專(zhuān)利名稱(chēng)：用于診斷和篩選與hpv有關(guān)的癌癥的高通量細(xì)胞基hpv免疫測(cè)定的制作方法
用于診斷和篩選與HPV有關(guān)的癌癥的高通量細(xì)胞基HPV免
疫測(cè)定相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2010年I月8日提交的、名稱(chēng)為“用于診斷和篩選與HPV有關(guān)的癌癥的高通量細(xì)胞基HPV免疫測(cè)定”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/335，540的權(quán)益，其內(nèi)容通過(guò)引用被并入本文，為了各種目的。
背景技術(shù)：
宮頸癌是全球女性癌癥死亡的第二最常見(jiàn)的原因，毎年產(chǎn)生約50萬(wàn)新病例，累計(jì)造成約25萬(wàn)死亡例。在美國(guó)，宮頸癌死亡率由于宮頸癌篩查項(xiàng)目已大幅下降，宮頸癌篩查項(xiàng)目檢測(cè)癌前狀態(tài)，以便它們可以在發(fā)展成癌癥之前被治療。當(dāng)前，宮頸癌篩查的典范基于帕氏試驗(yàn)(Pap test)，其是ー種基于細(xì)胞學(xué)的試驗(yàn)，從子宮頸刮下細(xì)胞并在顯微鏡下 檢查以檢測(cè)表明發(fā)育異常細(xì)胞生長(zhǎng)的變化。該試驗(yàn)由于明顯的觀察者間變化性而具有主觀性，并且其受低靈敏性和高假陽(yáng)性結(jié)果的限制。關(guān)于宮頸細(xì)胞學(xué)假陰性率的報(bào)道差異很大，從低至I. 6%到大約28%。在美國(guó)，每年約有400萬(wàn)異常帕氏試驗(yàn)被診斷為意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)，非典型鱗狀細(xì)胞不能排除高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變(ASC-H)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)或非典型腺細(xì)胞(AGC)。在當(dāng)前的實(shí)踐指導(dǎo)方針下，對(duì)這些病例進(jìn)行陰道鏡檢查，以進(jìn)一歩識(shí)別將具有臨床上明顯的高級(jí)病變(CIN2/3)或在宮頸活檢時(shí)具有子宮頸內(nèi)瘤形成的患者亞組。根據(jù)ー些報(bào)道，患有細(xì)胞學(xué)診斷的ASC-US (在美國(guó)每年超過(guò)200萬(wàn)例)的患者在宮頸活檢時(shí)僅有5%到17%的可能性成為潛在的CIN2/3，而在LSIL (在美國(guó)每年約160萬(wàn)例)中，發(fā)現(xiàn)CIN2/3高達(dá)25%。這些數(shù)據(jù)表明，在陰道涂片時(shí)患有ASC-US或LSIL的約300萬(wàn)病例不需要陰道鏡檢查。盡管陰道鏡活組織檢查一直以來(lái)被視為黃金標(biāo)準(zhǔn)，但最近的報(bào)道表明，由于取樣或診斷錯(cuò)誤，宮頸活檢可能遺漏33%到50%的高等級(jí)疾病。因此，可能難以區(qū)分假陽(yáng)性宮頸細(xì)胞學(xué)結(jié)果和假陰性活組織檢查結(jié)果。因而，極需ー種檢測(cè)來(lái)鑒定高級(jí)發(fā)育異常，以將可以最大受益于本干預(yù)的患者分類(lèi)。雖然大部分低度宮頸發(fā)育異常自動(dòng)退化而不導(dǎo)致宮頸癌，但發(fā)育異?？捎米餍枰岣呔璧恼髡?。CINl是最常見(jiàn)和最良性形式的宮頸上皮內(nèi)瘤形成，其通常會(huì)在兩年內(nèi)自然分解。正因如此，LSIL結(jié)果可用簡(jiǎn)單的“觀望和等待”的理念來(lái)處理。然而，因有12-16%的機(jī)會(huì)發(fā)展成更嚴(yán)重的發(fā)育異常，醫(yī)生可能希望通過(guò)陰道鏡檢查用活組織檢查來(lái)更侵襲性地追蹤結(jié)果。如果發(fā)育異常發(fā)展，則治療可能是必要的。因此，需要ー種方法來(lái)原位檢測(cè)人乳突病毒HPV癌蛋白。它會(huì)特別有助于在ASC-US或LSIL或CINl患者中檢測(cè)高度發(fā)育異常細(xì)胞以及鑒定潛在的CIN2或以上的那些患者，其可受益于立即干預(yù)并避免與“等待和觀望”方法伴隨的焦慮。人乳頭瘤病毒(HPV)對(duì)特定上皮細(xì)胞的感染以及產(chǎn)生的上皮增生對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)揮重要的作用。發(fā)現(xiàn)約99%例確診宮頸癌病例與以活組織檢查確認(rèn)的鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN)的HPV感染有夫。HPV感染——主要通過(guò)性接觸傳播——的發(fā)生率在年輕女性中最高，并且，世界上目前約有2，000萬(wàn)性活躍男女被感染。約1%的群體具有生殖器疣突，而4%的女性具有宮頸癌前病變，如低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)或高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)或意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)。這些病變，優(yōu)選在年齡介于35-40歲的女性中觀察到的病變均伴隨發(fā)展成浸潤(rùn)性宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)。一般認(rèn)為，持續(xù)HPV感染對(duì)于發(fā)展成上皮癌前病變是必要的。然而，在感染有高風(fēng)險(xiǎn)HPV菌株的女性中，LSIL并不總是發(fā)展成HSIL。大部分被診斷有LSIL的人類(lèi)對(duì)象病情都會(huì)緩解。雖然99. 7%的宮頸癌為HPV陽(yáng)性，但病毒基因組需整合到宿主基因組，以促進(jìn)觸發(fā)HSIL或癌發(fā)展的基因的表達(dá)。事實(shí)上，每10個(gè)患有持續(xù)HPV感染的婦女中，只有一個(gè)發(fā)展為高級(jí)CIN病變，如宮頸上皮內(nèi)瘤形成(CIN) 2級(jí)和3級(jí)(分別為CIN2和CIN3)，在某些情況下，其最終發(fā)展為子宮頸癌。由HPV感染引起的疾病分期包括早期HPV感染、晩期HPV感染、意義不明確的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)、非典型鱗狀細(xì)胞，不能排除HSIL(ASC-H)、非典型腺細(xì)胞(AGC)、低級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、分別代表輕度、中度或嚴(yán)重細(xì)胞發(fā) 育異常的宮頸內(nèi)贅生物CIN1、CIN2、CIN3、浸潤(rùn)性宮頸癌、腺癌或鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于核酸的HPV檢測(cè)分析，但考慮到高成本、分析操作程序、對(duì)實(shí)驗(yàn)室(facility)、設(shè)備和訓(xùn)練有素的人員的要求以及對(duì)CIN的低陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，其對(duì)于預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)并不是理想的。當(dāng)前基于DNA的分析不能區(qū)分LSIL與HSIL，也不區(qū)分CIN病變與非轉(zhuǎn)化潛伏或退化的病毒感染。目前對(duì)于E6/E7 mRNA的基于mRNA的分析與具有更高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的HPV DNA檢測(cè)的敏感度大致相當(dāng)。對(duì)于原位檢測(cè)E6/E7癌蛋白的分析的報(bào)告有限。Longworth, M. S.和 Laimins, L. A. (2004) Pathogenesis of HumanPapillomaviruses in Differentiaing Epithelia (人乳頭瘤病毒在分化的上皮細(xì)胞中的發(fā)病機(jī)理)，Microbiology and Molcular Biology Reviews 68，pp362_372 ;和Tungteakkhun, S. S.和Duerksen-Hughes, P. J. (2008)Cellular Binding Partners of theHuman Papillomavirus E6 Protein (人乳頭瘤病毒E6蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合配體)，Arch.Virol. 153，pp397-408。目前需要的是ー種低成本、簡(jiǎn)便、靈敏、特異性的分析，其可在臨床實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)生辦公室的常規(guī)工作中進(jìn)行并能檢測(cè)早期上皮病變、區(qū)分HSIL與LSIL或預(yù)測(cè)發(fā)展成宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。產(chǎn)生針對(duì)HPV的單克隆抗體的已知方案通常不適于生產(chǎn)抗-HPV單克隆抗體并且不能用于篩選一般人類(lèi)群體的免疫組織化學(xué)診斷測(cè)試。Veress, G.，Konya, J.，Csiky-Meszaros, T. , Czegledy, J. ^PGergely, L. (1994)Human Papillomavirus DNA and Anti-HPVSecretory IgA Antibodies in Cytologically Normal Cervical Specimens (細(xì)胞學(xué)上正常的宮頸樣本中的人乳頭瘤病毒DNA和抗HPV分泌性IgA抗體)，Journal ofMedical Virology 43, pp201_207 ；Sun, Y. , Shan, K. V. , Muller, M. , Munoz, N. , Bosch, X.F.和 Viscidi，P.P. (1994)Comparison of Peptide Enzyme-Linked Tmmuni sorbentAssay ana Radioimmunoprecipitation Assay with In Vitro-Translated Proteinsfor Detecti on fo Seruym Antibodies to Human Papillomavirus Type 16 E6 andE7 Proteins (用體外翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)行肽酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和放射免疫沉淀分析的比較，以檢測(cè)針對(duì)人乳頭瘤病毒16 E6和E7型蛋白質(zhì)的血清抗體)，Journal of ClinicalMicrobiology 1994, pp2216_2220 ；Meschede,ff. ,Zumbach, K. , Braspenning, J. , Scheffner, M. , Benitez-Bribiesca, L. , Luande, J. , Gissmann, L.和 Pawlita，M. (1998) Antibodiesagainst Early Protein of Human Papillomaviruses as Diagnostic Markers forInvasive Cervical Cancer (抗人乳頭瘤病毒早期蛋白的抗體作為浸潤(rùn)性宮頸癌的診斷標(biāo)記)，Journal of Clinical Microbiology, 475-480 ；Sehr,P. , Zymbach, K.和Pawlita, M. (2001)A Generic Capture ELISA for Recombinant Proteins Fused toGlutathione S-Transferase: Val idation for HPV Serology (與谷胱甘妝 S_ 轉(zhuǎn)移酶融合的重組蛋白質(zhì)的通用捕獲ELISA :HPV血清學(xué)的確認(rèn))，Journal of ImmunologicalMethods 253, 153-162 ；Matlashewski, G. , Banks, L. , ffu-Liao, J. , Spence, P. , Pim, D.和Crawford, L. (1986)The Expression of Human Papillomavirus Type 18 E6 Protin inBacteria and the Production of Anti_E6 Antibodies (人乳頭瘤病毒 18 E6型蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的表達(dá)和抗E6抗體的生產(chǎn))，J. Gen. Virol. 67，1909-1916。這可能反映在用變性劑處理后使用再折疊的重組蛋白作為免疫原，以生產(chǎn)抗體。這種抗體與感染的人細(xì)胞產(chǎn)生的天然構(gòu)象HPV蛋白質(zhì)呈現(xiàn)的表位反應(yīng)較差。另外，現(xiàn)有技術(shù)抗體識(shí)別的表位可以通過(guò)涉及臨床樣本的取樣、固定和儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)改變。通過(guò)ELISA (酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))檢測(cè)HPV有關(guān)抗體或病毒蛋白質(zhì)在人對(duì)象中的存在的其它嘗試也通常導(dǎo)致極其低的分析靈敏性，因 而不能發(fā)展成商業(yè)適用的診斷測(cè)試。大部分此類(lèi)ELISA分析靶向單一病毒蛋白質(zhì)或短肽片段，其不能與人對(duì)象的抗體有良好的相互作用或牢固并特異性地與之結(jié)合。此類(lèi)分析的特異性和靈敏性非常低，以至于即使使用來(lái)自確診患有HPV有關(guān)的浸潤(rùn)性宮頸癌的患者的樣品，也只發(fā)現(xiàn)53%的患者樣品對(duì)HPV感染呈陽(yáng)性。Nindl, I. , Benitez-Bribiesca, L. , Berumen, J. , N, F. , Fisher, S. , Gross, G. , Lopez—Carilio, L. , Muller, M. , Tommasino, M. , Vazquez-Curiel, A.和 Gissmann, L. (1994)Antibodies against Linear and ConformationalEpitopes of the Human Papillomavirus (HPV)Type 16 E6 and E7 Oncoproteins inSera of Cervical Cancer Patients (抵抗人乳頭瘤病毒(HPV) 16 E6和E7型癌蛋白在宮頸癌患者血清中的線性和構(gòu)象表位的抗體)，Arch. Virol. 137，341-353?？紤]到測(cè)試群體來(lái)自一般篩查，具有或沒(méi)有低級(jí)或癌前病變，分析的靈敏性將太低而不能用于臨床實(shí)踐。因此，目前并無(wú)成功的ELISA分析可作為臨床樣品的診斷工具。在100種以上的HPV突變體或菌株中，只有約15種與高風(fēng)險(xiǎn)的CIN或?qū)m頸癌風(fēng)險(xiǎn)有夫。同樣地，約70%的宮頸癌病例和50%的CIN2和CIN3病例歸于高風(fēng)險(xiǎn)HPV 16型和HPV 18型感染。然而，一些進(jìn)行性宮頸癌病例與低風(fēng)險(xiǎn)HPV型感染有關(guān)，而感染某些HPV型并不會(huì)發(fā)展為宮頸癌。鑒定那些HPV感染并監(jiān)測(cè)其特定癌基因蛋白質(zhì)的表達(dá)而不是僅僅鑒定高風(fēng)險(xiǎn)型(ー種或多種)的HPV感染是重要的。因此，需要檢測(cè)作為宮頸癌的生物標(biāo)記的HPV癌蛋白，以更好地鑒定發(fā)展成HSIL、其他癌前病變或確定的宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。需要發(fā)展適當(dāng)?shù)姆治?，如HPV免疫測(cè)定，來(lái)檢測(cè)這種HPV癌蛋白或?qū)m頸癌的生物標(biāo)記。E6/E7癌蛋白在CIN2和CIN3病變中的存在可以提供證據(jù)，表明發(fā)展的高風(fēng)險(xiǎn)。然而，現(xiàn)有技術(shù)抗體僅具有用于原位檢測(cè)E6/E7癌蛋白的有限效用。M. S.和Laimins，L.A. (2004)Pathogenesis of Human Papillomaviruses in Differentiaing Epitnelia、人乳頭瘤病毒在分化的上皮細(xì)胞中的發(fā)病機(jī)理)，Microbiology and Molecular Biology Reviews68，pp362_372 ;和 Tungteakkhun, S. S. Duerksen-Hughes, P. J. (2008) Cellular BindingPartners of the Human Papillomavirus E6 Protein (人乳頭瘤病毒 E6 蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合配體)，Arch. Virol. 153，pp397_408。因此，需要開(kāi)發(fā)抗體及免疫分析，用于檢測(cè)作為宮頸癌的生物標(biāo)記的HPV癌蛋白，以確定HSIL或S CIN2 (CIN2及以上)，或其他癌前病變，以用于篩選侵入性子宮頸癌和/或評(píng)估惡性腫瘤轉(zhuǎn)化為宮頸癌和與HPV有關(guān)的癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方式提供方法、單克隆抗體、多克隆抗體、分析和試劑盒，來(lái)檢測(cè)HPV感染和HPV相關(guān)的癌癥診斷、篩查，包括各種HPV基因型的感染、早期和/或晚期HPV有關(guān)的或HPV特異的癌癥?？?HPV抗體被用于對(duì)臨床樣品進(jìn)行HPV高通量分析。也提供用于檢測(cè)HPV感染、宮頸癌、其它HPV相關(guān)的癌癥、早期癌前病變以及晩期癌發(fā)展的各種免疫分析和試劑盒。公開(kāi)了量化臨床樣品中HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。該方法包括獲得臨床樣品的過(guò)程，所述臨床樣品包括易被HPV感染的細(xì)胞群體。該方法還可以包括將臨床樣品沉積到容器中的過(guò)程以及使臨床樣品與特異性結(jié)合由HPV感染細(xì)胞表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)的初次抗體接觸的過(guò)程，接觸的條件是促進(jìn)初次抗體與由細(xì)胞群體表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。該 方法還可以包括量化初次抗體的特異性結(jié)合的過(guò)程，從而量化臨床樣品中的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，臨床樣品可以任選地包括分散在收集液體中的細(xì)胞。在這些實(shí)施方式中的這種臨床樣品還可以任選地包括固定的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，方法可以任選地包括測(cè)量臨床樣品的細(xì)胞密度的過(guò)程，并且，臨床樣品的細(xì)胞密度可任選地被標(biāo)準(zhǔn)化。在一些實(shí)施方式中，方法可以任選地包括使臨床樣品與基質(zhì)接觸的過(guò)程，所述基質(zhì)選擇膜、珠和微量孔表面。在一些實(shí)施方式中，方法可以任選地包括將HPV蛋白質(zhì)表達(dá)化到預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值的過(guò)程。這種量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程可以任選地包括根據(jù)臨床樣品中存在的細(xì)胞數(shù)目使量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。這種量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程還可以任選地包括比較量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)與HPV蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。這種量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程還可以任選地使預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值與臨床樣品中的癌癥相關(guān)聯(lián)，和任選地使預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值與臨床樣品中的轉(zhuǎn)化病理期相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)測(cè)量包括診斷的腫瘤的臨床樣品中的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平來(lái)確定預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值。在一些實(shí)施方式中，臨床樣品可以任選地包括獲自宮頸拭子(swab)或?qū)m頸刮片(scrape)的細(xì)胞。臨床樣品還可以任選地包括獲自口腔拭子、口腔刮片、肛門(mén)拭子或肛門(mén)刮片的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，HPV可以選自 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 39、HPV 45、HPV 52和HPV 5。在一些實(shí)施方式中，特異地結(jié)合由ー種以上HPV編碼的ー種以上HPV蛋白質(zhì)的初次抗體可以選自 HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 39、HPV45、HPV 52 和 HPV58。在一些實(shí)施方式中，HPV蛋白質(zhì)可以選自HPV E6蛋白質(zhì)和HPV E7蛋白質(zhì)。在ー些實(shí)施方式中，初次抗體可以特異地結(jié)合HPV E6蛋白質(zhì)和HPV E7蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，臨床樣品可以沉積到容器中，所述容器是微量滴定板的樣品孔。在一些實(shí)施方式中，量化臨床樣品中HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的方法可以任選地進(jìn)ー步包括使臨床樣品與標(biāo)記的二次抗體接觸的過(guò)程，所述標(biāo)記的二次抗體特異地結(jié)合初次抗體。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記的二次抗體可以選自直接標(biāo)記或間接標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，初次抗體可以任選地包含標(biāo)記。這種標(biāo)記可以選自直接標(biāo)記或間接標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程可以包括量化由酶標(biāo)記產(chǎn)生的生色基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程還可以包括量化熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，量化HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的過(guò)程可以包括根據(jù)量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)評(píng)估臨床樣品中HPV相關(guān)癌癥疾病等級(jí)的過(guò)程。這種HPV相關(guān)癌癥可以任選地是宮頸
癌。 附圖簡(jiǎn)述為使本發(fā)明上述特征的方式可以被詳細(xì)地理解，可以通過(guò)參考實(shí)施方式對(duì)上面筒述的本發(fā)明進(jìn)行更具體的描述，所述實(shí)施方式中的一些圖解在附圖中。然而，注意到附圖僅說(shuō)明ー些實(shí)施方式中的典型實(shí)施方式，因此不應(yīng)該被認(rèn)為限制其范圍，因?yàn)楸景l(fā)明可以允許其它等效的實(shí)施方式。圖IA提供根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式純化自His-標(biāo)簽Ni-NTA柱的重組E7蛋白質(zhì)的示例性凝膠圖像。圖IB提供純化自GST-標(biāo)簽柱的重組E7蛋白質(zhì)的示例性凝膠圖像。圖IC提供純化自His-標(biāo)簽Ni-NTA柱的重組E6蛋白質(zhì)的示例性凝膠圖像。圖2A提供示例性蛋白質(zhì)印跡圖像，其圖解利用多克隆抗-HPV 16 E7抗體和多克隆抗HPV 18 E7抗體在來(lái)自宮頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中檢測(cè)HPV 16 E7重組蛋白質(zhì)、HPV 18 E7重組蛋白質(zhì)和HPV E7癌蛋白。圖2B提供示例性蛋白質(zhì)印跡圖像，其圖解利用多克隆抗-HPV 16 E6抗體在來(lái)自宮頸組織的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中檢測(cè)HPV 16 E6和HPV 18 E6重組蛋白質(zhì)以及HPVE6癌蛋白。圖3圖解來(lái)自各種雜交瘤克隆(細(xì)胞系I到14)的抗-HPV E6、抗-HPV E7和抗-HPV LI抗體與根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的圖例中標(biāo)記的各種雜HPV蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)。6xHi s被用作陰性對(duì)照。圖4A提供示例性ELISA結(jié)果，其利用小鼠單克隆抗_HPV E6抗體來(lái)檢測(cè)各種HPV型的各種HPV蛋白質(zhì)。圖4B提供示例性蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其利用涉及各種細(xì)胞系的小鼠單克隆抗-HPV18E6抗體。圖4C提供示例性ELISA結(jié)果，其利用小鼠單克隆抗_HPV E7抗體來(lái)檢測(cè)各種HPV型的各種HPV蛋白質(zhì)。圖4D提供示例性蛋白質(zhì)印跡結(jié)果，其利用涉及各種細(xì)胞系的小鼠單克隆抗-HPVE7抗體。圖5A提供HPV18 E6重組蛋白質(zhì)和HPV16 E6重組蛋白質(zhì)的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其通過(guò)比色法利用小鼠單克隆抗-E6抗體。圖5B提供HPV18 E6蛋白質(zhì)與各種稀釋度的單克隆抗-E6抗體的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其利用發(fā)光方法。圖5C提供HPV16 E6蛋白質(zhì)的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，該HPV16 E6蛋白質(zhì)通過(guò)小鼠單克隆抗_E6抗體利用發(fā)光方法進(jìn)行檢測(cè)。圖提供HPV18 E7和HPV16 E7重組蛋白質(zhì)的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其通過(guò)比色法利用單克隆抗-E7抗體。圖5E提供HPV18 E7重組蛋白質(zhì)與各種稀釋度的單克隆抗_E7抗體的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其利用發(fā)光方法。圖5F提供HPV16 E7重組蛋白質(zhì)的示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線，該HPV16 E7重組蛋白質(zhì)通過(guò)抗-E7抗體利用發(fā)光方法進(jìn)行檢測(cè)。圖6A提供在抗-HPV E7抗體存在和不存在的情況下示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其顯示HPV全細(xì)胞ELISA對(duì)宮頸癌細(xì)胞系的平均吸光度。
圖6B提供在抗-HPV E7抗體存在和不存在的情況下示例性宮頸癌細(xì)胞系的全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其顯示圖6A的平均吸光度，并被標(biāo)準(zhǔn)化成HPV陽(yáng)性海拉細(xì)胞和HPV陰性C33a細(xì)胞的每細(xì)胞的密度。圖6C提供利用抗-HPV E7抗體和比色吸光度檢測(cè)方法進(jìn)行全細(xì)胞ELISA時(shí)HPV陽(yáng)性海拉細(xì)胞和HPV陰性C33a細(xì)胞的示例性滴定曲線。圖6D圖解根據(jù)圖6C HPV陽(yáng)性海拉細(xì)胞和HPV陰性C33a細(xì)胞的滴定曲線的標(biāo)準(zhǔn)化的每細(xì)胞密度。圖6E提供示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其顯示基于細(xì)胞的ELISA試驗(yàn)的吸光度，所述ELISA試驗(yàn)利用小鼠單克隆抗-HPV E6抗體檢測(cè)臨床癌癥樣品、HPV陽(yáng)性海拉細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中而不是HPV陰性C33a細(xì)胞中存在的HPV E6癌蛋白。圖7A提供通過(guò)比色法利用單克隆抗-E6抗體的HPV18 E6重組蛋白質(zhì)示例性標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7B提供HPV全細(xì)胞ELISA結(jié)果的示例性柱形圖，其利用圖7A中使用的相同單克隆抗-E6抗體來(lái)檢測(cè)總計(jì)355個(gè)臨床細(xì)胞學(xué)樣品的臨床樣品中存在的HPVE6癌蛋白。圖7C顯示盲法試驗(yàn)(blind study)的結(jié)果，該盲法試驗(yàn)以利用圖7A和7B中使用的相同單克隆抗-HPV E6單克隆抗體在HPV全細(xì)胞ELISA上測(cè)試的38例臨床樣品進(jìn)行。圖8A提供示例性直方圖，其顯示圖7B中所示總計(jì)355例臨床樣品中每ー個(gè)的單獨(dú)吸收強(qiáng)度。圖8B提供從圖8A和7B所示的相同的355個(gè)細(xì)胞學(xué)樣品分析的ROC曲線的示例
性概要。圖9A提供顯示為細(xì)胞系的吸收強(qiáng)度的示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其利用抗-@肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)P -肌動(dòng)蛋白在HPV陽(yáng)性細(xì)胞系Hela和HPV陰性細(xì)胞系C33a中的表達(dá)水平。圖9B提供顯示為7500個(gè)海拉細(xì)胞和7500個(gè)HT3細(xì)胞的吸收強(qiáng)度的示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其利用抗-HPV E6抗體和抗-P肌動(dòng)蛋白。圖9C提供顯示為7500個(gè)海拉細(xì)胞和7500個(gè)HT3細(xì)胞的吸收強(qiáng)度的比的示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其利用抗-HPV E6抗體和抗-P肌動(dòng)蛋白抗體。P _肌動(dòng)蛋白被用作參考，用于標(biāo)準(zhǔn)化常常含有不同細(xì)胞數(shù)目的臨床樣品的信號(hào)強(qiáng)度。圖IOA提供顯示為吸收強(qiáng)度的示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其利用抗_HPV E6抗體篩查16個(gè)臨床樣品。
圖IOB提供顯示為吸收強(qiáng)度比的示例性全細(xì)胞ELISA結(jié)果，其利用相同的小鼠抗-HPV E6和抗-P -肌動(dòng)蛋白單克隆抗體來(lái)篩查圖IOA中測(cè)試的相同的16個(gè)臨床樣品。與具有不同細(xì)胞量的樣品相關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度根據(jù)利用杭-￠-肌動(dòng)蛋白抗體獲得的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

圖11是流程圖，圖解根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的方法的實(shí)例。發(fā)明詳述乳頭瘤病毒是DNA病毒,其具有DNA基因組、無(wú)包被病毒體和二十面體外殼。該雙鏈環(huán)狀HPV DNA基因組包含一個(gè)晚期基因編碼區(qū)、ー個(gè)早期基因編碼區(qū)和非編碼上游調(diào)控區(qū)，其具有控制早期和晩期基因表達(dá)的各種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。晩期基因編碼區(qū)中的兩個(gè)單獨(dú)的開(kāi)放閱讀框編碼病毒殼體蛋白LI和L2。這兩個(gè)病毒殼體蛋白屬于同一類(lèi)，其中殼體蛋白LI為主要的殼體蛋白，其在不同的HPV型中高度保守。早期基因編碼區(qū)中的8個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼8個(gè)早期病毒蛋白質(zhì)，其被命名為E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7和E8。早期蛋 白E6和E7是癌蛋白，其對(duì)于宿主細(xì)胞無(wú)限増殖化和轉(zhuǎn)化以及對(duì)于長(zhǎng)期的病毒復(fù)制和存活至關(guān)重要。被高風(fēng)險(xiǎn)HPV感染需要兩個(gè)早期病毒蛋白質(zhì)——E6和E7，它們是癌蛋白，因?yàn)樗鼈冊(cè)隗w外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并且需要它們的存在來(lái)維持惡性。在癌前或癌癥宮頸組織中抑制E6和E7表達(dá)阻斷浸潤(rùn)性癌發(fā)展。在宿主組織中，E6和E7癌蛋白通過(guò)分別消極阻斷內(nèi)源性宿主細(xì)胞調(diào)控蛋白P53和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)腫瘤抑制蛋白的活性來(lái)發(fā)揮作用，以引起導(dǎo)致宮頸癌發(fā)展的凋亡和細(xì)胞周期失調(diào)的抑制。E6癌蛋白結(jié)合p53——保護(hù)細(xì)胞免于DNA損傷和調(diào)控凋亡的細(xì)胞因子，以誘導(dǎo)P53降解。通過(guò)降低p53蛋白質(zhì)的水平，E6癌蛋白防止腫瘤細(xì)胞死亡。E7癌蛋白結(jié)合Rb，以誘導(dǎo)Rb降解、破壞正常的細(xì)胞周期，并引起細(xì)胞増殖。E7癌蛋白通過(guò)其與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制蛋白P21的相互作用進(jìn)ー步破壞細(xì)胞控制。發(fā)現(xiàn)HPV E6和E7癌蛋白在轉(zhuǎn)化的生殖組織中被持續(xù)地產(chǎn)生。這些相互作用設(shè)置控制宿主細(xì)胞増殖和分化(即，轉(zhuǎn)化)的階段，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變成前贅生物細(xì)胞和最終轉(zhuǎn)變成癌癥惡性腫瘤的完全表達(dá)的第一步驟。似乎在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮作用的ー個(gè)另外的事件(event)是將HPV DNA整合至宿主基因組中，這常常破壞E2的開(kāi)放閱讀框，造成E6和E7癌蛋白過(guò)度表達(dá)，并可能導(dǎo)致宿主基因組不穩(wěn)定。額外的輔因子和突變事件在浸潤(rùn)性宮頸癌的發(fā)病機(jī)理中可能是重要的，其可以包括染色體重排、組成型雜合性缺失和原癌基因失活。HPV-16和HPV-18均顯示使培養(yǎng)中的人角質(zhì)形成細(xì)胞永生，并且，目前為止，它們是誘導(dǎo)浸潤(rùn)性宮頸癌的最常見(jiàn)的高風(fēng)險(xiǎn)HPV型。HPV-16型單獨(dú)感染伴隨超過(guò)50%的宮頸癌病例，大部分導(dǎo)致鱗狀細(xì)胞癌。HPV-18感染更可能誘發(fā)腺癌。ー些研究已經(jīng)指出，宮頸組織中的腺癌產(chǎn)生更侵襲形式的癌癥，其結(jié)果比鱗狀細(xì)胞癌導(dǎo)致的癌癥更不利。這表明，被HPV-18感染的個(gè)體的預(yù)后可能比任何其它形式的HPV感染差得多。在美國(guó)，大部分帕氏試驗(yàn)結(jié)果是正常的，然而，毎年發(fā)現(xiàn)約400-500萬(wàn)例異常帕氏試驗(yàn)結(jié)果。大部分異常結(jié)果是輕度異常(ASC-US，典型地，帕氏試驗(yàn)結(jié)果的2-5%)或LSIL(結(jié)果的約2%)，表明HPV感染。雖然大部分低級(jí)宮頸發(fā)育異常自動(dòng)退化而不導(dǎo)致宮頸癌，但發(fā)育異?？捎米餍枰岣呔璧恼髡?。CINl是最常見(jiàn)和最良性形式的宮頸上皮內(nèi)瘤形成，其通常會(huì)在兩年內(nèi)自動(dòng)分解。正因如此，LSIL結(jié)果可用簡(jiǎn)單的“觀望和等待”的理念來(lái)處理。然而，因有12-16%的機(jī)會(huì)發(fā)展成更嚴(yán)重發(fā)育異常，醫(yī)生可能希望通過(guò)陰道鏡檢查用活組織檢查來(lái)更侵襲性地追蹤結(jié)果。如果發(fā)育異常發(fā)展，則治療可能是必要的。因此，提供HPVE6E7 ICC分析和帕氏涂片試驗(yàn)以原位檢測(cè)HPV癌蛋白是有用的，特別有助于在ASC-US或LSIL或CINl患者中檢測(cè)高級(jí)發(fā)育異常細(xì)胞以及鑒定潛在的CIN2或以上的那些患者，其可受益于立即干預(yù)并避免“等待和觀望”伴隨的焦慮。高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變或HSIL或HGSIL表明中度或重度原位子宮頸上皮內(nèi)瘤形成或原位癌。其通常在帕氏試驗(yàn)后確診。在一些情況下，若不適當(dāng)追蹤，這些病變會(huì)導(dǎo)致浸潤(rùn)性宮頸癌。HGSIL并不意味著存在癌癥。在所有具有HGSIL結(jié)果的女性中，2%或更少在當(dāng)時(shí)患有浸潤(rùn)性宮頸癌，然而，約20%在不治療的情況下會(huì)發(fā)展成患上浸潤(rùn)性宮頸癌。為了抗擊這種發(fā)展，HGSIL通常伴隨立即用活組織檢查進(jìn)行陰道鏡檢查來(lái)取樣或去除發(fā)育異常的組織。將該組織發(fā)送病理學(xué)測(cè)試，以指定比帕氏涂片試驗(yàn)更確定的組織學(xué)分類(lèi)。HGSIL通常與CIN2或CIN3的組織學(xué)分類(lèi)相對(duì)應(yīng)。因此，提供HPV E6E7 IHC分析與HE (蘇木精和伊紅染色)或HPVE6E7 ICC分析與帕氏試驗(yàn)對(duì)于原位檢測(cè)HPV E6E7癌蛋白是有幫助的，尤其有助于鑒定CIN2/CIN3患者。 本發(fā)明的實(shí)施方式提供各種免疫測(cè)定和抵抗作為生物標(biāo)記的HPV癌蛋白的單克隆抗體，以便，例如來(lái)自被高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)HPV型感染的高級(jí)發(fā)育異常細(xì)胞的E6、E7癌蛋白的過(guò)度表達(dá)可以通過(guò)ー種或多種抗體進(jìn)行檢測(cè)。各個(gè)實(shí)施方式提供HPV全細(xì)胞免疫測(cè)定，其檢測(cè)HPV癌蛋白在宮頸細(xì)胞中的存在或存在的量，以在不使用侵襲性手術(shù)的情況下鑒定患有高級(jí)或癌前病變的患者。在一些實(shí)施方式中，ー種或多種抗體與生物樣品中存在的一種或多種乳頭瘤病毒類(lèi)型的ー種或多種蛋白質(zhì)的結(jié)合可以在顯微鏡下檢查，檢測(cè)與標(biāo)記的ー種或多種抗體反應(yīng)的劑的存在，其中劑包括顯色劑、熒光色原及其組合。生物樣品可以包括宮頸細(xì)胞、宮頸組織、宮頸拭子、體液、血清、血液、腫瘤、細(xì)胞培養(yǎng)物、活體解剖物(biopsies)及其組合。生物樣品可來(lái)自由于異常帕氏試驗(yàn)結(jié)果而介紹的一組人或來(lái)自作為進(jìn)行宮頸癌常規(guī)篩查的普通群體的ー組人。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，篩查人對(duì)象乳頭瘤病毒感染的方法可以通過(guò)對(duì)包含人細(xì)胞薄層的微量滴定板的固相進(jìn)行全細(xì)胞免疫分析而執(zhí)行，以從細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)微量滴定板上的生物樣品中存在的一種或多種乳頭瘤病毒類(lèi)型的一種或多種乳頭瘤病毒蛋白。薄層是單層宮頸細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，可以對(duì)包含臨床細(xì)胞學(xué)樣品薄層的微量滴定板進(jìn)行ー種或多種全細(xì)胞免疫測(cè)定，以使人細(xì)胞與ー種或多種抗體結(jié)合，所述抗體針對(duì)ー種或多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白而產(chǎn)生或針對(duì)ー種或多種被HPV感染侵襲的細(xì)胞蛋白質(zhì)而產(chǎn)生，至少ー種抗體能夠識(shí)別乳頭瘤病毒癌蛋白，以檢測(cè)微量滴定板表面上的臨床細(xì)胞學(xué)樣品薄層中存在的一種或多種乳頭瘤病毒類(lèi)型的ー種或多種蛋白質(zhì)。乳頭瘤病毒癌蛋白包括但不限于HPV-16 E6蛋白質(zhì)、HPV-16E7蛋白質(zhì)、HPV-18 E6蛋白質(zhì)、HPV-18 E7蛋白質(zhì)及其組合。細(xì)胞蛋白質(zhì)包括但不限于pl6INK4a、pRB、p53、E2F、E2F活化的細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶、⑶K4、⑶K6、Ki-67 (MIB-I)、MYC蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白_A、細(xì)胞周期蛋白-B、細(xì)胞周期蛋白-E、端粒-TERC、MCM2、T0P2A、熱休克蛋白40 (HSP4q)、熱休克蛋白60 (HSP60)、熱休克蛋白 70 (HSP7tl)、CA9/MN、層粘連蛋白 5、brn_3a、CDK N2、拓?fù)洚悩?gòu)酶 2A、微粒體維持蛋白-2、微粒體維持蛋白_4、微粒體維持蛋白-5、存活蛋白、VEGF、p27(kipl)和p21 (waf)。本發(fā)明的實(shí)施方式提供各種免疫測(cè)定和針對(duì)HPV病毒蛋白質(zhì)的單克隆抗體，以便由最高風(fēng)險(xiǎn)HPV型的感染可以被單一單克隆抗體和/或通用全抗體檢測(cè)到。本發(fā)明提供HPV細(xì)胞基ELISA分析，以高通量形式檢測(cè)HPV蛋白質(zhì)的存在。檢測(cè)人對(duì)象中乳頭瘤病毒的方法包括進(jìn)行ー種或多種免疫分析，如對(duì)被加工成形態(tài)上異常和正常的人細(xì)胞混合物的人對(duì)象臨床樣品進(jìn)行的基于細(xì)胞的ELISA。生物樣品可以包含獲自ー種或多種如下材料的細(xì)胞宮頸組織、宮頸拭子、體液、血清、血液、腫瘤、細(xì)胞培養(yǎng)物、活體解剖物及其組合。生物樣品可以獲自作為進(jìn)行宮頸癌常規(guī)篩查的普通群體的一群人。在一個(gè)確定的實(shí)施方式中，本發(fā)明的自動(dòng)化高通量HPV細(xì)胞基ELISA可用于一般篩查HPV感染和早期診斷宮頸癌和其它癌癥、精確檢測(cè)浸潤(rùn)性宮頸癌、檢測(cè)其它HPV相關(guān)的癌癥、早期癌前病變以及晩期癌發(fā)展。提供針對(duì)HPV蛋白質(zhì)的各種新單克隆抗體，其作為
生物標(biāo)記是有用的，并且，其對(duì)于檢測(cè)HPV病毒蛋白質(zhì)、HPV癌蛋白、早期篩查宮頸癌和診斷CIN和/或浸潤(rùn)性宮頸癌和其它癌癥是有用的工具。臨床樣品中存在的一種或多種乳頭瘤病毒類(lèi)型的一種或多種乳頭瘤病毒蛋白可以通過(guò)針對(duì)ー種或多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白而產(chǎn)生的一種或多種標(biāo)記的抗體被檢測(cè)。ー種或多種抗體可以用在本領(lǐng)域中適于檢測(cè)的不同劑進(jìn)行標(biāo)記，其中所述劑可以包括顯色劑、化學(xué)發(fā)光劑、熒光色原及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，ー種或多種抗體中的至少ー種抗體能夠識(shí)別乳頭瘤病毒早期蛋白。乳頭瘤病毒早期蛋白可以是，例如HPV-16 E6蛋白質(zhì)、HPV-16 E7蛋白質(zhì)、HPV-18 E6蛋白質(zhì)、HPV-18 E7蛋白質(zhì)及其組合。根據(jù)某些實(shí)施方式，人細(xì)胞的混合物可以自液基溶液施加到微量滴定板。在微量培養(yǎng)板之前，細(xì)胞混合物可以通過(guò)不同的孔尺寸進(jìn)行過(guò)濾，以分開(kāi)混合物中的宮頸細(xì)胞和其它細(xì)胞。細(xì)胞也可以通過(guò)梯度溶液被離心，以從收集的混合物中獲得宮頸細(xì)胞。微量滴定板的表面可以是玻璃或塑料表面，其用劑進(jìn)行處理，以保持細(xì)胞粘附在表面上。微量滴定板的表面還可以包括膜基濾器，以允許將宮頸細(xì)胞與不必要的血細(xì)胞、黏液、碎片等分開(kāi)。膜的孔尺寸范圍可以為5微米到10微米。可以用劑預(yù)處理膜，以允許宮頸細(xì)胞粘附在表面上。人細(xì)胞的薄層可以是，例如單層宮頸細(xì)胞。根據(jù)某些實(shí)施方式，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化步驟以標(biāo)準(zhǔn)化微量滴定板每個(gè)孔中測(cè)試的細(xì)胞數(shù)目。例如，可以獲得細(xì)胞含量(cellularity)(=細(xì)胞顆粒物(pellet), ul/樣品溶液，mL),以標(biāo)準(zhǔn)化樣品中的細(xì)胞差異。作為另ー實(shí)例，在全細(xì)胞ELISA分析之后，微量滴定板上的細(xì)胞可以被劑復(fù)染，使核顯色或熒光染色，以量化每個(gè)孔中測(cè)試的細(xì)胞數(shù)目。作為另ー實(shí)例，全細(xì)胞ELISA可以包括使用兩種或更多種抗體,至少ー種用于檢測(cè)HPV癌蛋白和一種用于檢測(cè)一般的細(xì)胞蛋白質(zhì)，例如￠-肌動(dòng)蛋白，作為內(nèi)部対照。這使得能夠標(biāo)準(zhǔn)化患者之間的細(xì)胞數(shù)目，并通過(guò)HPV特異抗體計(jì)算ー個(gè)檢測(cè)中表達(dá)HPV特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞和另一檢測(cè)中復(fù)染的細(xì)胞的比例。兩個(gè)檢測(cè)獲得的比例代表HPV E6E7癌蛋白在異常和正常細(xì)胞混合物中存在的程度。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于細(xì)胞的ELISA的檢測(cè)系統(tǒng)可以包括平板讀取器(platereader)，其能夠吸收可見(jiàn)光、UV光、照度計(jì)、各種波長(zhǎng)以激發(fā)和發(fā)射熒光色素及其組合。在使用具有顯色基質(zhì)的膜基濾器微量滴定板的實(shí)施方式中，沉淀的顯色可以被目測(cè)而不需要使用儀器。這種膜基ELISA也可以與溶液基基質(zhì)一起用于顯色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。在另ー實(shí)施方式中，檢測(cè)系統(tǒng)可以是CCD相機(jī)或其他成像儀以捕獲測(cè)量結(jié)果，其可以利用激光器作為入射輻射源任選地獲得。在某些實(shí)施方式中，也可以對(duì)臨床樣品進(jìn)行細(xì)胞學(xué)帕帕尼科拉烏涂片分析，以比較細(xì)胞學(xué)帕帕尼科拉烏涂片測(cè)試的結(jié)果與ー種或多種免疫組織學(xué)分析的結(jié)果。也可以對(duì)臨床樣品進(jìn)行核酸雜交分析，以檢測(cè)乳頭瘤病毒基因組的存在。各個(gè)實(shí)施方式一般涉及各種方法、檢測(cè)分析、試劑盒、多克隆和單克隆抗體、多肽、重組蛋白質(zhì)和對(duì)檢測(cè)HPV感染有用的核酸，所述HPV感染包括普通的HPV感染以及通過(guò)各種HPV基因型的感染，包括高風(fēng)險(xiǎn)HPV和低風(fēng)險(xiǎn)HPV。提供針對(duì)PVH蛋白質(zhì)的各種新單克隆抗體，其作為生物標(biāo)記是有用的，并且對(duì)于檢測(cè)HPV病毒蛋白質(zhì)、HPV癌蛋白、早期篩查宮頸癌和診斷疾病階段>CIN2或>CIN3是有用的工具。本文描述的工具也可以用于早期臨床篩查HPV感染以及宮頸癌和其它HPV相關(guān)癌癥的一般診斷。在一個(gè)實(shí)施方式中，一種或多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白包括乳頭瘤病毒E6 蛋白質(zhì)、乳頭瘤病毒E7蛋白質(zhì)、乳頭瘤病毒LI蛋白質(zhì)及其組合。重組乳頭瘤病毒蛋白包括但不限于重組HPV-16 E6蛋白質(zhì)、重組HPV-16 E7蛋白質(zhì)、重組HPV-18 E6蛋白質(zhì)、重組HPV-18 E7蛋白質(zhì)和HPV-16 LI蛋白質(zhì)、重組HPV-18L1蛋白質(zhì)及其組合。一些實(shí)施方式提供針對(duì)HPV病毒蛋白質(zhì)的各種單克隆抗體，以便通過(guò)高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)HPV型的感染可以被單一單克隆抗體檢測(cè)到。一些實(shí)施方式也提供HPV非類(lèi)型特異性單克隆抗體，以檢測(cè)ー種或多種HPV類(lèi)型。即，単一抗體可以從ー種以上的病毒類(lèi)型中識(shí)別HPV蛋白質(zhì)。我們將這些稱(chēng)為全特異性抗體。一種或多種乳頭瘤病毒類(lèi)型包括高風(fēng)險(xiǎn)HPV 型、低風(fēng)險(xiǎn) HPV 型、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59 和 HPV-68、HPV-6、HPV-IU HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55 和 HPV-56 及其組合。對(duì)下面的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)的定義闡述如下NILM :惡性腫瘤上皮內(nèi)病變陰性。當(dāng)沒(méi)有瘤形成的細(xì)胞證據(jù)時(shí)，使用NILM ;這可以包括生物體和/或其它非贅生物發(fā)現(xiàn)結(jié)果，如反應(yīng)性/修復(fù)性變化。ASC-US :無(wú)確定意義的非典型鱗狀細(xì)胞。細(xì)胞通常為中等大小或表面鱗狀細(xì)胞，其具有對(duì)于沒(méi)有另外說(shuō)明的LSIL或SIL暗示性而非診斷性的核變化。ASC-H :非典型鱗狀細(xì)胞，不能排除HSIL。細(xì)胞通常是化生細(xì)胞的大小，其可以單獨(dú)或成簇出現(xiàn)，它們對(duì)于HSIL是暗示性而非診斷性的。LSIL :低級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變，包括HPV細(xì)胞病理效應(yīng)/輕度發(fā)育異常/CIN I。HSIL :高級(jí)鱗狀上皮內(nèi)病變，包括中度發(fā)育異常/CIN 2和嚴(yán)重發(fā)育異常/CIS/CIN 3和具有懷疑是浸潤(rùn)性的特征的HSIL。鱗狀細(xì)胞癌(SCC):子宮頸癌，局部浸潤(rùn)到鄰近組織、血管、淋巴管和淋巴結(jié)。在其晩期，它難以治療，并且可以證明是致命的。根據(jù)浸潤(rùn)的階段或程度，浸潤(rùn)性子宮頸癌可以通過(guò)局部切除、子宮切除術(shù)、根治性子宮切除術(shù)、放射線療法和化療來(lái)進(jìn)行治療。腺癌雖然大多數(shù)子宮頸癌來(lái)自構(gòu)成外部皮膚的鱗狀細(xì)胞，但偶爾也有源自黏液生成細(xì)胞的癌癥，所述黏液生成細(xì)胞排列于子宮頸內(nèi)管，其引導(dǎo)進(jìn)入子宮。該腺型被稱(chēng)為“腺癌”而不是“鱗狀細(xì)胞癌”。腺癌難以檢測(cè)。與鱗狀細(xì)胞癌不同，當(dāng)存在時(shí)，腺癌前體難以根據(jù)帕氏涂片被鑒定。鱗狀細(xì)胞發(fā)育異常緩慢發(fā)展成子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，這與腺癌不一樣。本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?yōu)勢(shì)。通過(guò)ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測(cè)HPV相關(guān)抗體在人對(duì)象中的存在的嘗試通常導(dǎo)致極其低的分析靈敏性，因而不能發(fā)展成商業(yè)上適用的診斷測(cè)試。Nindl，I.，Benitez-Brioiesca, L，Berumen, J.，N，F(xiàn).，F(xiàn)isher, S.，Gross, G.，Lopez-Carillo，L，Muller, M.
,Tommasino, M. , Vazquez-Curielj A.和 Gissmann，L (1994)Antibodies against Linearand Conformational Epitopes of the Human Papillomavirus (HPV) Type 16 E6and E7Oncoproteins in Sera of Cervical Cancer Patients (抵抗人乳頭瘤病毒(HPV) 16E6 和E7型癌蛋白在宮頸癌患者血清中的線性和構(gòu)象表位的抗體)，Arch. Virol. 137，341-353。大部分這些ELISA分析靶向單一病毒蛋白質(zhì)或短肽片段，其不能與來(lái)自人對(duì)象的抗體良好地相互作用或與之穩(wěn)固和特異性地結(jié)合。這種分析的特異性和靈敏性如此低，以至于即使使用來(lái)自確認(rèn)患有HPV伴隨的浸潤(rùn)性宮頸癌的患者的樣品，也只發(fā)現(xiàn)53%的患者樣品對(duì)HPV 感染呈陽(yáng)性。因此，沒(méi)有成功的ELISA分析可用作臨床樣品的診斷工具?！?shí)施方式致カ于解決發(fā)展針對(duì)CIN2/3的E6或E7抗體過(guò)程中的三個(gè)挑戰(zhàn)。首先，HPV蛋白質(zhì)為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其少量地存在于臨床樣品中。其次，HPV蛋白質(zhì)的構(gòu)象對(duì)樣品收集過(guò)程敏感。第三，有許多HPV類(lèi)型，每ー個(gè)均具有不同的E6編碼序列。因此，HPV蛋白質(zhì)沒(méi)有從HPV感染的培養(yǎng)細(xì)胞系被成功地大量生產(chǎn)和純化以用作抗體生產(chǎn)的免疫原。針對(duì)少量合成肽或變性的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的已知抗-HPV抗體通常不適合用于臨床診斷，因?yàn)樗鼈儾⒉槐厝慌c天然產(chǎn)生的HPV病毒蛋白質(zhì)在感染的人細(xì)胞中進(jìn)行反座。Veress，G.，Konya, J.，Csiky-Meszarosj T.，Czegledy, J.和 Gergely，L (1994) HumanPapillomavirus DNA and Anti-HPV Secretory IgA Antibodies in CytologicallyNormal Cervical Specimens (細(xì)胞學(xué)上正常的宮頸樣本中的人乳頭瘤病毒DNA和抗HPV 分泌性 IgA 抗體)，Journal of Medical Virology 43，pp201_207 ;Sun，Y.，Shan，K.V，Muller，M.，Munoz，N.，Bosch，X. F.和 Viscidi，P.P. (1994) Comparison of PeptideEnzyme-Linked Immunisorbent Assay and Radioimmunoprecipitation Assay withIn Vitro-Translated Proteins for Detecti on fo Seruym Antibodies to HumanPapillomavirus Type 16 E6 and E7 Proteins (用體外翻譯的蛋白質(zhì)進(jìn)行妝酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和放射免疫沉淀分析的比較，以檢測(cè)針對(duì)人乳頭瘤病毒16 E6和E7型蛋白質(zhì)的血清抗體)，Journal of Clinical Microbiology 1994，pp2216_2220 ;Meschede，W.，Zumbach，K.，Braspenning, J.，Scheffner, M.，Benitez-Bribiesca, L.，Luande, J.，bissmann, L.和 Pawlita，M. (1998)Antibodies against Early Protein of Human Papillomavirusesas Diagnostic Markers for Invasive Cervical Cancer(抗人乳頭瘤病毒早期蛋白的抗體作為浸潤(rùn)性宮頸癌的診斷標(biāo)記)，Journal of Clinical Microbiology, 475-480 ；Sehrj P. , Zymbach, K.和 Pawlita，M. (2001) A Generic Capture ELISA for RecombinantProteins Fused to Glutathione S-Transferase:Validation for HPV Serology(與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合的重組蛋白質(zhì)的通用捕獲ELISA :HPV血清學(xué)的確認(rèn))，Journal ofImmunological Methods 253，153-162 ；Matlashewski, G.，Banks, L，Wu-LiaojJ.，Spence,P., Pirn, D.和Crawford，L (1986)The Expression of Human Papillomavirus Type 18 E6Protin in Bacteria and the Production of Anti_E6 Antibodies (人乳頭瘤病毒 18 E6型蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的表達(dá)和抗E6抗體的生產(chǎn))，J. Gen. Virol. 67，1909-1916。另ー技術(shù)挑戰(zhàn)涉及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，其在自然感染有HPV的人組織中進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋時(shí)發(fā)生。這歸于在臨床相關(guān)樣品中檢測(cè)HPV蛋白質(zhì)的難度。E6癌蛋白包含眾多半胱氨酸氨基酸以及E6癌蛋白的正確拓?fù)鋱D要求形成許多ニ硫鍵的事實(shí)使得生產(chǎn)和原位檢測(cè)這種癌蛋白非常困難。這些因素解釋了這樣ー個(gè)事實(shí)，即從變性的重組蛋白質(zhì)或合成肽產(chǎn)生的可得抗體并不足夠有效，以至于不能可靠地用于體外診斷。此外，還已知利用E6蛋白質(zhì)的小肽的某些免疫分析導(dǎo)致極其低的分析特異性和靈敏性。Nindl, I.，Benitez-Bribiesca, L.，Berumen, J. , N, F. , Fisher, S. , Gross, G. , Lopez—Carilio, L. , Muller, M. , Tommasino, M. , Vazquez-Curiel, A.和 Gissmann, L. (1994)Antibodies against Linear and ConformationalEpitopes of the Human Papillomavirus (HPV) Type 16 E6 and E7 Oncoproteins in Seraof Cervical Cancer Patients (抵抗人乳頭瘤病毒(HPV) 16 E6和E7型癌蛋白在宮頸癌患者血清中的線性和構(gòu)象表位的抗體)，Arch. Virol. 137，341-353。因此，沒(méi)有天然形式的可用E6蛋白質(zhì)，其被純化為免疫原以用于產(chǎn)生能夠檢測(cè)存在于臨床樣品中的病毒癌蛋白的抗-HPV抗體，進(jìn)行體外診斷。 本發(fā)明提供新的病毒癌蛋白測(cè)試方法，其利用新的工具組合，所述工具組合包括新抗體、重組表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)——包括但不限于E6、E7、LI、L2和全細(xì)胞分析。本發(fā)明首先使得全細(xì)胞ELISA能夠檢測(cè)臨床樣品中的細(xì)胞內(nèi)HPV癌蛋白。該全細(xì)胞ELISA能夠在診斷中檢測(cè)作為真正前癌的生物標(biāo)記的HPV癌蛋白以及篩查宮頸癌和其它與HPV有關(guān)的癌癥。重組HPV E6和抗體發(fā)展。E6抗體的發(fā)展因難以獲得E6癌蛋白而受到阻礙，該E6癌蛋白易于聚集。此外，由于產(chǎn)生蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的樣品收集條件，在臨床樣品中難以檢測(cè)E6蛋白質(zhì)。我們已克服了技術(shù)障礙，以產(chǎn)生非變性且可溶形式的HPV E6重組蛋白，并開(kāi)發(fā)出針對(duì)HPV E6癌蛋白的高度特異性抗體。本發(fā)明提供全抗-HPV E6抗體，即能在固定的細(xì)胞中檢測(cè)大部分盛行的高風(fēng)險(xiǎn)HPV型的單ー抗體。相同的方法被用于開(kāi)發(fā)重組HPV E7蛋白質(zhì)和抗體，以獲得全抗-HPV E7抗體。相同的方法也被用于開(kāi)發(fā)重組HPV LI蛋白質(zhì)和重組HPV L2蛋白質(zhì)以及抗體，以獲得全抗-HPV LI和全抗-HPV L2抗體。全細(xì)胞分析方法。我們同時(shí)開(kāi)發(fā)了 IHC和ICC分析，以利用這些抗體類(lèi)型在固定的臨床樣品中檢測(cè)E6、E7和LI蛋白質(zhì)。我們對(duì)宮頸組織和脫落的宮頸細(xì)胞學(xué)樣品進(jìn)行的IHC和ICC研究顯示這些抗體類(lèi)型的有用性，即能夠檢測(cè)臨床樣品中的E6、E7和LI蛋白質(zhì)。為了避免活組織檢查的侵襲性程序，以及避免根據(jù)染色和IHC/HCC結(jié)果對(duì)形態(tài)進(jìn)行解釋的主觀性和可變性，我們開(kāi)發(fā)了基于全細(xì)胞ELISA的客觀平臺(tái)，為宮頸癌篩查提供有力的工具。HPV E6、E7和LI全細(xì)胞ELISA以高通量分析分別客觀地測(cè)量細(xì)胞內(nèi)E6、E7和LI蛋白質(zhì)，井能夠在診斷中檢測(cè)作為真正前癌的生物標(biāo)記的HPV癌蛋白以及篩查宮頸癌和其它與HPV有關(guān)的癌癥。這些分析不需要細(xì)胞裂解，避免在蛋白質(zhì)的萃取過(guò)程中使用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變的洗滌劑，井能直接檢測(cè)宮頸細(xì)胞中的天然E6、E7和LI蛋白質(zhì)。這些分析提供客觀的測(cè)試，以鑒定具有高度前體的患者，從而避免陰道鏡檢查和活組織檢查不必要的侵入程序。這種ELISA形式使用更特異性和臨床相關(guān)的生物標(biāo)記，以提供客觀的、更加靈敏的、有力的和高通量的測(cè)試，其可以自動(dòng)化以適于常規(guī)宮頸癌篩查，并將提供針對(duì)E6、E7和LI蛋白質(zhì)的ニ元(存在或不存在)或半定量測(cè)量。
目前，沒(méi)有商業(yè)可得的、臨床測(cè)量HPV有關(guān)蛋白質(zhì)或抗體的存在的免疫分析。本發(fā)明的實(shí)施方式因此提供診斷工具，其可用于診斷HPV感染、發(fā)育異常和HPV相關(guān)宮頸癌。此夕卜，本文所描述的免疫分析的結(jié)果可用干與針對(duì)P53和RB特別設(shè)計(jì)的、其他商業(yè)可得的免疫分析進(jìn)行比較。已知感染高風(fēng)險(xiǎn)型HPV，如HPV-16和HPV-18會(huì)引起宮頸癌，這是由于E6和E7——誘導(dǎo)宮頸細(xì)胞變?yōu)閻盒阅[瘤和改變/減少宿主細(xì)胞的p53和RB內(nèi)源性蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒癌蛋白——的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙并最終導(dǎo)致癌癥。因此，考慮針對(duì)來(lái)自相同人對(duì)象的臨床樣品，例如宮頸組織、體液、血清等進(jìn)行的、通過(guò)HPV感染而改變的所有這些蛋白質(zhì)水平的分析結(jié)果進(jìn)行比較。圖11圖解根據(jù)本發(fā)明一種或多種實(shí)施方式的方法的實(shí)例。在步驟110中，獲得臨床樣品，其包括易受HPV感染的細(xì)胞群體。臨床樣品是包括來(lái)自活的人對(duì)象的宮頸細(xì)胞、宮頸組織、宮頸拭子、體液、血清、血液、腫瘤、細(xì)胞培養(yǎng)物、活體解剖物及其組合的樣品。臨床樣品可以獲自由于異常帕氏試驗(yàn)結(jié)果而參照的一組人或作為進(jìn)行宮頸癌常規(guī)篩查的普通群體的ー組人。
在步驟120中，臨床樣品被分散在收集液體中。作為對(duì)ELISA板的全細(xì)胞免疫測(cè)定的實(shí)例，來(lái)自宮頸刮片的細(xì)胞直接涂抹在微量滴定板的孔表面上，以進(jìn)行物鏡測(cè)量。作為另ー實(shí)例，宮頸細(xì)胞被收集到液基溶液中井根據(jù)生產(chǎn)商的指示進(jìn)行處理。在步驟130中，臨床樣品被沉積到各器中，以將細(xì)胞固定化到固體表面上。通過(guò)液基溶液收集的臨床樣品根據(jù)生產(chǎn)商的指示進(jìn)行處理。細(xì)胞薄層被鋪在微量滴定板的孔或被涂覆或處理以適于結(jié)合的其它類(lèi)型表面諸如玻璃或塑料表面上，例如被處理以使細(xì)胞結(jié)合的塑料表面或被處理以使蛋白質(zhì)結(jié)合的塑料表面；附著薄膜層的玻璃或塑料表面。表面也可以是珠的形式，以最小化接觸面積。將每個(gè)樣品載入到単獨(dú)容器中。組合多個(gè)容器以形成如微量滴定板的形式，以用于高通量方法。細(xì)胞經(jīng)固化后固定，接著進(jìn)行抗原修復(fù)、阻斷，用本發(fā)明的不同抗-HPV抗體進(jìn)行溫育。在步驟140中，獲得初次抗體(抗-HPV抗體)，其特異地結(jié)合由HPV感染細(xì)胞表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)?？?HPV抗體可以直接標(biāo)記有檢測(cè)劑或可以通過(guò)標(biāo)記有檢測(cè)劑的二次抗體被間接檢測(cè)到。含有HPV蛋白質(zhì)的、微量滴定板上的細(xì)胞將在溶液中與抗-HPV抗體結(jié)合。未結(jié)合的抗-HPV抗體將通過(guò)洗滌被去除，并且，具有標(biāo)記結(jié)合物的二次抗體和合適的基質(zhì)將相繼被加入，以通過(guò)平板讀取器進(jìn)行分析。在步驟150中，利用特異性結(jié)合HPV蛋白質(zhì)的初次抗體針對(duì)臨床樣品進(jìn)行ー種或多種免疫分析，所述HPV蛋白質(zhì)由HPV感染細(xì)胞表達(dá)。未結(jié)合的抗-HPV抗體將通過(guò)洗滌被去除，并且，具有標(biāo)記結(jié)合物的二次抗體和合適的基質(zhì)將相繼被加入，以通過(guò)平板讀取器進(jìn)行分析。作為實(shí)例，抗-HPV抗體可直接用生物素標(biāo)記，或可以被標(biāo)記有HRP或生物素或隨著用作基質(zhì)的適當(dāng)?shù)膭┍粰z測(cè)到的其它劑的二次抗體檢測(cè)到，或者可以標(biāo)記熒光原(fIuorochromogen),以被適當(dāng)?shù)淖x取器直接檢測(cè)到。前-抗體封閉溶液可以包含某些蛋白質(zhì)或BSA或血清或其它劑，以阻斷細(xì)胞與抗體非特異性結(jié)合。后封閉溶液可以包含與前-杭體封閉溶液相似的溶液，其具有較少的蛋白質(zhì)或血清，與初級(jí)抗體一起進(jìn)行溫育。含有HPV抗體的溶液，可為濃縮的形式或稀釋的形式，作為即用型試劑。含有次級(jí)抗體的溶液，可為濃縮的形式或稀釋的形式，作為即用型試劑。在步驟160中，檢測(cè)到與臨床樣品中表達(dá)的初次抗體特異性結(jié)合的HPV蛋白，測(cè)量并量化所述HPV蛋白的量。適于讀取代表抗體與樣品中的目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的信號(hào)強(qiáng)度的基質(zhì)被加入到樣品中，以量化樣品中表達(dá)的蛋白質(zhì)。作為實(shí)例，對(duì)于顯色技木，TMB ELISA基質(zhì)或其等同物被用于檢測(cè)源于抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶活性。將TMB加入到樣品后，它產(chǎn)生藍(lán)色，藍(lán)色在加入酸性終止液(最大吸光度在450nm)后變成黃色。利用顯色平板讀取器讀取信號(hào)強(qiáng)度。作為另ー實(shí)例，對(duì)于化學(xué)發(fā)光技術(shù)，商業(yè)上可得的化學(xué)發(fā)光基質(zhì)被用于檢測(cè)源于抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶活性。將基質(zhì)加入到樣品后，利用化學(xué)發(fā)光平板讀取器讀取化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。作為再ー個(gè)實(shí)例，對(duì)于熒光技術(shù)，商業(yè)上可得的熒光基質(zhì)被用于檢測(cè)源于抗體與蛋白質(zhì)的結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶活性。將基質(zhì)加入到樣品后，利用熒光平板讀取器讀取熒光強(qiáng)度。在步驟170中,根據(jù)HPV蛋白質(zhì)在臨床樣品中的表達(dá)量測(cè)定臨床樣品的疾病等級(jí)。作為實(shí)例，通過(guò)利用已知量的HPV重組蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以量化HPV癌蛋白的表達(dá)水平。在信號(hào)讀取中選擇截止閾值(cutoff threshold),以量化HPV蛋白質(zhì)的表達(dá)水平,并被用于測(cè)定分析的陽(yáng)性率以及確定樣品的疾病等級(jí)。 本文所述的ー種或多種重組蛋白質(zhì)可以在各種合適的系統(tǒng)中被表達(dá)，所述系統(tǒng)如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、病毒表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，例如在本領(lǐng)域中通常已知的大腸桿菌、酵母、桿狀病毒和/或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物。雖然可以通過(guò)其它手段獲得多肽，但本發(fā)明的實(shí)施方式提供一種或多種重組蛋白質(zhì)——大部分處于(或接近干)其天然形式，其在免疫分析中對(duì)于與患有HPV感染的人對(duì)象組織的抗體結(jié)合可能是非常期望的構(gòu)象。獲得的重組蛋白質(zhì)被用于分析的陽(yáng)性對(duì)照，也被用作免疫原以產(chǎn)生抗體。HPV重組蛋白質(zhì)可以是任意種類(lèi)的HPV病毒蛋白質(zhì)、早期基因和/或晩期基因——包括但不限于E2、E6、E7、L1、L2的HPV蛋白質(zhì)，并且可以來(lái)自各種HPV型。一些實(shí)施方式提供重組蛋白質(zhì)，如重組雜合蛋白質(zhì)，其含有HPV癌基因蛋白質(zhì)的部分序列或全長(zhǎng)序列。例如，全長(zhǎng)E6、E7和/或LI多肽序列——由于在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中不期望的聚集、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性、低水平表達(dá)、純化蛋白質(zhì)的低免疫原應(yīng)答而被發(fā)現(xiàn)非常難以獲得和純化。例如，許多早期E6癌蛋白包含許多半胱氨酸氨基酸，因而，E6癌蛋白的正確拓?fù)鋱D要求適當(dāng)?shù)匦纬稍S多ニ硫鍵。另外，已知利用早期E6和E7蛋白質(zhì)的小肽的某些免疫分析導(dǎo)致極其低的特異性和靈敏性，因而不適合作為商業(yè)化的診斷工具。生產(chǎn)HPV重組蛋白質(zhì)，作為免疫原用于產(chǎn)生抗血清和從雜交瘤細(xì)胞系篩選單克隆抗體各種重組蛋白質(zhì)的克隆和生產(chǎn)包括由HP V16 E6編碼的基因和HPV18E6基因、HP V16E7和HPV18 E7基因、HP V16 LI和HPV18 LI基因。為了提供具有期望構(gòu)象的重組蛋白質(zhì)——大部分處于(或接近干)其天然形式，從可溶部分中純化出在大腸桿菌中表達(dá)的重組HPV E6、E7或LI蛋白質(zhì)，然后濃縮并用PBS透析，以用作免疫原。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行小鼠免疫接種和融合，以選出符合我們對(duì)ELISA的篩選標(biāo)準(zhǔn)的克隆。每個(gè)雜交瘤細(xì)胞系在組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并注入到小鼠中，以產(chǎn)生腹水。收集腹水、分出同種型(isotyped)并通過(guò)蛋白質(zhì)G柱純化，以用于HPV免疫測(cè)定。一些實(shí)施方式致力于針對(duì)HPV蛋白質(zhì)的單克隆抗體。獲得大量天然構(gòu)象的、純化的重組HPV蛋白質(zhì)作為免疫原成為生產(chǎn)對(duì)于檢測(cè)臨床樣品中的HPV蛋白質(zhì)特異的抗體中的首要關(guān)鍵步驟。已知E6和E7由于在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中不期望的聚集、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性、低水平表達(dá)和純化蛋白質(zhì)的低免疫原應(yīng)答而非常難以分離和純化。我們已克服技術(shù)障礙，生產(chǎn)了非變性、可溶形式的HPV E6和E7重組蛋白質(zhì)。為了證明我們開(kāi)發(fā)的純化方法產(chǎn)生與抗-HPV抗體結(jié)合的、接近于天然形式的構(gòu)象，我們使用包含人HPV抗體的HPV感染的宮頸樣品(通過(guò)PCR為高風(fēng)險(xiǎn)-HPV陽(yáng)性)來(lái)測(cè)試純化的重組HPV蛋白質(zhì)。利用這種純化的E6和E7重組蛋白質(zhì)檢測(cè)HPV感染的研究證明這些蛋白質(zhì)與抗-HPV抗體結(jié)合，該抗-HPV抗體由響應(yīng)于HPV感染的人免疫應(yīng)答產(chǎn)生的。這些結(jié)果表明，這種純化的重組HPV蛋白質(zhì)適合用作免疫原來(lái)產(chǎn)生抗血清和產(chǎn)生能在體內(nèi)識(shí)別天然HPV病毒蛋白質(zhì)的抗體。我們已經(jīng)使用非變性、可溶的E6和E7重組蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行抗原刺激，并從而開(kāi)發(fā)了針對(duì)HPV E6和E7癌蛋白的高度特異性抗體。獲得的多克隆和單克隆抗體有助于在宮頸活檢、血清或生殖拭子樣本中診斷HPV感染以及評(píng)估人或其它對(duì)象中的疾病等級(jí)。尤其地，利用本發(fā)明抗體進(jìn)行診斷允許鑒定處于惡性轉(zhuǎn)化高風(fēng)險(xiǎn)的患者以及鑒定與樣品有關(guān)的CIN特別階段?？贵w也可用于血清分析，以檢測(cè)HPV病毒或檢測(cè)轉(zhuǎn)移的感染組織中的病毒以及監(jiān)測(cè)HPV免疫療法、抗-HPV疫苗或涉及控制HPV感染和/或?qū)m頸癌的其它治療劑的進(jìn)展。
因此，通過(guò)用純化的HPV16 E6重組蛋白質(zhì)和純化的HPV18 E6重組蛋白質(zhì)篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，一些實(shí)施方式提供單克隆抗體，其能夠識(shí)別兩種不同的HPV型——HPV16和HPV18的E6蛋白質(zhì)上的共同表位。一些實(shí)施方式提供單克隆抗體，其識(shí)別HPV16E7和HPV18 E7蛋白質(zhì)上的共同表位。舉例來(lái)說(shuō)，單克隆抗體用于測(cè)試生物樣品、細(xì)胞系和/或臨床樣品的各種等級(jí)的上皮病變(CIN2、CIN3、LSIL、HSIL、ASC-US)以及不同的宮頸癌、鱗狀細(xì)胞癌(SCC，一種常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型)和腺癌(ADC，ー種腺癌類(lèi)型)。獲得的示例性單克隆抗體包括能夠與HPV16 E6和HPV16 E7病毒蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆抗體類(lèi)型；能與所有HPV16 E6、HPV16 E7和HPV16 LI病毒蛋白質(zhì)結(jié)合的另ー單克隆抗體類(lèi)型；和能與HPV18 E6和HPV18 E7病毒蛋白質(zhì)結(jié)合的另ー單克隆抗體類(lèi)型。因此，利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的單克隆抗體能夠結(jié)合來(lái)自相同HPV型的兩種或更多種HPV病毒蛋白質(zhì)，所述 HPV 型選自高風(fēng)險(xiǎn) HPV 型、低風(fēng)險(xiǎn) HPV 型、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59 和 HPV-68、HPV-6、HPV-IUHPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55 和 HPV-56 及其組合。這些單克隆抗體可用于進(jìn)行ー種或多種免疫分析來(lái)檢測(cè)HPV感染和HPV相關(guān)的宮頸癌和其它疾病。合適的免疫分析可以包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、乳頭瘤病毒蛋白的抗原分析、針對(duì)乳頭瘤病毒蛋白的抗體的抗體分析、乳頭瘤病毒免疫復(fù)合體分析、蛋白質(zhì)芯片分析、放射免疫沉淀測(cè)定分析、快速膜免疫層析分析、快速棒(rapid stick)免疫層析分析、組織和/或?qū)m頸細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析和免疫細(xì)胞化學(xué)分析、其后的流式細(xì)胞測(cè)定。我們使用非變性、可溶的E6和E7重組蛋白進(jìn)行抗原刺激，并從而開(kāi)發(fā)了針對(duì)HPVE6和E7癌蛋白的高度特異性抗體。初始研究支持通過(guò)不同的應(yīng)用宮頸癌組織中的ELISA、蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)法(IHC)來(lái)使用我們的新抗-E6和抗-E7抗體。來(lái)自臨床樣品的確認(rèn)結(jié)果表明我們的抗-E7單克隆抗體可用作生物標(biāo)記，來(lái)鑒定宮頸組織中的高級(jí)發(fā)育異常，并可用于可靠的臨床診斷分析中。在生殖道感染中鑒定了 40種以上的HPV型，其中鑒別的15種類(lèi)型為宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)型，其中，HPV 16型占約50%而18型占宮頸癌病例的另外20-25%。然而，由于許多HPV感染——包括HPV 16和HPV 18感染——是自限性的，所以鑒定組織中的HPV E6和E7癌蛋白可以是鑒級(jí)高度發(fā)育異常細(xì)胞的最直接和有力的測(cè)試，無(wú)論HPV型如何。我們的目標(biāo)是獲得HPV E7特異性單克隆抗體，其能夠同與癌癥發(fā)展相關(guān)的最高風(fēng)險(xiǎn)HPV型反應(yīng)。我們用來(lái)自HPV 16型和18型(占宮頸癌病例的約75%)的HPV重組蛋白質(zhì)篩選了雜交瘤克隆，以鑒定能夠從大部分或所有高風(fēng)險(xiǎn)HPV型中檢測(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)的克隆。另外，我們用不相關(guān)的HPV蛋白質(zhì)篩選了雜交瘤克隆，以排除與HPV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的那些。用于雜交瘤篩選的純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)包括但不限于HPV 16 E6蛋白質(zhì)、HPV 16E7蛋白質(zhì)、HPV 16 LI蛋白質(zhì)、HPV 18 E6蛋白質(zhì)和HP VI 8 E7蛋白質(zhì)。比較我們的IHC結(jié)果與來(lái)自測(cè)試組織的HPV基因型數(shù)據(jù)，我們的抗-E7抗體鑒定大部分普通高風(fēng)險(xiǎn)型——不但包括HPV 16和HPV 18，而且還包括另外的高風(fēng)險(xiǎn)型，其與16型(S卩，31、33、35、52、58型)和18型(S卩，45型)密切相關(guān)。本發(fā)明的ー個(gè)方面提供生產(chǎn)單克隆抗體的方法。該方法包括獲得各種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白和用兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì) 胞，以獲得這樣的單克隆抗體，其能夠識(shí)別兩種或更多種純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)上的共同表位并結(jié)合生物和臨床樣品中兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白和相應(yīng)的乳頭瘤病毒蛋白。另外，通過(guò)使用方法——包括用兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白陽(yáng)性選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞和用非HPV蛋白質(zhì)陰性選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，產(chǎn)生與兩種或更多種人乳頭瘤病毒病毒蛋白質(zhì)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。例如，該方法可以包括通過(guò)用對(duì)兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)性和對(duì)非HPV蛋白質(zhì)的陰性反應(yīng)性選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，而利用兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，以便產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)兩種或更多種人乳頭瘤病毒病毒蛋白質(zhì)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白可以包括，例如HPV 16 E6蛋白質(zhì)、HPV 16 E7蛋白質(zhì)、HPV 16 LI蛋白質(zhì)、HPV 18 E6蛋白質(zhì)、HPVI 8 E7蛋白質(zhì)、HPV 18 LI蛋白質(zhì)和其組合。本發(fā)明的另一方法包括用第一 HPV型的第一純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)和第二 HPV型的第二純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，以獲得這樣的單克隆抗體，其能夠識(shí)別兩種或更多種不同HPV型的人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)上的共同表位。本發(fā)明的再ー種方法提供用第一 HPV型的第一純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)和第二HPV型的第二純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，以獲得這樣的單克隆抗體，其僅能夠識(shí)別第一和第二純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)之一而不是其它純化的重組人乳頭瘤病毒蛋白質(zhì)上的特異性表位。本發(fā)明的另一方面提供方法和能夠結(jié)合來(lái)自不同HPV型的兩種或更多種HPV病毒蛋白質(zhì)的單克隆抗體。通過(guò)用對(duì)來(lái)自不同HPV型的兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)性和對(duì)非HPV蛋白質(zhì)的陰性反應(yīng)性選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，借助于用兩種或更多種純化的重組乳頭瘤病毒蛋白篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞而獲得單克隆抗體，以便產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生與兩種或更多種HPV病毒蛋白質(zhì)具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。示例性單克隆抗體包括能夠結(jié)合HPV16 E7和HPV18 E7蛋白質(zhì)的ー類(lèi)單克隆抗體；能夠結(jié)合HPV16 E6和HPV18E6蛋白質(zhì)的另ー類(lèi)單克隆抗體；和能夠結(jié)合HPV16 LI和HPV18LI蛋白質(zhì)的另ー類(lèi)單克隆抗體，以用于各種免疫分析。本文所述的單克隆抗體是全抗體，其識(shí)別不同病毒類(lèi)型中的共同表位。HPV 16和HPV 18是引起宮頸癌的最常見(jiàn)的兩種類(lèi)型。在13種HPV高風(fēng)險(xiǎn)型中，兩個(gè)主要的組包括HPV 16及其相關(guān)類(lèi)型，如31、33、35、52、58型，以及HPV 18及其相關(guān)類(lèi)型，如45型。盡管在生殖道感染的40種以上的HPV型中，HPV 16和HPV 18屬于不同的組，但基因組序列分析顯示HPV 16和HPV 18之間以及其它類(lèi)型之間的同源性，如表I所示。我們用HPV 16E6和HPV 18重組蛋白質(zhì)篩選抗體，以獲得能夠結(jié)合HPV 16、31、33、52、58和HPV 18、45的全抗體。該全抗體對(duì)于檢測(cè)在最高風(fēng)險(xiǎn)型HPV感染中存在的HPV E6蛋白質(zhì)是新型的。表I :不同HPV型的L1、E6和E7的氨基酸序列同源性。
f LIE6 I' E7
HPV 16 對(duì) HPV 18 63%53%42%
HPV 16 對(duì) HPV 31 81%65%73%
HPV 16 對(duì) HPV 33 79%62%60%
HPV 18 對(duì) HPV 31 64%51%38%
HPV 18 對(duì) HPV 33 65%46%44%
HPV 31 對(duì) HPV 33 78%57%59%
HPV 16 對(duì) HPV 6A 68%35%56%
HPV 16 對(duì) HPV 11 68%34%55%
HPV 6A 對(duì) HPV 11 92%81%83%本發(fā)明的再一方面提供HPV型-特異性單克隆抗體，其僅能結(jié)合第一 HPV病毒蛋白質(zhì)而不是不同于第一 HPV病毒蛋白質(zhì)的第二 HPV病毒蛋白質(zhì)。通過(guò)用對(duì)第一 HPV型的第一純化的重組乳頭瘤病毒蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)性和對(duì)第二 HPV型第二純化的重組乳頭瘤病毒蛋白的陰性反應(yīng)性篩選產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞，獲得這種單克隆抗體，其中第一和第二病毒蛋白質(zhì)與第一和第二 HPV型的第一和第二純化的重組乳頭瘤病毒蛋白相應(yīng)。HPV型-持異性單克隆抗體可以?xún)H與ー種病毒蛋白質(zhì)——第一病毒蛋白質(zhì)結(jié)合。第一病毒蛋白質(zhì)可以包括來(lái)自選自以下的HPV型的病毒蛋白質(zhì)高風(fēng)險(xiǎn)HPV型、低風(fēng)險(xiǎn)HPV型、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59 和HPV-68、HPV-6、HPV-II、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55 和 HPV-56 及其組合。示例性單克隆抗體包括這樣的單克隆抗體，其僅識(shí)別選自以下的ー種病毒蛋白質(zhì)HPV16 E6蛋白質(zhì)、HPV 16 E7蛋白質(zhì)、HPV 16 LI蛋白質(zhì)、HPV 18E6蛋白質(zhì)、HPV18 E7蛋白質(zhì)和HPV 18 LI蛋白質(zhì)。通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的這種類(lèi)型的單克隆抗體可用于在ー種或多種免疫分析中檢測(cè)特異性病毒蛋白質(zhì)的存在。本文開(kāi)發(fā)的抗體有助于HPV早期和晩期基因編碼的高質(zhì)量和適當(dāng)純化的重組蛋白質(zhì)，在免疫分析中有助于產(chǎn)生非常高的靈敏性和特異性，以篩查HPV感染和進(jìn)行宮頸癌檢測(cè)。單克隆抗體可用于ー種或多種免疫分析，其選自ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、乳頭瘤病毒蛋白的抗原分析、針對(duì)乳頭瘤病毒蛋白的抗體的抗體分析、乳頭瘤病毒免疫復(fù)合體分析、蛋白質(zhì)芯片分析、放射免疫沉淀測(cè)定分析、快速膜免疫層析分析、快速棒免疫層析分析、組織和/或?qū)m頸細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析和免疫細(xì)胞化學(xué)分析、其后的流式細(xì)胞測(cè)定等。在一個(gè)實(shí)施方式中，ー種或多種免疫分析可以是非侵襲性的，其中需要最少或不需要額外的儀器。用于產(chǎn)生HPV的單克隆抗體的已知方案通常不適合用于產(chǎn)生抗-HPV單克隆抗體，并不能用于免疫細(xì)胞化學(xué)診斷測(cè)試來(lái)篩選一般的人群體。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)這些方案產(chǎn)生的抗體將不一定與在感染的人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)生的HPV蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。另外，現(xiàn)有技術(shù)抗體識(shí)別的表位不一定是抵抗臨床樣本的取樣、固定和儲(chǔ)存過(guò)程中涉及的標(biāo)準(zhǔn)程序的那些表位。 純化的重組蛋白質(zhì)被用于通過(guò)注入到動(dòng)物物種和用重組蛋白質(zhì)篩選特異性結(jié)合來(lái)產(chǎn)生杭-血清、多克隆和單克隆抗體。許多方便的動(dòng)物物種可用于制備合適的抗血清，并且，這些抗血清可直接使用。合適的動(dòng)物物種包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠或甚至更大的哺乳動(dòng)物，如綿羊。為了施用給這些動(dòng)物，重組蛋白質(zhì)通常在有佐劑的存在下施用，所述佐劑通常為弗氏完全佐劑，并且通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)定期收獲多克隆血清。利用Kohler和Milstein的方法或其更近的修改通過(guò)永生化被注射動(dòng)物的脾臟或其它產(chǎn)生抗體的細(xì)胞以獲得產(chǎn)生單克隆抗體的克隆，可以產(chǎn)生單克隆抗體。HPV陽(yáng)性和陰性人血清樣品有助于篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，以確保單克隆抗體克隆的特異性?？梢垣@得與純化的E6、E7和LI反應(yīng)的ー種以上的陽(yáng)性克隆，并且，可將獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)一步注射到小鼠或其它動(dòng)物源以產(chǎn)生腹水來(lái)純化單克隆抗體，如通過(guò)蛋白質(zhì)A親和柱層析。純化的抗體可用作我們的ELISA中的捕獲或檢測(cè)探針，或者與檢測(cè)酶，如(HRP、AP等)結(jié)合，以在吸光、熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行ELISA基質(zhì)檢測(cè)。進(jìn)行克隆和免疫分析的基本技術(shù)可以從下列參考資料中找到“AntibodieS:ALaboratory Manual (抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南)”，Harlow 和 Lane, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989 ; “Molecular Cloning (分子克隆)，，，ALaboratory Manual (技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)' ),Sambrook, Fritsch 和 Maniatis 編,Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989和本領(lǐng)域中已知的其他書(shū)籟和技術(shù)手冊(cè)'。例如，一種或多種基于免疫學(xué)的分析可以包括基于抗體的分析，其使純化的乳頭瘤病毒蛋白涂覆在表面上，如微量滴定板的底部表面、膜和/或芯片。未被涂覆的表面可以用非結(jié)合蛋白質(zhì)封閉。然后，待測(cè)試的樣品，如可能與抗體抵抗HPV病毒或HP V相關(guān)蛋白質(zhì)的樣品(來(lái)自人對(duì)象的樣品)可通過(guò)結(jié)合涂覆的純化的乳頭瘤病毒蛋白而結(jié)合到表面。結(jié)合的抗體-純化的乳頭瘤病毒蛋白復(fù)合體可通過(guò)二次抗體和一些商業(yè)上可得的檢測(cè)系統(tǒng)利用顯色、化學(xué)發(fā)光或熒光基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。二次抗體的ー個(gè)實(shí)例是辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二次抗體，如針對(duì)人免疫球蛋白(對(duì)于IgG、IgA等是特異性的)的抗體。最終結(jié)果可以通過(guò)微量培養(yǎng)板讀取器讀取或通過(guò)眼睛觀察——如果使用了顯色基質(zhì)。
作為另ー實(shí)例，抗原分析包括將初級(jí)抗體，如對(duì)與感興趣的抗原結(jié)合具有親和性的捕獲抗體，涂覆在表面上，如微量滴定板的底部表面、膜、芯片等。感興趣的抗原可以是，例如乳頭瘤病毒蛋白、癌蛋白、殼體蛋白質(zhì)，其可以由HPV病毒基因，例如早期基因或晩期基因等編碼。將表面上未結(jié)合的部分封閉之后，待分析的臨床樣品可被施加，以與捕獲抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合體，其通過(guò)與感興趣的抗原結(jié)合可以被另ー初級(jí)抗體或檢測(cè)抗體檢測(cè)。因此，兩個(gè)初級(jí)抗體或成對(duì)的捕獲抗體和檢測(cè)抗體與感興趣的抗原相互作用，很像三明治。捕獲抗體可以是與檢測(cè)抗體相同或不同的抗體，只要兩個(gè)抗體可以特異地結(jié)合感興趣的抗原，例如HPV病毒蛋白質(zhì)、HPV癌蛋白、殼體蛋白質(zhì)等等。接下來(lái)，夾在中間的結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合體可以通過(guò)二次抗體被檢測(cè)，所述ニ次抗體對(duì)檢測(cè)抗體具有親和性并有助于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)復(fù)合檢測(cè)系統(tǒng)利用顯色、化學(xué)發(fā)光、熒光和許多不同種類(lèi)的基質(zhì)進(jìn)行測(cè)量。最終的讀取或目測(cè)可以通過(guò)具有適當(dāng)?shù)墓馕兆x取器的儀器進(jìn)行或通過(guò)眼睛直接目測(cè)，并與對(duì)照樣品的結(jié)果進(jìn)行比較。陽(yáng)性結(jié)果表明感興趣的抗原與初級(jí)抗體、捕獲抗體和檢測(cè)抗體的結(jié)合，因而表明感興趣的抗原在臨床樣品中的存在。相反的，陰性結(jié)果表明感興趣的抗原不與初級(jí)抗體結(jié)合，因而感興趣的抗原在臨床樣品中不存在。
ー種或多種免疫分析可用于檢測(cè)至少三種類(lèi)型的感興趣的目標(biāo)蛋白質(zhì)，包括但不限于抗原、抗體和抗原/抗體免疫復(fù)合體(在下文中也分別稱(chēng)為抗原測(cè)試、抗體測(cè)試和抗原/抗體免疫復(fù)合體測(cè)試)等。ー種或多種免疫分析的形式可以是微量培養(yǎng)板形式(例如，32孔、48孔、96孔或384孔)、垂直或水平膜基快速測(cè)試、多點(diǎn)或多重蛋白質(zhì)芯片。分析的原理與以上所述相同，除了檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)基質(zhì)而變化，所述基質(zhì)被選擇，以通過(guò)針對(duì)分析特別設(shè)計(jì)的儀器分析不同讀取結(jié)果或形式的結(jié)果。另外，在一種類(lèi)型的免疫分析中以ー種形式開(kāi)發(fā)的程序、條件、結(jié)合特異性可適于相同或不同免疫分析的不同形式，和/或相同或不同形式的不同免疫分析。也可以以各種形式進(jìn)行ELISA程序。利用若干層抗-抗體、鏈霉抗生物素-生物素復(fù)合體和酶-抗-酶抗體復(fù)合體增強(qiáng)ELISA靈敏性的方法在本領(lǐng)域中是悉知的。用于固定抗原的固體支持物或表面通常是如本文所述的塑料，但各種其它固體支持物諸如乳膠或瓊脂糖也被描述?？乖矝](méi)有必要被直接固定在固體支持物/固相上。例如，存在常用的ELISA形式，其通過(guò)抗原的固-相-固定的抗體將特異性抗原固定到固體支持物，所謂的捕捉抗體ELISA或三明治式ELISA。涉及將抗原印記(轉(zhuǎn)移)到片形式的固體支持物的免疫測(cè)定的特殊例子被稱(chēng)為免疫印記。典型地，固體支持物是硝化纖維或尼龍膜/片，但其它支持物也被描述。各種結(jié)合、混合、溫育、涂覆或印記相互作用均包含在ELISA分析中。在ELISA分析之前，可以根據(jù)其大小通過(guò)凝膠電泳或類(lèi)似方法分開(kāi)抗原或抗體。結(jié)合到片上的特定抗原的抗體的檢測(cè)可以與其它免疫測(cè)定類(lèi)似的方式進(jìn)行。96孔形式是高通量篩選形式，其有助于優(yōu)化分析程序和條件。也可以使用具有不同孔數(shù)目的其它形式。也對(duì)，例如來(lái)自對(duì)HPV感染呈陽(yáng)性的供體對(duì)象和未被HPV感染的未感染(virgin)對(duì)象的血清樣品進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)免疫分析導(dǎo)致，例如在檢測(cè)E6、E7和LI抗體中的高靈敏性。做出初始滴定曲線并優(yōu)化ELISA分析條件。適于結(jié)合的分析條件是這樣的條件(就鹽濃度、pH、洗滌劑、蛋白質(zhì)濃度、溫度等而言)，其允許在固體支持物或在溶液中結(jié)合發(fā)生在，例如捕獲劑和目標(biāo)劑之間、初級(jí)抗體和二次抗體之間、重組蛋白質(zhì)和可以與重組蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)或抗體之間等等。這種條件，尤其關(guān)于抗體及其抗原，在本領(lǐng)域中是悉知的(見(jiàn)，例如Harlow和Lane (Antibodies:ALaboratory Manual (抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, N. Y. (1989))。適于特異性結(jié)合的條件通常允許解離常數(shù)(KD)小于約10_6M的結(jié)合配體或結(jié)合對(duì)選擇性地彼此結(jié)合?？?E6、抗-E7和抗-LI捕獲抗體附著到微量滴定板的底部，以在加入純化的重組蛋白質(zhì)之前進(jìn)行涂覆。然后，使用檢測(cè)抗體來(lái)檢測(cè)與捕獲抗體結(jié)合的捕獲的重組蛋白質(zhì)。確定優(yōu)化的捕獲和檢測(cè)抗體濃度。測(cè)定重組蛋白質(zhì)在反應(yīng)中的濃度——導(dǎo)致ELISA分析中抗原檢測(cè)的直線性。這些三明治式的ELISA分析在同一天重復(fù)多次，以及在不同天重復(fù)多次，以測(cè)定分析的再現(xiàn)性和可靠性。測(cè)定每一分析的特異性和靈敏性。此外，顯示ELISA分析在檢測(cè)宮頸癌過(guò)程中與其它癌癥相比具有選擇性，例如以證明與來(lái)自卵巢或子宮內(nèi)膜癌的樣品的非交叉反應(yīng)。因?yàn)橐阎诖蟛糠帧绻皇撬小獙m頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HPV，但其通常與其它癌癥無(wú)關(guān)，所以本文所述的抗原測(cè)試不應(yīng)該檢測(cè)與其它癌癥有關(guān)的抗原。為了 測(cè)試這種選擇性，例如可以測(cè)試來(lái)自卵巢組織和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的提取物，其也可以用作抗原測(cè)試中的陰性對(duì)照。作為HPV全細(xì)胞ELISA的實(shí)例，基本測(cè)試程序如下
權(quán)利要求
1.量化臨床樣品中HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，包括如下步驟 獲得臨床樣品，所述臨床樣品包括易受HPV感染細(xì)胞群體； 將所述臨床樣品沉積到基質(zhì)中； 使所述臨床樣品與特異性結(jié)合由HPV感染細(xì)胞表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)的初次抗體接觸，所述接觸的條件是促進(jìn)所述初次抗體與由來(lái)自所述獲得的臨床樣品的所述細(xì)胞群體表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)特異性結(jié)合；和 量化所述初次抗體的所述特 異性結(jié)合，從而量化所述臨床樣品中的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述臨床樣品包括分散在收集液體中的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求I所述的方法，還包括測(cè)量所述臨床樣品的細(xì)胞密度。
4.權(quán)利要求3所述的方法，還包括標(biāo)準(zhǔn)化所述臨床樣品的所述細(xì)胞密度。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基質(zhì)選自膜、珠和微量孔表面。
6.權(quán)利要求I所述的方法，還包括將所述量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)與預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值比較。
7.權(quán)利要求6所述的方法，還包括根據(jù)所述臨床樣品中存在的細(xì)胞數(shù)目來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化所述量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)。
8.權(quán)利要求6所述的方法，還包括將所述量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)與HPV蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。
9.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值與所述臨床樣品中的癌癥有關(guān)。
10.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值與所述臨床樣品中的疾病等級(jí)有關(guān)。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述預(yù)定的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平閾值通過(guò)測(cè)量包含診斷的疾病等級(jí)的臨床樣品中的所述HPV蛋白質(zhì)表達(dá)水平而被確定。
12.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述臨床樣品包括固定的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞獲自宮頸拭子或?qū)m頸刮片。
14.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞獲自口腔拭子、口腔刮片、肛門(mén)拭子或肛門(mén)刮片。
15.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述初次抗體特異地結(jié)合由ー種或多種HPV編碼的ー種或多種HPV蛋白質(zhì)，所述ー種或多種HPV選自高風(fēng)險(xiǎn)HPV型、低風(fēng)險(xiǎn)HPV型、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和 HPV-68、HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55 和 HPV-56。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述初次抗體特異地結(jié)合HPV蛋白質(zhì)，所述HPV蛋白質(zhì)選自HPV E6蛋白質(zhì)、HPV E7蛋白質(zhì)、HPV LI蛋白質(zhì)和HPV L2蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述HPV蛋白質(zhì)包括選自下列的HPV蛋白質(zhì)HPVE6蛋白質(zhì)、HPV E7蛋白質(zhì)、HPV LI蛋白質(zhì)和HPV L2蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述基質(zhì)是微量孔表面。
19.權(quán)利要求I所述的方法,還包括使所述臨床樣品與標(biāo)記的二次抗體接觸,所述標(biāo)記的二次抗體特異地結(jié)合所述初次抗體。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述標(biāo)記選自直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。
21.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述初次抗體包括標(biāo)記。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述標(biāo)記選自直接標(biāo)記和間接標(biāo)記。
23.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述量化步驟包括量化由酶標(biāo)記產(chǎn)生的生色基質(zhì)。
24.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述量化步驟包括量化熒光信號(hào)。
25.權(quán)利要求I所述的方法，還包括根據(jù)所述量化的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)評(píng)估所述臨床樣品中的HPV相關(guān)癌癥疾病等級(jí)。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述HPV相關(guān)癌癥是宮頸癌。
全文摘要
公開(kāi)了量化臨床樣品中HPV蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。該量化方法包括獲得臨床樣品的過(guò)程。這種臨床樣品由易受HPV感染的細(xì)胞群體組成。該量化方法還包括將臨床樣品沉積到容器中的過(guò)程。使臨床樣品與特異性結(jié)合由HPV感染細(xì)胞表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)的初次抗體接觸，所述接觸的條件是促進(jìn)初次抗體與由細(xì)胞群體表達(dá)的HPV蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。該方法還包括量化初次抗體的特異性結(jié)合的過(guò)程，從而量化臨床樣品中的HPV蛋白質(zhì)表達(dá)。該分析提供客觀的測(cè)試，以在活組織檢查前，從細(xì)胞學(xué)樣品中識(shí)別具有高級(jí)前體的患者。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102822672SQ201080060962
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者S·成 申請(qǐng)人:安科健康公司