實驗指南，第 3 版，2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual (基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗指南，1990);以及 Current Protocols inMolecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)，Ausubel等編，1994-1999)?？蓪⒄婧思?xì)胞和原核細(xì)胞用于常規(guī)克隆和表達(dá)。這些細(xì)胞包括動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌、真菌和酵母，其中許多可商購獲得。用于在細(xì)胞中導(dǎo)入或表達(dá)分離或異源核酸的方法是所熟知的，并且可在例如在上述的綜合參考文獻(xiàn)中找到。因此，本發(fā)明還提供了包含本文所述核酸序列的宿主細(xì)胞和表達(dá)載體?？衫脴?biāo)準(zhǔn)重組或合成技術(shù)制備包含MSC和MSC成分的核酸(在下文進(jìn)行更詳細(xì)地描述)。核酸可為RNA、DNA或其雜交體。技術(shù)人員可構(gòu)建含有功能等同的核酸的不同克隆，如編碼相同多肽的核酸。最后完成這些點的克隆方法和驗證核酸序列的測序方法是本領(lǐng)域所熟知的。在一些實施方案中，在體外合成核酸?？筛鶕?jù)Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Letts. 22(20) :1859-1862(1981)描述的固相亞磷酰胺三酯法，利用例如如Needham-VanDevanter et al. ,Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168 (1984)所述的自動合成儀，化學(xué)合成脫氧核苷酸。在其他實施方案中，所期望的核酸序列可通過擴(kuò)增反應(yīng)如PCR獲得。技術(shù)人員將認(rèn)識到產(chǎn)生給定多核苷酸或多肽序列替換物或變體的許多其他方法。本發(fā)明期望的核酸或多肽基于本文所涉及的序列和本領(lǐng)域易于得到的關(guān)于促凋亡因子和抗凋亡因子、組織特異性啟動子和順式作用元件的知識。為獲得期望序列(例如導(dǎo)致消除PGC的序列)的高水平表達(dá)，構(gòu)建包括這樣的元件如指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動子、轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子、翻譯起始的核糖體結(jié)合位點等的表達(dá)載體。合適的細(xì)菌啟動子是本領(lǐng)域所熟知的，并且描述于例如在上文引用的提供表達(dá)克隆方法和方案的參考文獻(xiàn)中。用于表達(dá)核糖核酸酶的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可在如大腸桿菌、芽孢桿菌 (Bacillus sp.)和沙門氏菌屬(Salmonella)中獲得(還可參見 Palvaet al. , Gene22 229-235(1983) ；Mosbach et al. ,Nature 302:543-545(1983)。用于這種表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可商購獲得。用于哺乳動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域所熟知的且同樣可商購獲得。除了啟動子，表達(dá)載體一般包含含有核酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需要的全部其他元件的轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒。因而典型的表達(dá)盒包含可操作地連接到編碼蛋白的核酸序列或抑制性多核苷酸的啟動子，以及轉(zhuǎn)錄本有效多腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止所必需的信號。如以上所述，表達(dá)盒還應(yīng)當(dāng)包含結(jié)構(gòu)基因下游的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，以提供有效終止。終止區(qū)可獲自與啟動子序列相同的基因或可獲自不同基因。用于將遺傳信息運送至細(xì)胞中的特定表達(dá)載體并非特別關(guān)鍵?？墒褂糜糜谡婧嘶蛟思?xì)胞中表達(dá)的任何常規(guī)載體。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括質(zhì)粒如基于PBR322的質(zhì)粒 、pSKF、pET15b、pET23D、pET-22b (+)和融合表達(dá)系統(tǒng)如GST和LacZ。表位標(biāo)簽也可添加到重組蛋白中以提供簡便的分離方法，例如6-組氨酸。除了含有編碼序列的表達(dá)盒外，這些載體還包含17啟動子、轉(zhuǎn)錄起始子和終止子、pBR322ori位點、bla編碼序列和Iacl操縱子。包含MSC核酸序列的載體可在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括大腸桿菌，其他細(xì)菌宿主、酵母和多種高等真核細(xì)胞如COS、CHO和HeLa細(xì)胞系以及骨髓瘤細(xì)胞系。除了細(xì)胞外，載體還可通過轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)?？梢酝ㄟ^所熟知的方法將本發(fā)明的表達(dá)載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到所選擇的宿主細(xì)胞中，如用于大腸桿菌的氯化鈣轉(zhuǎn)化以及用于哺乳動物細(xì)胞的磷酸鈣處理、脂質(zhì)體融合或電穿孔。由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可通過由質(zhì)粒中所含有的基因(如amp、gpt、neo和hyg基因)賦予的抗生素抗性來選擇?；虻谋磉_(dá)水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)檢測mRNA、蛋白或活性來確定。例如可利用Northern印跡、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)或定量RTPCR(有時被稱為實時PCR)來檢測 mRNA 水平。這樣的技術(shù)在例如 VanGuilder et al. (2008)Biotechniques 44 :619 以及Real-Time PCR Current Technology and Applications (實時 PCR :現(xiàn)代技術(shù)和應(yīng)用)，Caister Academic Press (2009)中有綜述。蛋白水平可利用基于抗體的分析來檢測，例如Western免疫印跡或ELISA。在一些實施方案中，蛋白表達(dá)可通過檢測可操作地連接的蛋白標(biāo)記物例如GFP、6-組氨酸或生物素來檢測。IV.抑制性核酸抑制性核酸包括基于反義技術(shù)和Watson-Crick配對以及適配體的那些核酸。適配體是通過非Watson-Crick相互作用結(jié)合到祀定分子的短序列(長度通常為20-200堿基)，并且可包括修飾的核酸。靶標(biāo)特異的適配體的設(shè)計和選擇是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如如美國專利號 5270163,5567588 和 5475096 以及 Klug 和 Famulok(1994)Mol. Biol. Reports20 :97-107中所描述的。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，還可將適配體設(shè)計成選擇性地結(jié)合并抑制抗凋亡多肽，與抗體類似。“反義核酸”是通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA相互作用的方式結(jié)合到靶RNA且改變靶RNA活性的非酶核酸分子(相關(guān)綜述參見Stein and Cheng (1993) Science 261 1004以及Woolfet al.，美國專利號5，849，902)。一般，反義分子沿著反義分子的一條連續(xù)序列與祀序列互補。關(guān)于反義策略的綜述參見Schmajuk et al. (1999) J. Biol. Chem. , 274,21783-21789, Delihas et al. (1997)Nature, 15,751-753, Stein et al. (1997)AntiseneN. A. Drug Dev.，7，151，Crooke(2000)Methods Enzymol，313，3-45 ；Crooke (1998)Biotech.Genet. Eng. Rev.，15，121-157，Crooke (1997) Ad. Pharmacol，40，1-49。此外，可將反義 DNA通過DNA-RNA相互作用的方式用于靶向RNA，由此活化RNase H，RNase H消化雙螺旋中的靶RNA。反義寡核苷酸可包含一個或多個RNAse H活化區(qū)，其能夠活化靶RNA的RNAse H剪切。反義DNA可通過化學(xué)合成或利用單鏈DNA表達(dá)載體或其等同物來表達(dá)。小干擾RNA(SiRNA)可用于抑制抗凋亡基因的表達(dá)。siRNA靶向HIV_1 rev轉(zhuǎn)錄本已在人類細(xì)胞中獲得成功(Nature Biotechnol. 20 :500-505 ；Miyagishi M 和 TairaK. (2002))。具有四個尿嘧啶核苷3’懸突的U6啟動子驅(qū)動的siRNA在哺乳動物細(xì)胞中有效抑制所革巴向的基因表達(dá)(Nature Biotechnol. 20 :497-500 ；Paddisonet al. Genes&Dev. 16 948-958 ；Paulet al. (2002)Nature Biotechnol. 20:505-508;Suiet al. (2002)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 99 (6) :5515-5520 ；Yu (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9)6047-6052。
“雙鏈RNA”或“dsRNA”意指與預(yù)先確定的基因序列匹配的雙鏈RNA，所述預(yù)先確定的基因序列能夠活化降解基因的相應(yīng)信使RNA轉(zhuǎn)錄本的細(xì)胞酶。這些dsRNA被稱為短干擾RNA(SiRNA)，并且可用于抑制基因表達(dá)。本文所使用的術(shù)語“雙鏈RNA”或“dsRNA”是指能夠RNA干擾“RNAi”的雙鏈RNA分子，包括短干擾RNA “siRNA”(參見例如WO 00/44895 ；W001/36646 ；W0 01/29058 ；W0 00/44914)。本發(fā)明的抑制性核酸分子長度可為約10至100個核苷酸。例如，本發(fā)明的RNAi核酸分子長度可為約15至50個核苷酸，更優(yōu)選長度約為25至40個核苷酸(例如，參見Jarviset al. (1996) J. Biol. Chem.，271，29107-29112)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，所需要的是核酸分子足夠長且具有適合于核酸分子與其靶標(biāo)相互作用的構(gòu)象。V.轉(zhuǎn)基因技術(shù)已知用于許多物種的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法。一般的參考文獻(xiàn)包括TransRenesis Techniaues Principles and Protocols (轉(zhuǎn)基因技術(shù)手冊)，Clarke 編，2002 Germ Cell Protocols Sperm and Oocyte Analysis (生殖細(xì)胞實驗手冊精子和卵母細(xì)胞分析)，Schatten 編，2004 ；以及 Fish Development and Genetics The Zebrafishand Medaka Models (魚類發(fā)育遺傳學(xué):斑馬魚和青鏘模型)，Gong&Korzh編，2004。簡而言之，將包含轉(zhuǎn)基因的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入能夠產(chǎn)生動物的細(xì)胞，如精子細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或其他祖細(xì)胞中。這可利用例如顯微注射或電穿孔技術(shù)完成。然后培養(yǎng)攜帶轉(zhuǎn)基因的祖細(xì)胞(或細(xì)胞)以產(chǎn)生攜帶轉(zhuǎn)基因的動物。在大多情況下，建群動物僅在一些細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因，使動物成為遺傳嵌合體。然而，有些方法中，動物可直接由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以攜帶轉(zhuǎn)基因的單個祖細(xì)胞產(chǎn)生。在后面的情況下，動物不是嵌合體。建群動物通常被稱為代。使建群動物雜交，并且如果建群者的生殖系轉(zhuǎn)化將產(chǎn)生Fl代，這些子代中的一些攜帶轉(zhuǎn)基因。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因魚類的方法在例如Mori&Devlin(1999)Mol. Cell. Endocrin. 149 :129以及Collas和Alestrom(1997)Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6 :48-58 中公開。昆蟲的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化描述于如 Kaiser 和 Goodwin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1686-90 中。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因軟體動物的方法在例如 Bouloet al. (1996)Mol. Mar. Bio. Biotechnol. 5 :167-74 中公開。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因節(jié)肢動物的方法可以在如Presnail和Hoy (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :7732-36中找到。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因兩棲動物(爪蟾(Xenopus))的方法在Beck et al. (2001)Genome Biol. 2 :1029 中公開?？赏ㄟ^直接檢測轉(zhuǎn)基因來示蹤MSC轉(zhuǎn)基因的存在，例如使用轉(zhuǎn)基因序列特異的標(biāo)準(zhǔn)PCR或雜交技術(shù)。如本文所描述的例子,可以使用bax和dead-end 3’UTR之間的連接處特異的引物。在野生魚類基因組中并不存在該連接。還可將轉(zhuǎn)基因設(shè)計為包括編碼易于檢測的標(biāo)記或性狀的顯性基因標(biāo)志物。例如，可以使用影響顏色、膚色或體型的基因，或者允許條件選擇的基因。一種方法是致使攜帶與MSC相連接的顯性基因的個體去除(死亡)的選擇過程。例如，應(yīng)用刺激或脅迫致使攜帶顯性基因的個體死亡或去除維持轉(zhuǎn)基因所必需的刺激/條件。選擇轉(zhuǎn)基因的另一種方法可利用熒光篩選技術(shù)來進(jìn)行，通過顯性基因表達(dá)熒光蛋白來鑒定攜帶轉(zhuǎn)基因的個體。VI. MSC 啟動子在本發(fā)明中可使用的MSC啟動子是在卵子發(fā)生過程中有活性的那些啟動子。對于 MSC啟動子的選擇可以決定MSC在產(chǎn)生譜系終結(jié)雌性和不育子代中的便利性和有效性。在卵子發(fā)生過程中產(chǎn)生且存在于受精卵中的驅(qū)動母系提供的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的啟動子(母系基因啟動子)可用于靶向早期胚胎中的PGC。在本發(fā)明中可使用的其他啟動子(用于卵子發(fā)生的啟動子)是在卵子發(fā)生過程中在卵母細(xì)胞中有特異活性的那些啟動子，并且其產(chǎn)物對于胚胎發(fā)育來說不是必需的。有用的MSC啟動子i)具有局限于雌性的啟動子活性，以及ii)在卵子發(fā)生過程中有活性，以及iii)優(yōu)選在動物的其他空間和時間沒有活性。母系基因的產(chǎn)物(mRNA和蛋白)貯存于成熟的卵中，在那里它們參與早期發(fā)育中的細(xì)胞命運決定和基本細(xì)胞功能。這些基因產(chǎn)物在合子基因組活化之前在中囊胚轉(zhuǎn)換時通常有活性(Kane andKimmel (1993)Dev. I 19 :447-56)。卵子發(fā)生過程中精確表達(dá)母系基因，并且該母系表達(dá)是必需的且足以在早期胚胎中實現(xiàn)基因的全部功能。因此母系基因精確地作用與胚胎的基因型和父本的基因型無關(guān)。在斑馬魚中，該類基因包括諸如futile cycle,janus、nebel 和 ichabod 的基因。連接到合適的3’ UTR的MSC啟動子在時間和空間上局限于卵母細(xì)胞是有利的，因為1)對卵母細(xì)胞的母系轉(zhuǎn)錄本貢獻(xiàn)靶向胚胎發(fā)育早期的PGC，這時PGC群較小且可被完全消除時；以及2)僅雌性轉(zhuǎn)基因表達(dá)允許通過轉(zhuǎn)基因雄性繁殖不育系。攜帶MSC的轉(zhuǎn)基因雄性將不表達(dá)轉(zhuǎn)基因且保持可育。因此該方法消除了對逆轉(zhuǎn)不育的一些機(jī)制的需要。由于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)發(fā)生于減數(shù)分裂發(fā)生之前的卵母細(xì)胞中，所以轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物將存在于由雜合的轉(zhuǎn)基因雌性產(chǎn)生的全部卵中。雖然只有一半的MSC雌性子代遺傳了轉(zhuǎn)基因，但是全部子代都將是不育的。以下的例子描述利用母系特異基因askopos (4. 623kb :kop)和卵子發(fā)生特異基因 zona pellucida(634bp zpc3b)的上游調(diào)控區(qū)用于 MSC 中(Baleret al. (2005) J. CellSci. 118 :4027-38 ；0nichtchouk et al. (2003)Dev. Dynamics 228:393-404)。可使用幾種其他備選基因啟動子來實現(xiàn)母系表達(dá)，包括其他生殖質(zhì)特異基因的啟動子。還可以使用卵子發(fā)生特異性啟動子如zorg和00RP-T(Dai et al. (2009)Theriogenology 71 :441-49 ；Ramachandra et al. (2007)Mol. Reprod. Dev. 74)。在果蜆中，母系基因啟動子的例子包括來自bicoid、hunchback、nanos和caudal基因的那些啟動子。這些基因參與生殖棒(axis)和生殖系的建立。在斑馬魚中，控制發(fā)育的母系特異基因已通過功能性遺傳學(xué)篩選或通過原位雜交，之后通過基因功能的敲低分析來鑒定(如askopos)。母系基因啟動子的廣泛類別可獲自無脊椎動物和脊椎動物中已深入研究的基因。這些是其mRNA存在于生殖質(zhì)中的生殖系特異基因，并且包括nanos、dead-end (dnd)、DazL、GasZ、granulito、tudor、bruno-like、vasa、oskar、tudor (TDR7) > ziwi> zorg、germ-cell-less (gel) (Strasseret al. (2008) BMC Dev. Biol. 8 58 ；Suzukiet al. (2000)Mech. Dev. 93 :205-09)。在網(wǎng)比亞痕蚊(Anophelesgambiae)中，已表征了 vasa 啟動子(Papathanosetal. (2009) BMC Mol. Biol. 10 :65)，并且甲殼類動物vasa蛋白的研究支持母系貢獻(xiàn)。在爪蟾中，母系基因包括編碼Vg-I和VegT、Xcat2、Xpat以及Xdazl的那些基因。在本發(fā)明中可使用的卵子發(fā)生的其他啟動子是在卵子發(fā)生過程中在卵母細(xì)胞中有特異活性且其產(chǎn)物不是胚胎發(fā)育必需的那些啟動子。該類中的許多基因受單個啟動子控制，且編碼對卵子發(fā)生、卵巢濾泡發(fā)生及受精至關(guān)重要的蛋白，例如，如透明帶(zonapellucida)蛋白、00RP-T、生殖系因子a (FIGLa)、生長因子9 (⑶F9)以及骨形成蛋白15(BMP_15)?？墒褂脕碜詚onapellucida(zpc)基因家族的啟動子。已產(chǎn)生含有連接到綠色熒光蛋白(GFP)的穩(wěn)定整合的斑馬魚zpc3啟動子拷貝的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，并且在類似于內(nèi)源zpc基因的模式中得到GFP表達(dá)。第一代轉(zhuǎn)基因系使用單拷貝zpc3同源物的ATG密碼子上游的 412bp 的序列(Onichtchouk D. et al. , 2003 ；Del Giacco Let al. , 2000)) (LiuXet al. ,2006)。串聯(lián)排列的斑馬魚zpc2和zpc3基因的保守CCAAT序列元件是發(fā)育卵母細(xì)胞中這種表達(dá)所必需的(Mold et al.，2009)。另一類基因包括從體細(xì)胞啟動子轉(zhuǎn)變成卵子發(fā)生啟動子的那些啟動子，如爪蟾TFIIIA基因，其在卵母細(xì)胞和體細(xì)胞組織中從各自的啟動子轉(zhuǎn)錄(Kimet al. (1990)Genes Dev. 4:1602)。本文提到的序列已在許多物種中得到表征，并且序列可為公眾獲得，例如在Genbank上。技術(shù)人員無需過多實驗就可確定在每種情況中使用哪種序列(如物種同系物，輕微變體)有利?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來確定備選啟動子在特定時期指導(dǎo)基因表達(dá)的能力，例如，如以上文獻(xiàn)中所公開的方法。理想地，用已知的細(xì)胞標(biāo)志物同時檢測細(xì)胞的同一性(例如譜系和發(fā)育階段)。例如，可用實施例中所描述的GFP-表達(dá)構(gòu)建體(zpc啟動子-egfp-dnd3’UTR)來標(biāo)記PGC。可利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來檢測備選啟動子下游的轉(zhuǎn)錄本或蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，例如RTPCR、qRTPCR、Northern或Western印跡?？蛇x擇地,可以使用可檢測的標(biāo)記探針或抗體通過顯微鏡檢測轉(zhuǎn)錄本或蛋白產(chǎn)物。例如，可將備選啟動子連接到編碼GFP或類似熒光蛋白的序列，并且插入到諸如卵母細(xì)胞的細(xì)胞群。然后，可示蹤從啟動子的表達(dá)，并且例如與從已知啟動子的表達(dá)進(jìn)行比較。VII.能夠消除原始生殖細(xì)胞的多核苷酸序列本發(fā)明包括表達(dá)于PGC中的PGC-消除元件。然而，表達(dá)還可發(fā)生于卵母細(xì)胞和早期胚胎中(如圖2，Al-2和B1-2及圖3中的報告基因構(gòu)建體所示)。為了僅特異地消除PGC，效應(yīng)基因應(yīng)當(dāng)對卵母細(xì)胞和早期胚胎中的體細(xì)胞沒有作用或具有有限的作用?？紤]到這一點，凋亡基因調(diào)控子(regulator)是我們的系統(tǒng)中特別關(guān)注的，因為原腸胚形成之前卵母細(xì)胞和胚胎對凋亡天然有抗性。、
本文所涉及的多核苷酸和多肽已在許多物種中得到表征，并且序列可為公眾獲得，例如在Genbank上。技術(shù)人員無需過多實驗即可確定在每種情況中使用哪種序列(如物種同系物，輕微變體)有利。例如，描述Bcl-2家族成員的公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫可在bcl2db.ibcp. fr/site/ 找到。本文所述的研究依賴于bax，作為在PGC中促進(jìn)凋亡的基因。替代的促凋亡基因包括bax家族的其他成員，如bak和bok,以及包括卩隹BH3域蛋白(BH3_only protein)類別的基因如在初步實驗中，我們發(fā)現(xiàn)zbik-dnd 3’UTR mRNA在注射后24小時能誘導(dǎo)胚胎中GFP-標(biāo)記的PGC消失，這與用bax-dnd 3’UTR mRNA進(jìn)行實驗所觀察到的類似。凋亡通過活化下游的半胱天冬酶來實現(xiàn)。失活的半胱天冬酶原(procaspase)轉(zhuǎn)化為效應(yīng)半胱天冬酶能誘導(dǎo)特異的底物剪切，DNAse的活化及細(xì)胞的破壞。因而，根據(jù)本發(fā) 明可將效應(yīng)半胱天冬酶用于特異地消除PGC。然而，如果抗凋亡的卵母細(xì)胞和早期胚胎體細(xì)胞衍生自通路的更早階段(如在細(xì)胞色素c釋放之前)，則存在這些細(xì)胞也將經(jīng)歷凋亡的風(fēng)險。通過促凋亡分子和抗凋亡分子之間的平衡來調(diào)控凋亡?？赏ㄟ^增加促凋亡基因的表達(dá)或降低促存活基因的表達(dá)來破壞細(xì)胞的凋亡閾值。同樣地，靶向諸如bcl-2、bcl-Xl或bcl-w的抗凋亡基因的下調(diào)也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。靶向抗凋亡基因的下調(diào)可使用抑制性核酸(如反義)來實現(xiàn)?？沟蛲龅腂cl-2家族蛋白可形成具有bax和其他促凋亡蛋白的異ニ聚體，并在凋亡途徑上游起作用。因此，該方法優(yōu)于保護(hù)非PGC的半胱天冬酶酶原基因策略。消除原始生殖細(xì)胞可通過改變其遷移或特化涉及的機(jī)制而間接地實現(xiàn)。正常遷移過程中，遷移不正確的生殖細(xì)胞由于不能到達(dá)允許其存活的胚胎區(qū)域而死亡。負(fù)責(zé)向未來的性腺吸引斑馬魚PGC的分子是SDF-I α——ー種由體細(xì)胞分泌的趨化因子。PGC表達(dá)相應(yīng)的受體即CXCR4 β。由卵母細(xì)胞特異性啟動子下調(diào)的受體將改變PGC遷移并導(dǎo)致活化這些細(xì)胞中的凋亡。此外，PGC中的特異基因的下調(diào)可使用抑制性核酸如反義來實現(xiàn)。在反義方法中沒有表達(dá)其他蛋白，因而可便于調(diào)控檢查過程。該策略的成功取決于早期發(fā)育過程中不存在由下調(diào)基因執(zhí)行的多余或額外功能。PGC遷移中涉及且在本發(fā)明中有用的其他基因包括ggtl、hmgcr和dead-end。PGC特化涉及的基因包括例如vasa和nanos。消除PGC的另一策略是c-kit膜受體或CXCR4i3的顯性負(fù)性突變等位基因的表達(dá)(Fleischman(1992) J. Clin. Invest. 89 1713 ；Spritzet al. (1992)Am. J. Hum. Genetics50:261)。PGC中顯性負(fù)性受體表達(dá)將分別破壞青灰(steel)生長因子和SDF-I α介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。可根據(jù)已知的方法測試備選PGC-消除元件致使PGC中細(xì)胞死亡的能力。備選PGC-消除多核苷酸序列可在體外PGC群中表達(dá)并且與以下進(jìn)行比較(i)無表達(dá)的PGC群和/或(ii)表達(dá)已知能致使PGC中細(xì)胞死亡的序列例如bax的PGC群。通過凋亡的細(xì)胞死亡通常可使用顯微鏡觀察細(xì)胞來檢測。凋亡引起細(xì)胞中有幾種獨特的可識別的效應(yīng)收縮、表面上的泡狀突起、染色質(zhì)降解、線粒體破壞且細(xì)胞色素C釋放、破裂成小膜封閉的碎片、磷脂酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。炎癥受分泌例如IL-10和TGF-β的局部吞噬細(xì)胞的抑制。這些凋亡信號中的許多可易于觀察，而且還可使用商購試劑盒來檢測凋亡，例如ELISA和TUNEL分析試劑盒。
VIII.生殖細(xì)胞特異的3’ UTR順式作用元件可在翻譯啟動之前決定轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞質(zhì)中的定位。這些順式作用元件通常位于3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)。因此3’ UTR中的序列通過如分子馬達(dá)或隔離蛋白來識別和定向。順式作用元件的綜述參見例如Jambhekaret al. (2007)RNA 13:625-42。該現(xiàn)象首次識別的一個例子是果蠅bicoid蛋白。Bicoid轉(zhuǎn)錄本被引導(dǎo)至發(fā)育的卵母細(xì)胞的一端，并且翻譯吋，biCoid定位于細(xì)胞的前部分。這允許bicoid活性的正確定位，用于在發(fā)育的胚胎中形成頭部和胸部。某些3’ UTR元件參與mRNA在卵母細(xì)胞中的定位，并且引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本至生殖質(zhì)，所述 生殖質(zhì)發(fā)育成原始生殖細(xì)胞。這些元件是生殖細(xì)胞特異的3’UTR。生殖細(xì)胞特異的3’UTR序列在進(jìn)化中在動物之間高度保守，其中生殖細(xì)胞由母系遺傳的決定因素精確確定，即先成論(參見 Extravourand Akam(2003) Development 130 :5869-84)。斑馬魚的 dead-end 基因的3’UTR(dnd 3' UTR)和nanosl基因的3’UTR(nanos3’UTR)可用于在PGC中實現(xiàn)特異性表達(dá)。在斑馬魚中，最初兩種基因都被鑒定為定位于原始生埴細(xì)胞的母系mRNA(Koprunneretal. (2001)Genes&Dev. 15 :2877-85 ；ffeidingeret al. (2003)Curr. Biol. 13 :1429-34)。推測該定位是通過其3’ UTR中的順式作用RNA元件的作用。除了 dead-end和nanos的3’UTR之外,屬于生埴質(zhì)特異的mRNA的幾種其他3’UTR可用于該系統(tǒng)中。這些包括 DazL、GasZ、vasa、tudor7、bruno_like 和 granulito 的 3’UTR。生埴質(zhì)RNA的翻譯抑制和差別穩(wěn)定性通過microRNA和microRNA的阻遏物來調(diào)整。已發(fā)現(xiàn)microRNA及其阻遏物與生殖質(zhì)RNA的3’ UTR中的順式作用基序一起都是進(jìn)化保守的，且在魚類到蛙類的低等脊椎動物間功能是可互換的(Knautet al. (2002)Cur.Biol. 12 :545-66)?？紤]到生殖細(xì)胞特異的順式作用元件高度保守的性質(zhì)，這些序列可從例如已知元件的片段設(shè)計合成。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用能將mRNA轉(zhuǎn)錄本引導(dǎo)至生殖質(zhì)或PGC的任何非翻譯區(qū)?？筛鶕?jù)已知方法檢測生殖細(xì)胞特異的定位活性。例如，可使用雜交技術(shù)來檢測包含備選生殖細(xì)胞特異的順式作用元件的mRNA轉(zhuǎn)錄本的定位，例如用mRNA轉(zhuǎn)錄本的子序列特異的可檢測的標(biāo)記寡核苷酸探針?？蛇x擇地，可檢測蛋白產(chǎn)物，例如，使用蛋白標(biāo)記物如GFP。特定序列引導(dǎo)基因產(chǎn)物至生殖質(zhì)的能力可通過將測試序列與編碼GFP或某些其他可檢測蛋白的序列相連接并且利用顯微鏡技術(shù)顯現(xiàn)來檢測。IX.動物和本發(fā)明的應(yīng)用如以上所說明，可將本發(fā)明用于產(chǎn)生動物的不育群，并且可有利地應(yīng)用于商業(yè)養(yǎng)殖物種，以及入侵物種或有害物種?？蓪⒈景l(fā)明用于根據(jù)“先成”過程由母系遺傳的決定因素精確確定其生殖細(xì)胞的動物。這些母系決定因素存在于生殖質(zhì)(或極質(zhì))中，即在進(jìn)化遠(yuǎn)緣的生物(例如秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、斑馬魚和非洲爪蟾(Xenopus Iaevis))的卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域。因此,可將本發(fā)明用于例如魚類、兩棲動物、貝類(shellfish)、甲殼類動物、軟體動物、昆蟲類和其他節(jié)肢動物中。隨著合子經(jīng)歷有絲分裂，生殖質(zhì)最終被局限于胚胎的少數(shù)細(xì)胞中。然后這些生殖細(xì)胞遷移到性腺并最終分化成功能性卵子或精子。
魚類和貝類是主要的焦點，因為這些動物(i)可在野生環(huán)境繁殖和存活，并且易于建立野生種群；(ii)具有本地親緣物種，提高了基因流向它們或與它們競爭的可能性；
(iii)可經(jīng)基因改造以產(chǎn)生具有提高的生長率、疾病抗性或食物轉(zhuǎn)化率的品系。對于某些水族館或?qū)櫸雉~物種如GlowFish 的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)也很重要。該技術(shù)提供了無需激素處理(出于環(huán)境原因是不可取的)而產(chǎn)生單性別雄性群的方法。全雄性群在雄性生長比雌性快的物種中(如羅非魚)是有優(yōu)勢的。不育魚類存在經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。不育魚類能改善培養(yǎng)狀況。在現(xiàn)代有鰭魚(fin-fish)水產(chǎn)養(yǎng)殖中，高生長率致使所捕獲的魚類比野生型動物性成熟更早且在魚類到達(dá)最佳出售大小之前。性早熟降低了生長、損壞肉質(zhì)(顔色、ロ感和質(zhì)地)以及增加死亡率。不育魚類從未經(jīng)歷性成熟，因而具有(i)更高的食物轉(zhuǎn)化率，因為沒有用于性腺發(fā)育的能量損失；(ii) 提高生長率；以及(iii)整個繁殖季節(jié)保持最佳出售狀況。昆蟲類是另一重要的應(yīng)用。迫切需要能控制有害昆蟲的技木，其可替代用于大規(guī)模釋放的輻射誘導(dǎo)的不育雄性(SIT)。依賴于照射的SIT的缺點，包括(i)需要重復(fù)釋放；
(ii)花時間分離性別以避免釋放雌性昆蟲(其對人類、家畜和農(nóng)作物通常具有更多的負(fù)面影響)電離輻射通常影響雄性健康、壽命和交配適合度，這使它們不太能與野生雄性競爭；(iv)該技術(shù)是物種特異的；以及(V)高成本。本發(fā)明的母系誘導(dǎo)的不育技術(shù)無需輻射設(shè)備；允許廉價產(chǎn)生單性別雄性不育群；得到健康且健壯的不育雄性；以及應(yīng)用于廣泛的物種。明顯地，單獨釋放本發(fā)明的不育個體可用于控制有害物種和入侵物種。示例性目標(biāo)物種包括軟體動物(如斑馬蛘(zebra mussel)、蘋果螺(Ampullariidae)、觸角豆螺(Bithynia tentaculata),中國圓田螺(Cipangopaludina chinensis)、河蟲見(Corbiculafluminea)、斑紋蟲豐(Dreissena polymorpha)、泥螺(Potamopyrgus antipodarum)、脈紅螺(Rapana venosa));魚類(如灰西魚非(Alosapseudoharengus)、烏魚豊(Channa argus)、鯉魚(Cyprinus carpio)、梅花魚盧(Gymnocephalus cemuus)、白鏈(Hypophthalmichthysmolitrix)、鋪魚(Hypophthalmichthys nobilis)、鱔魚(Monopterus albus)、奸虎魚(Neogobius melanostomus)、旲利亞羅非魚(Oreochromis aureus)、海七觸獲(Petromyzonmarinus)、平頭餘魚(Pylodictis olivaris));以及昆蟲類(如半翅目(Aphis melinus)、雙翅目(蚊蟲和蜆如舌蜆、蘋果實蜆(Rhagoletis pomonella)、地中海實蜆(Ceratitiscapitata)、墨西哥按實蜆(Anastrepha ludens))、鱗翅目(如 Agrotis munda、原切根蟲(Euxoa auxiliaries)),以及鞘翅目(例如山松甲蟲(Dendroctonus ponderosae)、小蠹蟲(XyleDorus glabratus)、象鼻蟲(Diaprepes abbreviatus))。不育昆蟲的易于繁殖的品系將允許基因改造有益物種(如蜜蜂)，以提高期望的性狀(疾病抗性、殺蟲劑抗性)或以引入破壞蚊蟲或其他昆蟲載體中疾病傳播的機(jī)制。這些應(yīng)用的背景資料參見例如 Braig&Yan 及 Spielman 在 Genetically enRineered or Ran isms assessinR environmental and human health effects (務(wù)因工程生物評估環(huán)境和人類健康效應(yīng)，2002)中的文章，分別在251和315頁；以及Wimmer (2003)Nat. Rev. Gen. 4 225-32。還可將本發(fā)明用于產(chǎn)生缺乏內(nèi)源性PGC的胚胎，以用作源自進(jìn)化遠(yuǎn)緣物種的生殖細(xì)胞移植的宿主。PGC可易于標(biāo)記(如本文所述)，并且從活體分離(如使用酶促組織解剖和流式細(xì)胞術(shù))。還可將PGC移植到胚胎，在那里它們可進(jìn)一歩分化成受體生物中的功能性精子或卵子。已成功進(jìn)行異種移植并顯示移植的PGC與內(nèi)源性配子同時發(fā)育且是功能性的(Cirunaet al. (2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :14919-24 ;Takeuchiet al. (2004)Nature 430 :629-30 ；Saitoet al. (2008)Biol. Reprod. 78 :159)。如果宿主物種達(dá)到性成熟所必需的時間比供體物種更短，或者如果可更有效地培育宿主物種(更小的尺寸、更容易的培育技術(shù))，則該技術(shù)可減少與商業(yè)化水產(chǎn)養(yǎng)殖的制種相關(guān)的時間、成本、培養(yǎng)空間和勞動力。此外，可將異種移植用于基因保存。該技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用需要(i)全部生殖系替換和(ii)廉價且高效產(chǎn)生用于移植的宿主胚胎。使用本文描述的MSC技術(shù)可滿足這些需要?？衫斫獾氖?，本文描述的實施例和實施方案僅是為了解釋的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解對本發(fā)明公開內(nèi)容的各種修飾和改變都包括于本文公開的精神和界限以及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文所引用的全部公開出版物、專利和專利申請在此為了全部目的 通過引用整體并入。X.實施例材料與方法動物維持、產(chǎn)卵和受精在循環(huán)培養(yǎng)系統(tǒng)中維持斑馬魚(野生型品系和轉(zhuǎn)基因系)并于以下條件的水中培育28. 50C 14小時光照/10小時黑暗周期。成年斑馬魚每天喂薄片食物(TretraMin)。由自發(fā)產(chǎn)卵獲得的胚胎姆天兩次喂活觸足蟲(brine shrimp)。收集胚胎并如Kimmeiet al. (1995) (Dev. Dyn. 203, 253-310)所述分階段。全部實驗按照已批準(zhǔn)的IAOJC草案進(jìn)行。對于虹鱒(O. mykiss)和大西洋鮭(Salmo salar),將配子維持于4°C的氧氣中最多4天。每天,I至2批卵受精(25ml卵和l_2ml精子)。在林格氏溶液(Ringerssolution)中進(jìn)行精子活化和受精來防止卵膜硬化。對于每批注射的卵，保留約100個未顯微注射的卵作為受精的對照。將注射和非注射的卵放置在孵化器/培養(yǎng)系統(tǒng)中(8-10°C的循環(huán)水)。受精后約20天時分批檢測對照卵的受精率/存活。構(gòu)建體載體I-Scel zpc zbax dnd (MSCzpc)和 I-Sce Ikop zbax dnd(MSCkop):從在初步研究中使用開發(fā)的載體(Litmus28i_bax :dnd)消化并純化含有bax dnd 3，UTR的1093bp的NcoI-PstI片段。將所純化的片段亞克隆到NcoI-PstI消化且凝膠純化的載體骨架I-Scel zpc egfp :dnd或kop egfp dnd中。將連接物轉(zhuǎn)化到10F’感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen),接種并篩選轉(zhuǎn)化子，以鑒定兩個含有側(cè)翼為I-SceI位點的Bax表達(dá)盒的質(zhì)粒。載體Litmus 28i_eGFP nosl :設(shè)計寡核苷酸引物以擴(kuò)增610pb的nanos I3’ UTR(nosI)(正義5’ -GCGAAGCTTGATGCTCCGGGAGATTTG-3’ (SEQ ID NO 1)和反義 5’ -CCCAAGCTTAGAGAAAATGTTTATATTTTCC-3’ (SEQ ID NO :2))，兩個序列在引物末端都包括限制性位點Hindlll。使用斑馬魚基因組DNA(20ng和600ng)進(jìn)行PCR。在以下溫度條件下進(jìn)行30個循環(huán)的反應(yīng)94°C，30秒；56°C，30秒；及72°C，55秒。將PCR產(chǎn)物克隆到PCR-T0P02. I質(zhì)粒載體(Invitrogen)中。然后將 Nanos I 3’UTR 亞克隆到 Litmus 28i_eGFP :dnd 的HindIII位點之間，以產(chǎn)生Litmus 28トeGFP nosl (圖3A2)。選擇具有正確定位的nosl的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(SphI限制性消化分析)。Litmus 28i_ssbax :nosl :使用 Primer Select 設(shè)計 bax 大西洋鮭序列(NCBI 登錄號#BT048648)側(cè)翼的寡核苷酸引物(5’-ATGGCAGACTCCCGAGAAAGAAG-3’ (SEQ ID NO 3)和 5，-TCAGCGTGTTTTCCTCCAGTAA-3’ (SEQ ID NO :4))并用于擴(kuò)增 615pb 的 ssbax 編碼序列。使用產(chǎn)生自肌肉、垂體腺和脾組織的大西洋鮭cDNA(20ng和600ng)進(jìn)行PCR。在以下溫度條件下進(jìn)行30個循環(huán)的反應(yīng)94°C，30秒；60°C，30秒；及72°C，40秒。在瓊脂糖凝膠上從含有脾cDNA的反應(yīng)鑒定預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物克隆到PCR-T0P02. I質(zhì)粒載體(Invitrogen)中。從TOPO載體消化約620pb的ssbaxEcoRI片段,凝膠純化并連接到事先用EcoRI線性化、凝膠純化和堿性磷酸酶處理的Litmus 28i_eGFP nosl中。將所得到的具有正義和反義定向的插入物的新構(gòu)建體(Litmus 2Si-ssbax nosl)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中。通過限制性消化(Hind III)篩選所克隆的質(zhì)粒來選擇適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。
顯微注射利用已建立的技術(shù)用壓カ顯微注射器(Femtojet, Eppendorf,Germany)顯微注射斑馬魚胚胎。顯微注射之前,擴(kuò)增并純化(Qiagen Maxiprep試劑盒(Qiagen,USA))2 種 MSC 構(gòu)建體，并且用 IsceI (New England Biolab)線性化。用 Ι-Scel 大范圍核酸酶(DNA IOg/μ I ;商購大范圍核酸酶緩沖液(New England Buffer, USA) :0. 5ml大范圍核酸酶I-SceI :1単位/μ I ；0. 1%酚紅)通過卵膜將兩種質(zhì)粒顯微注射到單細(xì)胞階段胚胎的細(xì)胞質(zhì)中。通過qRT-PCR檢測MSC和GFP轉(zhuǎn)基因?qū)⑴嘤郊sI月齡的所有注射的斑馬魚麻酔，剪下鰭并單獨放置在小廣ロ瓶中，同時提取它們的鰭DNA(R Corbett自動系統(tǒng))并利用定量實時PCR(qRT-PCR)進(jìn)行基因型分型以鑒定嵌合體魚。收集來自嵌合體雄性和野生型雌性交配的受精卵，從3批7個胚胎中提取DNA。使用設(shè)計擴(kuò)增bax和dnd之間的 MSC 特異性連接的引物(bax 正向5’ -GTTATTTTGGCACCCCCACCTG-3 ‘(SEQ ID NO 5),dead end 反向 5’ -CAATCACATTCGATCAAGCCATAA-3’ (SEQ ID NO :6)，在限定的條件(94°C，30秒；58°C，30秒；72°C，45秒)下對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用GFP特異性引物對(正向5，-TACGGCGTGCAGTGCCTTC-3，(SEQ ID NO :7)，反向5，-TGCGCTCCTGGAGTAGC-3，(SEQID NO :8))檢測GFP轉(zhuǎn)基因；使用編碼肌動蛋白的DNA作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。用商購軟件包(Primer Select DNAstar)設(shè)計所有引物對,使用相同的參數(shù)以產(chǎn)生相似大小的擴(kuò)增子。體內(nèi)過表達(dá)實驗通過NcoI消化使含有eGFP :dnd、eGFP Nosl> zbax dnd和ssbac nosl (z :來自斑馬魚，ss :來自大西洋鮭)的質(zhì)粒線性化，然后按照廠商說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(Message Machine T7試劑盒(Ambion Inc.，Austin, TX))。合成的帶帽嵌合RNA用苯酚/氯仿提取，用こ醇沉淀并以100-300ng/ul的終濃度溶解于不含RNAse的水中。將合成的帶帽正義mRNA注射到單細(xì)胞階段的斑馬魚胚胎中。對于大西洋鮭和虹鱒,將約2-20nl的RNA溶液通過胚胎的卵孔顯微注射到受精后10分鐘至4小時之內(nèi)的胚盤。將未注射的受精卵放置在卵培養(yǎng)系統(tǒng)中，作為成功受精/存活的對照。為分析斑馬魚bax的功能性，將處理的大西洋鮭胚胎用eGFP nosl mRNA(50pg/胚胎)和zbaax noslmRNA(50-150pg/胚胎)共注射。對照胚胎用單獨的eGFP nosl mRNA(50pg/胚胎)、單獨的zbaax nosl mRNA注射，以及野生型(WT)胚胎沒有接受注射。PGC發(fā)育分析大于95%的PGC遷移到生殖脊區(qū)域吋，首先分析prim_5期(約24hpf)時胚胎中的PGC。用熒光顯微鏡顯現(xiàn)活胚胎，并通過對生殖脊兩側(cè)的PGC數(shù)量和異常PGC的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)來分析PGC發(fā)育。對于吖啶橙(AO)染色，活胚胎在24hpf時用手去卵膜并以16. 7#g/ml放置在胚胎培養(yǎng)液的AO中20分鐘。將胚胎在O. 0003% 3-氨基苯甲酸中麻醉并放置在熒光顯微鏡下進(jìn)行分析。組織學(xué)對于組織學(xué)，將組織在Bouin固定液(Sigma)中過夜固定、脫水并在石蠟中滲透。將石臘切片切成O. 5 μ m并用蘇木精和伊紅(Pacific Histology, San Diego, CA)染色。qRT-PCR和RT-PCR :從2_3個月齡的不育、部分可育和野生型雄性和雌性斑馬魚中分離性腺。在Trizol試劑中收集組織(Sigma)并按廠商說明提取RNA。使用MNLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈cDNA。平行進(jìn)行不含逆轉(zhuǎn)錄酶的對照反應(yīng)。用DNAse I處理制備用于qRT-PCR的RNA。使用以下引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(大寫字母)和 qRT-PCR (小寫字母)vasa 正向5’ -TGGACTATATTTTCCTTGCTGTTG-3J (SEQID NO 9)和 5，-cgtgagtggcagcaatcct-3’ (SEQ ID NO 10) ；zbvasa 反向5，TATTCCCATTCCTCATCGTCTGC-3’ (SEQ ID NO :11)和 5，-gtgtaggcttcacatatccag-3，(SEQ ID NO 12) ；zb sox9a 正向5 ’ -CACCCTACGCTGGAGGATACG-3 ’ (SEQ ID NO:13)和 5’-cggtgaagaacggccagagc_3’ (SEQ ID NO :14) ； zb sox9a 反向5’ -CCATCATGCACTGAACGAACA-3’ (SEQ ID NO :15)和 5’-ctgtagagtcagcaatgggt-3’ (SEQID NO 16) ； β 肌動蛋白正向5’ -GACATCAAGGAGAAGCTGTGC-3’ (SEQ ID NO :17)，β 肌動蛋白反向5’ -GAGGAGGGCAAAGTGGTAAAC-3’ (SEQ ID NO 18)；以及 cypl9ala 正向5’ -CTGCTAGCCATCAGACACCA-3’ (SEQ ID NO 19) ；cypl9ala 反向5’ -ATCCTGCAACTCCTGAGCAT-3’ (SEQ ID NO 20)。數(shù)據(jù)分析總PGC數(shù)量代表生殖脊和異常PGC的總和。平均總PGC和平均異常PGC使用非配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較，顯著性設(shè)置于P < O. 05。實施例I :使用斑馬魚的原理論證為評估母系不育構(gòu)建體(MSC)的功能性并證明模式生物中PGC的消除，我們構(gòu)建了產(chǎn)生受zona pellucida或askopos卵母細(xì)胞特異性啟動子控制的bax-dnd 3’ UTR RNA的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(圖5A)。如果母系提供的bax-dnd 3’UTR RNA在卵子發(fā)生過程中表達(dá)并存在于卵中，則胚胎發(fā)育將導(dǎo)致個體沒有生殖細(xì)胞。該結(jié)果將產(chǎn)生不育的一代，或被稱為無府代表型(grandchildless phenotype；。為消除PGC，我們依賴于斑馬魚促凋亡基因bax的異常過表達(dá)的固有凋亡機(jī)制的活化。Bax屬于凋亡關(guān)鍵蛋白調(diào)控子家族(Bcl-2家族(van Delft和Huang(2006)CellRes. 16 :203-13))，該家族包含抗凋亡(如Bcl-2和Bcl-XL)和促凋亡(如Bax、Bik、Bad)成員。這些分子的比例是細(xì)胞命運的關(guān)鍵決定因素。提高抗凋亡基因表達(dá)促成細(xì)胞存活延長，而增加促凋亡基因的表達(dá)水平將加速細(xì)胞死亡。精確控制細(xì)胞死亡以去除異常、錯位或過量PGC是維持生殖系連續(xù)性和完整性的關(guān)鍵，防止生殖細(xì)胞在除性腺以外的位置建群。已表明Bax參與大鼠和小鼠的雄性和雌性性腺中的生殖細(xì)胞凋亡(Knudsonetal. (1995)Science270 96 ；Perezet al. (1999)Nature Gen. 21:200-03 ；Yamamotoet al. (2000)Soc.Study Reprod. 63 :1683-90 ；De Feliniet al. (1999)Cell Death and Diff. 6 :908-15)。在斑馬魚、虹鱒和小鼠胚胎中，已表明Bax和其他促凋亡基因參與在從原始位置向性腺遷移過程中被錯誤引導(dǎo)的 PGC 的死亡(Stallocket al. (2003)Development 130:6589-97)。然而，從未報道通過異常表達(dá)Bax或轉(zhuǎn)基因遞送任何其他蛋白來消除PGC。
為初步證明我們方法的可行性，我們形成了 T7啟動子控制下的斑馬魚bax-1融合到斑馬魚dnd基因的3’ UTR的質(zhì)粒(圖4A)。由該構(gòu)建體體外制備了帶帽的合成bax-dnd3’UTR mRNA(圖4B)并將不同濃度(80pg至2ng)注射入從啟動子zpc表達(dá)GFP且具有dnd-3’UTR的轉(zhuǎn)基因雌性的1-2細(xì)胞階段的斑馬魚胚胎(如圖2所示，該轉(zhuǎn)基因系產(chǎn)生GFP標(biāo)記的PGC)中。每種mRNA劑量使用15_20個胚胎的組。最低濃度吋，mRNA注射組和非注射對照之間未觀察到存活有特別的差異。更高的濃度觸發(fā)劑量依賴的胚胎死亡率(圖4C)，通過囊胚轉(zhuǎn)換之后不久的卵裂球和卵黃來表征。這表明高劑量Bax-I誘導(dǎo)胚胎的凋亡。減少所注射的bax-dnd-3’ UTR mRNA的量導(dǎo)致死亡率降低。在熒光顯微鏡下分析用400pg RNA注射的胚胎(其在原腸胚形成時仍存活且表型似乎是正常的)(圖4F和G)，并與PBS注射的同胞胚胎(圖4D和E)進(jìn)行比較。 結(jié)果表明，bax-dnd 3’ UTR RNA注射胚胎中的PGC正在死亡(i)在48hpf (受精后的小吋)的胚胎中RNA處理胚胎的熒光PGC數(shù)量顯著減少或完全不存在，以及(ii)受精后18-24小時時RNA注射胚胎中的PGC顯示出形態(tài)變化，這包括胞膜起泡、之后形成細(xì)胞經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡所特有的凋亡小體(圖4H、I、J) (Richet al. (1999)Nat. Cell. Biol. I E60-71)。這些胚胎隨著它們繼續(xù)發(fā)育沒有顯示出體細(xì)胞缺陷。我們將20個RNA注射的胚胎培養(yǎng)到成年，發(fā)現(xiàn)全部發(fā)育成顯示正常雄性性行為(與野生型雌性配對時誘導(dǎo)產(chǎn)卵)的表型雄性(圖4K)。對照PBS注射的同胞產(chǎn)生具有約50%性別比的雄性和雌性子代(圖4K)。此外，20條bax處理的魚中有12條完全不育，通過它們在三次連續(xù)交配中不能使卵受精來判定。為證實不育表型，解剖不育雄性的性腺，發(fā)現(xiàn)半透明的管狀結(jié)構(gòu)(圖4M)代替了可育雄性中存在的卵形不透明結(jié)構(gòu)(圖4L)。實施例2 :生殖系可遺傳的轉(zhuǎn)基因斑馬魚我們接下來形成攜帶兩個母系不育構(gòu)建體即zpc zbax dnd(MSCzpc)和kop zbax dnd(MSCkop)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(圖5A)。將載體注射入兩批200個受精卵中。顯微注射后三天記錄60-70%的存活率。存活胚胎(約50%)在一月齡時剪鰭，以檢測攜帶轉(zhuǎn)基因的個體。所篩選的66條和80條魚中，檢測到MSCkop和MSCzpc轉(zhuǎn)基因陽性分別為25條(37% )和34條(42% )。培育其余PCR陽性的魚至性成熟，鑒定性別，使鑒定為雄性的魚與同窩野生型雌性魚雜交，以測定它們將構(gòu)建體遺傳給其子代的能力。在所篩選的MSCkop和MSCzpc分別為11條和13條的雄性中，2條和4條產(chǎn)生至少ー批PCR陽性胚胎(每個親本對篩選3批7個胚胎)。生埴系能夠遺傳的這6條雄性建群者與攜帶zpc :eGFP :dnd(GFPzpc)或kop :eGFP dnd(GFPkop)構(gòu)建體的雜合雌性雜交。在全部隨后的雜交中使用同一GFP系以建立生殖細(xì)胞評估的標(biāo)志物。將來自這些雜交的子代(約10-50個胚胎/建群者/構(gòu)建體)培育到約I月齡，通過PCR篩選以鑒定攜帶MSC和GFP轉(zhuǎn)基因的魚。10個胚胎中檢測到平均3個是MSC陽性(33. 5% +/-9% )，表明相對低程度的MSC生殖系嵌合體。將這些Fl代魚培育到成熟并鑒定性別?？偣茶b定了 19條Fl雄性和20條Fl雌性是MSC陽性(圖5B)。在源自轉(zhuǎn)基因雄性建群者的Fl子代中觀測到相等的性別比，表明轉(zhuǎn)基因?qū)π詣e決定不存在父系或合子效應(yīng)。使用來自各系的Fl雄性和雌性來產(chǎn)生下一代MSC轉(zhuǎn)基因魚。實施例3 :證實F2發(fā)育胚胎的PGC消除
每個品系中使用最多3條Fl雄性和3條Fl雌性來建立譜系。通過熒光顯微鏡分析源自攜帶GFP和MSC轉(zhuǎn)基因的雌性的F2胚胎，并且在受精后24小時和48小時(hpf)記錄PGC數(shù)量(即GFP陽性細(xì)胞)。如果轉(zhuǎn)基因確實是特異的母系表達(dá)，則預(yù)期相對于對照胚胎(即由同窩雌性GFP產(chǎn)生的那些胚胎)而言，F(xiàn)lMSC雌性產(chǎn)生具有減少的PGC或沒有PGC的胚胎。來自MSCzpc22和MSCzpc9系的Fl雌性的所有胚胎中，分別有多于90%和70%完全沒有可見的GFP+細(xì)胞。相反地，來自MSCzpcll和MSCzpc3系的Fl雌性產(chǎn)生的胚胎，只有5-10%沒有可檢測的GFP+細(xì)胞。MSCkop2系的3條Fl雌性同樣產(chǎn)生30-80%沒有GFP+形式的胚胎。此外，由GFP MSC雌性產(chǎn)生的所有其他胚胎具有從正常至顯著減少的PGC數(shù)量范圍。圖5E中給出從每個Fl雌性收集的每個胚胎(η = 20)的PGC平均數(shù)量。通過GFP同窩雌性與FlMSC或野生型雄性雜交產(chǎn)生的F2胚胎具有大約30個PGC (圖 5Ε)，正常計數(shù)(Yoonet al. (1997) Developmentl24 :3157)，表明 MSC 轉(zhuǎn)基因?qū)?PGC存活沒有父系或合子效應(yīng)。 分析PGC的最早缺失為更精確地確定PGC在哪個階段變得有缺失，我們監(jiān)測源自雌性MSCzpc3的胚胎，其在24和48hpf時產(chǎn)生的胚胎的PGC計數(shù)范圍為正常至零(分別為A組、B組和C組(圖OT))。30%外包(原腸胚形成過程中細(xì)胞層變細(xì)且分散，約5hpf)吋，在所有胚胎中發(fā)現(xiàn)GFP-細(xì)胞(圖5C1)。在約IOhpf吋，具有PGC數(shù)量減少的組可被清楚地識別。通過凋亡的PGC死亡在GFP+細(xì)胞最終消失的胚胎中，檢測具有凋亡形態(tài)學(xué)信號(如胞膜起泡之后形成凋亡小體)的PGC。將源自無GFP構(gòu)建體的MSC Fl雌性的胚胎(圖5C2, MSCzpc 11系)用活體染料吖啶橙(A0，氯化吖啶半-(氯化鋅))染色并用熒光顯微鏡分析。如圖5C2所示，綠色熒光細(xì)胞在性腺原基成群出現(xiàn)。該觀測結(jié)果表明，不育是由于原始生殖細(xì)胞的早期凋亡。在以下所述的營救實驗中示出，進(jìn)ー步證實不育表型的母系效應(yīng)是由于bax-誘導(dǎo)的凋亡。斑馬魚中，過表達(dá)Bcl-XL阻斷由最小致死劑量的Bax誘導(dǎo)的凋亡(Kratzetal. (2006)Cell Death&Differentiation 13:1631-1640)。我們產(chǎn)生合成的帶帽 Bcl-XL :dnd 3’UTR mRNA并在源自MSC雌性的單細(xì)胞階段胚胎中顯微注射經(jīng)滴定的該轉(zhuǎn)錄本。10個注射存活的胚胎中，有8個變成雄性而2個變成雌性。10個全部可育。未注射的對照同胞(η = 20)中，全部是雄性且其中90%是不育的。為檢測48hpf時沒有GFP表達(dá)是否是不育的可靠指示物，我們在MSCzpc3系和MSCkop2系中分選GFP-陽性和陰性胚胎，并單獨培育它們至性成熟(約3-4月齡)。我們進(jìn)ー步從MSCzpc3系中以0-2個PGC ;3_6個PGC ;及7-13個PGC為組分離胚胎(圖OT)。我們發(fā)現(xiàn)成體不育與胚胎中所觀測到的PGC數(shù)量具有明顯的相關(guān)性。實施例4 :證明成體中母系指導(dǎo)的功能性不育MSC轉(zhuǎn)基因雌性優(yōu)先產(chǎn)生雄性后代在性別分化之前具有減少的生殖細(xì)胞或沒有生殖細(xì)胞的魚胚胎(斑馬魚和青鏘)發(fā)育成雄性(Houwinget al. (2007)Cell 129 :69-82 ；Slanchevet al. (2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 :4074-79 ；Kurokawaet al. (2007)Proc. Natl. Acad. Sci. 104 :16958-63)。此時，雄性根據(jù)體型、顏色和沒有泄殖乳突(urogenital papillae)進(jìn)行直觀鑒定。在全部品系中觀察到向雄性發(fā)育的強烈偏向。雖然雄性偏向在品系之間改變，但是在至少6條不同的MSC Fl雌性與野生型雄性雜交的子代中，雄性的數(shù)量一律超過70% (圖5B)。有趣的是，產(chǎn)生最強PGC缺失的胚胎(來自MSCzpc9系，zpc22系的胚胎中PGC計數(shù)減少> 85%，圖5E)的MSC Fl雌性同樣產(chǎn)生最強的雄性偏向(90-100%雄性)(圖5B)。Fl MSC雄性與野生型雌性之間的雜交并未觀察到子代雄性化(具有MSC父本遺傳的雄性產(chǎn)生50%雄性50%雌性子代)，并且子代是可育的(圖5B)。無后代表型的外顯率水平改變可能是由于整合位點、基因組中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)量或不同品系之間最終影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的后生過程的差異。在對PGC計數(shù)進(jìn)行分類之前，我們鑒定MSCzpc3子代的性別。具有少于3個PGC的胚胎(η = 12)全部發(fā)育成雄性。3至6個PGC得到70%的胚胎(η = 10)發(fā)育成雄性。具有7至13個PGC的胚胎發(fā)育出正常的性別比，盡管PGC計數(shù)嚴(yán)重減少。因此，48hpf時大于90%的PGC減少將產(chǎn)生全雄性斑馬魚種群。MSC轉(zhuǎn)基因雌性產(chǎn)生不育子代(無后代表型)為確定PGC數(shù)量的減少和/或完全 消除PGC是否導(dǎo)致受精率和/或不育的魚減少，我們檢測來自三個品系(MSCzpC9，MSCzpC22和MSCkop2)的F2雄性子代。這些雄性全部成功誘導(dǎo)野生型雌性產(chǎn)卵。2-3次連續(xù)交配之后記錄所有受精的卵和未受精的卵的總數(shù)(圖7D)。發(fā)現(xiàn)這3個品系顯示改變的“無后代”表型外顯率。MSCzpc22系的14條F2雄性中僅I條產(chǎn)生可育子代。該雄性具有約15%的低受精率。MSCzpc9系中，只有33% (4/12)的雄性產(chǎn)生可育子代。它們的受精率范圍為20至80%。最后，MSCkop2系中，全部GFP陰性胚胎(沒有可見PGC的那些胚胎)發(fā)育成不育個體，而全部(10/10)GFP陽性胚胎變成可育成體。所分選的具有少至1-3個可見PGC的GFP陽性胚胎變得可育，表明少量存活的生殖細(xì)胞可成功重新形成性腺。發(fā)現(xiàn)與同窩GFP雌性雜交的MSC轉(zhuǎn)基因雄性子代中沒有生育缺陷。母系表達(dá)轉(zhuǎn)基因是不育的充分必要條件用GFP同窩品系的初歩研究表明沒有轉(zhuǎn)基因合子表達(dá)的卵母細(xì)胞特異性表達(dá)(從GFPzpc或GFPkop雄性與野生型雌性雜交的胚胎中未檢測到GFP)。這樣，從MSC Fl雌性，我們應(yīng)能預(yù)期可育和不育同胞F2魚之間相似的轉(zhuǎn)基因分配。通過qRT-PCR，在來自MSCkop2系的GFP陰性(η = 36可能不育)和GFP陽性(η = 34可能可育)胚胎中分別發(fā)現(xiàn)約65%和約68%為MSC陽性。這表明兩組中2拷貝轉(zhuǎn)基因的孟德爾遺傳(75% )。我們證實了 MSCzpc22系中存在非轉(zhuǎn)基因不育成體，其中12條F2不育魚中有4條缺少轉(zhuǎn)基因。這些結(jié)果進(jìn)ー步證實，母系遺傳對于不育是充分條件。因而，母系遺傳MSC轉(zhuǎn)基因同時得到轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的不育子代。不育斑馬魚的性腺結(jié)構(gòu)為在細(xì)胞和分子水平證實不育，我們評估F2不育魚和年齡匹配的可育對照個體的性腺的總體形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對照魚具有正常形狀和成對性腺。相反地，不育的魚在腹腔各側(cè)具有ー對半透明管狀結(jié)構(gòu)(圖6A)。該觀察結(jié)果與mRNAbax-dnd 3’UTR注射實驗中得到的結(jié)果(圖4M) —致。用蘇木精和伊紅染色的組織學(xué)切片顯示，不育的魚的性腺具有有組織的細(xì)管，類似于由與精巢特異的塞爾托利細(xì)胞和萊迪希細(xì)胞相似的細(xì)胞組成的精巣。這些管狀精巣完全沒有生殖細(xì)胞(圖6C)。具有減少的PGC數(shù)量的胚胎的性腺發(fā)育選自具有1-3個PGC的組，顯示出受精率降低的魚或者具有較小但是形狀正常的同樣的ー對性腺，或者具有兩種形態(tài)的性腺，其中在腹部一側(cè)ー個性腺尺寸較小，而第二個腺類似于不育個體中觀察到的性腺。與野生型雄性性腺相比時，減小尺寸的性腺在小葉腔中包含極少的精子(圖6E)。
沒有生殖細(xì)胞的性腺是精巢為證實不育的魚中解剖的管狀結(jié)構(gòu)是雄性性腺，通過定量實時 PCR(qRT-PCR)測定 sox9a 的表達(dá)水平(Chianget al. (2001)Dev. Biol. 231 149-163)，sox9a是塞爾托利細(xì)胞的特異性基因標(biāo)志物。來自不育的魚的性腺的Sox9a以與野生型精巢相似的水平表達(dá)，表明存在塞爾托利細(xì)胞(圖7A，藍(lán)色柱)。為進(jìn)ー步證實不存在雌性組織，我們測定了在卵巢中表達(dá)但是在精巢中不表達(dá)的cypl9a la(Kishida和Gallard(2001)Endocrinology 142:740)。正如野生型雄性的精巢，并未檢測到cypl9a Ia的表達(dá)(圖7A，紅色柱)。為進(jìn)一歩在分子水平評估轉(zhuǎn)基因?qū)GC的效應(yīng)，比較從不育，部分可育和野生型(完全可育)斑馬魚解剖的性腺中生殖細(xì)胞特異性基因標(biāo)志物(vasa)的表達(dá)水平。通過qRT-PCR并未在不育的魚中檢測到vasa的表達(dá)。我們在野生魚中觀測到高表達(dá)，而在生育力降低的魚中觀察到中間水平的表達(dá)(圖7C)。這些結(jié)果證實不育魚中沒有生殖系的組織學(xué)觀察結(jié)果。對從3條不育魚和4條野生型魚(2條雄性和2條雌性)解剖的性腺中的sox9a、vasa和β肌動蛋白基因表達(dá)的PCR分析進(jìn)ー步表明，不育魚的解剖組織包含精巢特異的體細(xì)胞(sox 9a陽性)，但是沒有生殖細(xì)胞(vasa陰性)(圖7B)。
實施例5 :不育表型與MSC轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平相關(guān)且可繁殖我們發(fā)現(xiàn)母系誘導(dǎo)表型(雄性％和不育子代)的嚴(yán)重程度與受精卵中母系bax-dnd 3’ UTR mRNA水平(由qRT-PCR測定)具有較好的相關(guān)性(表I)。具有最嚴(yán)重雄性偏向/不育表型的MSC系(如MSCzpc22)表達(dá)bax-dnd 3’ UTR mRNA的水平最高。具有較弱雄性偏向和大部分可育后代的轉(zhuǎn)基因系(如MSCzpc3)表達(dá)MSC轉(zhuǎn)基因的水平非常低。具有中間表型的品系具有中間水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該相關(guān)性作為母系表型強度的指示物是非常有用的，并且可以用于在早期篩選中選擇最具外顯率的無后代MSC系。表I
品系雄性后代!4 (來自MSC雌性)不育子代》(來自MSC雌性) #中MSC mRNA表達(dá)的相對水平(Sdv)
Fl 或 F2 雄性 F2 代F3***F2 代F3***VVt**F3***
MSC/pc221(1 %(ιι-4( ) MI %(n-1S)92%(η~ !4) 94%(η- 7)1(10%{21%) H)0%(i6%)
MSCzpc991%(n=22) 100%(n=30)60%(n=12) 71%(n=7)19%(8%) 18%(5%)
MSCkop271%-100% η 52%(n-10) 25%(n-8)14%(2.5%) I2%(2%)
MSzpc370%(n=27) η 5%{n=20) η 2%(0.2%) 1%(0.2%)表I :從MSC雌性的隨后兩代(Fl和F2)產(chǎn)生的胚胎(F2，F(xiàn)3)中MSCmRNA水平之間的相關(guān)性，以及a)雄性后代的百分比和b)不育子代的百分比。雄性子代和不育子代的百分比來自每個品系η個成體(指定數(shù)量)的檢驗。早期胚胎中的bax:dnd 3’UTR mRNA水平通過q-PCR從每個品系至少2個雌性的4批卵的平均數(shù)來確定。用管家基因β肌動蛋白校正表達(dá)水平并表示為MSCzpc22系中測定的最高表達(dá)水平的百分比。SD :標(biāo)準(zhǔn)差。不育表型可繁殖通過雄性譜系繁殖的轉(zhuǎn)基因系維持穩(wěn)健的不育表型至少2代。在由Fl和F2雌性產(chǎn)生的胚胎中發(fā)現(xiàn)非常相似的MSCmRNA水平(表1，F(xiàn)2和F3胚胎)，表明在隨后的世代之間維持不育表型。實際上，我們證實了 Fl和F2MSC雌性(產(chǎn)生自同一品系的H)和Fl雄性)產(chǎn)生的后代顯示相似的雄性偏向和相當(dāng)?shù)牟挥硇?，極少有例外。極少情況下，我們在隨后的世代中觀測到MSC mRNA水平降低，并且表型強度降低可能是由于與轉(zhuǎn)基因的多重整合的孟德爾遺傳相關(guān)的MSC轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)降低。因此，我們在來自Fl和F2MSC雌性的F2和F3子代中發(fā)現(xiàn)相似的雄性和不育表型。
實施例6 :在其他有鰭魚類中的應(yīng)用靶向鮭魚中的PGC表達(dá)斑馬魚和鮭魚屬于生殖質(zhì)RNA定位機(jī)制進(jìn)化不同的不同的魚類進(jìn)化枝(分別為骨鰾類(ostariophyan)和euteleost)。我們試圖確定斑馬魚 dead end (dnd)和 nanosl (nosl)的 3’ UTR 是否能在大西洋鮭(Salmo salar)和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)中將RNA翻譯引導(dǎo)至生埴細(xì)胞。在本研究中使用斑馬魚nanosl (nosl) 3’ UTR,因為其用于RNA定位的作用在屬于魚類進(jìn)化樹的所有主要進(jìn)化枝的硬骨魚物種之間(珠光魚、金魚、泥鰍、鯡魚、青鏘和彼氏冰蝦虎魚)似乎是保守的(Saitoetal. (2006)Dev. Biol. 50 :691)。為此，我們形成驅(qū)動eGFP融合到dnd和nosl基因的3’UTR的高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄載體(圖8A1-2)。由這些構(gòu)建體體外制備帶帽的合成的eGFP dnd和eGFP nosImRNA,并將不同濃度注射入單細(xì)胞階段的斑馬魚(對照)、胚胎和受精的虹鱒卵和大西洋鮭卵中(在10分鐘至3hpf期間)。顯微注射之后，在斑馬魚胚胎的全部卵裂球中觀測到普遍的GFP表達(dá)(圖8Z3)，但是體細(xì)胞中的表達(dá)迅速消失(圖8Z1)。在特化不久之后PGS中出現(xiàn)強的GFP (圖 8Z1)。在2天大的斑馬魚胚胎中清楚顯現(xiàn)GFP標(biāo)記的PGC (圖8Z4)。在用eGFP nosl(圖8S1-2)注射的20天大的鮭魚胚胎(圖8S1)和用eGFP Nosl (圖8T3-4)或eGFP dnd mRNA(圖8T1-2)處理的30天大的鱒魚胚胎(圖8T3)中檢測GFP表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)所檢測全部胚胎的約30%中顯示明亮熒光的圓形細(xì)胞，在兩個品系中位于消化道和腹腔背側(cè)之間(圖8S和T)。該GFP表達(dá)模式類似于接受eGFP vasa RNA的虹蹲胚胎中觀測到的模式(Yoshizakiet al. (2005) Biologly of reproduction73 :88)。該結(jié)果證實，斑馬魚dnd和nosl 3’ UTR可將mRNA和隨后的異源蛋白表達(dá)遞送至鱒魚和鮭魚的PGC中。負(fù)責(zé)PGC中母系生殖細(xì)胞mRNA翻譯的機(jī)制進(jìn)化保守的性質(zhì)使得利用生殖細(xì)胞3’ UTR遞送特定異源mRNA至廣泛靶物種的PGC中特別有吸引力。PGC的消除為進(jìn)一歩表明轉(zhuǎn)基因可在遠(yuǎn)緣物種中起作用，我們測試了來自斑馬魚和/或大西洋鮭的bax的異常過表達(dá)是否能分別消除大西洋鮭和/或斑馬魚中的PGC。PCR擴(kuò)增并亞克隆新的大西洋鮭CDNA(SSbax)，其核苷酸和翻譯的氨基酸序列與在線公開的凋亡調(diào)控因子 Bax (Salmo salar, Leonget al. , cGRASP)具有 94%和 99% 的同一性。將 ssbax融合到斑馬魚nanosl 3’UTR并將該表達(dá)盒放置在轉(zhuǎn)錄載體中。由該構(gòu)建體(圖8C1)產(chǎn)生了合成的帶帽RNA ssbax :nosl，并將不同濃度注射到單細(xì)胞階段的斑馬魚胚胎中。顯微注射來自雌性GFP同窩的胚胎，以將處理和未處理胚胎中的GFP表達(dá)模式進(jìn)行比較。我們觀察到，與模仿注射的對照相比，顯微注射的胚胎的PGC計數(shù)顯著減少(圖8C3)。沒有可檢測的PGC的胚胎沒有顯示出身體缺陷。這些結(jié)果支持了程序性細(xì)胞死亡機(jī)制在這些遠(yuǎn)緣硬骨魚進(jìn)化枝中高度保守的概念。為進(jìn)一歩證明該主張，我們從線性化的質(zhì)粒(Litmus28i-T7 bax dnd 3’UTR)制備了斑馬魚bax dnd mRNA。將已受精的單細(xì)胞階段的鮭魚胚胎分成三組并用以下物質(zhì)顯微注射(i) zbax :dnd和eGFP :nosl mRNA (GFP mRNA用作生埴細(xì)胞標(biāo)記)，(ii)單獨的eGFP nosl mRNA,以及(iii)單獨的zbax dnd mRNA。在本研究中由于ー批受精卵具有較低的存活率(參見表2)，所以對小樣本進(jìn)行GFP分析。然而，9個eGFP :nosl處理的胚胎中有3個顯示可檢測的GFP細(xì)胞，而在6個eGFP nosl ；zbax dnd處理的胚胎中沒有任何一個觀測到GFP信號(表2)。表權(quán)利要求
1.分離的表達(dá)構(gòu)建體，其包含 (i)母系不育構(gòu)建體(MSC)啟動子； (ii)能夠消除原始生殖細(xì)胞(PGC)的多核苷酸序列；以及 (iii)生殖細(xì)胞特異的3’非翻譯區(qū)(UTR)， 其中將(i)、( )和(iii)可操作地連接。
2.如權(quán)利要求I所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述(ii)的多核苷酸序列是促凋亡多核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述促凋亡多核苷酸序列編碼選自以下的蛋白bax、bak、bok、bad、bik、puma、noxa 和效應(yīng)半胱天冬酶。
4.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述促凋亡多核苷酸序列減少選自以下的基因的表達(dá)bcl_2、bcl-xl 和 bcl_w。
5.如權(quán)利要求I所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述生殖細(xì)胞特異的3’UTR是選自deadend和vasa的基因的3’ UTR0
6.轉(zhuǎn)基因動物，其攜帯包含權(quán)利要求I所述的表達(dá)構(gòu)建體的母系不育構(gòu)建體(MSC)轉(zhuǎn)基因。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物選自魚類、軟體動物、甲殼類動物、兩棲動物和昆蟲。
8.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物攜帶至少ー種額外的非MSC轉(zhuǎn)基因。
9.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述動物是譜系終結(jié)雌性。
10.產(chǎn)生譜系終結(jié)雌性的方法，其包括 (i)將權(quán)利要求I所述的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入動物祖細(xì)胞，以產(chǎn)生在其生殖細(xì)胞中攜帯所述表達(dá)構(gòu)建體的母系不育構(gòu)建體(MSC)轉(zhuǎn)基因建群動物； (ii)培育步驟(i)的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物，以產(chǎn)生半合子MSC轉(zhuǎn)基因雄性； (iii)使所述MSC轉(zhuǎn)基因雄性與無MSC的雌性交配； (iv)選擇步驟(iii)的MSC轉(zhuǎn)基因雌性子代，以得到譜系終結(jié)雌性。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述譜系終結(jié)雌性攜帯至少ー種額外的非MSC轉(zhuǎn)基因。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其還包括使所述譜系終結(jié)雌性與雄性雜交以產(chǎn)生不育子代的步驟(V)。
13.使母系不育構(gòu)建體(MSC)轉(zhuǎn)基因動物繁殖的方法，其包括 (i)將權(quán)利要求I所述的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入動物胚胎，以產(chǎn)生在其生殖細(xì)胞中攜帯所述表達(dá)構(gòu)建體的母系不育構(gòu)建體(MSC)轉(zhuǎn)基因建群動物； (ii)培育步驟(i)的MSC轉(zhuǎn)基因建群動物，以產(chǎn)生半合子MSC轉(zhuǎn)基因雄性； (iii)使所述MSC轉(zhuǎn)基因雄性與無MSC的雌性交配； (iv)選擇步驟(iii)的MSC轉(zhuǎn)基因雄性子代，以培育并繁殖出MSC轉(zhuǎn)基因動物。
14.產(chǎn)生不育的一代動物的方法，其包括使譜系終結(jié)雌性與雄性雜交，由此產(chǎn)生不育的一代動物的步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中至少ー個親本攜帶至少ー種額外的非MSC轉(zhuǎn)基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了母系不育構(gòu)建體(MSC)和產(chǎn)生無生殖細(xì)胞的不育子代的方法。攜帶MSC轉(zhuǎn)基因的雌性動物將產(chǎn)生不育的一代，因為MSC特異地消除其子代的原始生殖細(xì)胞(PGC)。這些雌性被稱為譜系終結(jié)雌性。然而，攜帶MSC轉(zhuǎn)基因的雄性動物產(chǎn)生可育子代(假定雄性并非源自MSC轉(zhuǎn)基因的雌性)。因而，MSC轉(zhuǎn)基因雄性可用于繁殖轉(zhuǎn)基因系。可將本發(fā)明有利地應(yīng)用于消滅害蟲或入侵物種，或者用于提供有效的種群控制并改善養(yǎng)殖物種如魚類或貝類的培養(yǎng)狀況。
文檔編號C12N15/06GK102695798SQ201080061008
公開日2012年9月26日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月23日
發(fā)明者澤維爾·勞斯, 約翰·T·布坎南 申請人:水慷科技公司