專利名稱：一種豬car激動劑的高通量篩選方法
技術領域：
本項發(fā)明屬于農業(yè)畜牧獸醫(yī)應用領域，具體地說是一種豬CAR激動劑的高通量篩選方法。
背景技術：
核受體(nuclear receptor)是一類配體依賴的轉錄因子，啟動細胞內信號轉導的級聯(lián)反應。核受體與相應的配體及其輔調節(jié)因子相互作用，調控基因的協(xié)調表達，從而在機體的生長發(fā)育、新陳代謝、細胞分化及體內許多生理過程中發(fā)揮重要作用。核受體調控基因表達的典型模式是結合配體，引起受體結構的變化，允許和輔助因子作用，從而調控基因的表達。與典型模式不同的是，CAR在沒有配體信號情況下能夠調控與類固醇、藥物、異型生物質代謝相關基因的轉錄。CAR與RXR(類維生素A-X-受體)相連后想成一種異質二聚體，并能識別在第Ι、Π、ΙΙΙ階段的酶和轉錄蛋白的5'調控區(qū)的特定的六個堿基的DNA序列。又很少的化合物可以與CAR的配體結合區(qū)相結合，進行基因轉錄調控。鼠類CAR激動劑已選出幾種，但在人類的CAR激動劑研究中，篩選出的激動劑很少，并且兩物種選出的激動劑有所不同。見于CAR對藥物、膻味物質等異型生物質代謝基因的作用，因此豬CAR基因的表達對改善肉質等性能有重要的意義。而且，關于豬CAR激動劑的篩選還未見文獻報道。研究基因表達水平的方法很多，如Western blot、毛細管電泳、基因芯片、mRNA差異顯示等。這些經(jīng)典的方法雖然直接，但是除了毛細管電泳有望開發(fā)成高通量篩選方法外，其他都不行，且毛細管電泳用于高通量藥物篩選還很不成熟。報告基因方法也常用于研究基因表達和調控，可以從基因轉錄和翻譯兩個水平去研究。在翻譯水平上不太容易設計成高通量藥物篩選方法，而且翻澤水平又受到轉錄水平的控制。因此，我們認為從轉錄水平來考慮是比較理想的，通過提高轉錄水平，就可能達到提高基因表達的目的。 從轉錄水平研究基因表的的報告基因方法，快速、靈敏，適合高通量藥物篩選。因此通過建立基于豬核受體CAR激動劑的篩選模型，對一系列生物活性物質的CAR激動活性進行篩選， 以期研究開發(fā)出一種CAR激動劑類減少異型生物質的生物活性物質，對促進豬只健康和保障豬肉安全具有重要的理論與現(xiàn)實意義。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種靈敏、高效、規(guī)模大、能適用于pgCAR激動劑的高通量篩選方法。具體來說本發(fā)明是通過以下技術方案來達到本發(fā)明目的，主要包括以下幾個步驟第一步豬肝臟總RNA提取，RT-PCR擴增出pgCAR基因片段將凍存于液氮中的豬肝臟組織在始終有液氮存在的研缽中進行研磨，將研磨成粉末狀的肝臟組織進行總RNA提取，總RNA提取試劑盒購自Bioteke公司；
將提取出的總RNA進行反轉錄，反轉錄試劑盒購自Applied Biosystems公司，形成cDNA ；根據(jù)pgCAR的序列設計兩段引物上游5，-CCCAAG CTT GCC ATG GCC AGC GGG GAA GA-3，，下游:5，-CGCGGA TCC TCA GCT GCA GAT CTC CTG GA-3，，將其稀釋到20 μ M ；以反轉錄后的cDNA為模板進行目的基因的擴增，總體積為 25 μ 1，PCR體系為
權利要求
1. 一種豬CAR激動劑的高通量篩選方法，其特征在于，方法如下 第一步豬肝臟總RNA提取，RT-PCR擴增出pgCAR基因片段 將凍存于液氮中的豬肝臟組織在始終有液氮存在的研缽中進行研磨，將研磨成粉末狀的肝臟組織進行總RNA提取，總RNA提取試劑盒購自Bioteke公司；將提取出的總RNA進行反轉錄，反轉錄試劑盒購自Applied Biosystems公司，形成 cDNA ；根據(jù)pgCAR的序列設計兩段引物上游:5，-CCC AAG CTT GCC ATG GCC AGC GGG GAA GA-3，， 下游:5，-CGC GGA TCC TCA GCT GCA GAT CTC CTG GA-3，，將其稀釋到20 μ M ；以反轉錄后的cDNA為模板進行目的基因的擴增，總體積為25 μ 1， PCR體系為
全文摘要
本項發(fā)明涉及一種豬CAR激動劑的高通量篩選方法，屬于農業(yè)畜牧獸醫(yī)應用領域。本發(fā)明的高通量篩選方法通過豬肝臟總RNA提取、RT-PCR得到的pgCAR基因片段與真核表達質粒連接和(NR1)5-TK promotor全基片段與報告質粒連接，然后將重組表達質粒、重組報告質粒及內參報告質粒共轉染哺乳動物細胞形成穩(wěn)定細胞株，再向穩(wěn)定細胞株中加入待篩選的藥物，測定報告基因的表達水平，評估藥物的生物活性，將生物活性高的藥物選出，得到pgCAR激動劑。本發(fā)明所建立的細胞篩選模型操作簡單易行，具有很好的特異性和敏感性，能夠高效、快速、準確地發(fā)現(xiàn)豬CAR的激動劑。
文檔編號G01N21/64GK102321732SQ201110221908
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權日2011年6月20日
發(fā)明者單安山, 婁蕾, 石寶明 申請人:東北農業(yè)大學