專利名稱：多肽和治療方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于抑制聚集蛋白聚糖酶，特別是ADAMTS5，由此降低軟骨中聚集蛋白聚糖(aggrecan)分解的方法。
背景技術：
軟骨是由稱作軟骨細胞的專門化細胞建立的一種無血管組織，軟骨細胞響應各種機械和生化刺激。軟骨存在于關節(jié)襯里，間隙結(jié)締組織，和基底膜中，而且由胞外基質(zhì)構成， 胞外基質(zhì)由數(shù)種基質(zhì)成分構成，包括II型膠原，蛋白聚糖，纖連蛋白和層粘連蛋白。在正常軟骨中，胞外基質(zhì)合成被胞外基質(zhì)降解抵消，導致正?；|(zhì)周轉(zhuǎn)。根據(jù)接收到的信號，隨之發(fā)生的響應可以是同化的(導致基質(zhì)生成和/或修復)或者是異化的(導致基質(zhì)降解，細胞凋亡，功能喪失，和疼痛)。響應有害壓迫和/或炎性介導物(例如炎性細胞因子)暴露，軟骨細胞降低基質(zhì)生成并提高多種基質(zhì)降解酶生成?；|(zhì)降解酶的例子包括聚集蛋白聚糖酶(ADAMTQ和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。這些酶的活性導致軟骨基質(zhì)降解。聚集蛋白聚糖酶(ADAMTS)，連同 MMP，降解聚集蛋白聚糖，即存在于關節(jié)軟骨中的一種聚集性蛋白聚糖。在骨關節(jié)炎(OA)關節(jié)軟骨中，在早期OA中的淺表區(qū)帶中和在中度至重度OA中的軟骨侵蝕區(qū)域附近觀察到蛋白聚糖染色的喪失。由聚集蛋白聚糖酶介導的聚集蛋白聚糖異化發(fā)生于聚集蛋白聚糖中的某些保守位點。已經(jīng)顯示了人ADAMTS4(在圖5中顯示為SEQ ID NO :44)和ADAMTS5 (在圖4中顯示為 SEQ ID N0:43)在氨基酸E373和A374之間切割聚集蛋白聚糖，產(chǎn)生尼奧表位(neo印itope) ARGSVIL(SEQ ID NO :1)。胞外基質(zhì)的過度降解涉及許多疾病和狀況的發(fā)病機理，包括疼痛，慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，手術后疼痛疼痛，類風濕性關節(jié)炎，骨關節(jié)炎，運動損傷，侵蝕性關節(jié)炎，強直性脊椎炎，神經(jīng)痛，神經(jīng)病，痛覺，神經(jīng)損傷，缺血，神經(jīng)變性，軟骨降解，中風，失禁，炎性病癥，腸易激綜合征，牙周病，異常血管發(fā)生，腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移，角膜潰瘍，和糖尿病并發(fā)癥。如此，需要能夠抑制聚集蛋白聚糖酶活性和軟骨降解的化合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含至少一個能夠結(jié)合和/或中和人ADAMTS5的可變域。還提供了分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的多肽。還有，提供了藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的多肽。本文中提供了用本發(fā)明的藥物組合物來治療罹患軟骨疾病的患者的方法。附圖簡述

圖1 :ADAMTS5單抗對ARGSVIL (SEQ ID NO :1)尼奧表位生成的體外抑制。圖2 -JM. IEll鼠單抗對ARGSVIL (SEQ ID NO 1)尼奧表位生成的體外濃度依賴性抑制。圖3 體內(nèi)用選定ADAMTS5抗體或?qū)φ仗幚淼男∈蟮钠骄P節(jié)總分。
圖4 人 ADAMTS5 的氨基酸序列(SEQ ID NO 43)。圖 5 人 ADAMTS4 的氨基酸序列(SEQ ID NO 44)。圖6 人源化抗ADAMTS5抗體對重組抗原的結(jié)合。圖7 人源化抗ADAMTS5抗體對重組抗原的結(jié)合。圖8 人源化抗ADAMTS5抗體對重組抗原的結(jié)合。圖9 人源化抗ADAMTS5抗體對重組抗原的結(jié)合。圖10 :ADAMTS5活性的百分比抑制。圖11 :ADAMTS5活性的百分比抑制。圖12 純化的抗ADAMTS5抗體對重組抗原的結(jié)合。圖13 結(jié)構建模預測抗原/抗體相互作用位點。發(fā)明詳述“多核苷酸” 一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其抗原是未修飾的RNA或DNA或者是經(jīng)修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單鏈和雙鏈DNA，為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，和為單鏈和雙鏈區(qū)混合物的RNA，包含可以為單鏈或更通常的雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混合物的DNA和RNA的雜合分子。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA 二者的三鏈區(qū)。術語多核苷酸還包括含有一種或多種經(jīng)修飾堿基的DNA或RNA和主鏈為穩(wěn)定性或為其它原因經(jīng)修飾的DNA或RNA?！敖?jīng)修飾”堿基包括例如三苯甲基化堿基和非常見堿基諸如肌苷。已經(jīng)對DNA和RNA進行了多種修飾；如此，“多核苷酸”涵蓋在自然界中通常找到的多核苷酸的化學，酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細胞特征性的DNA和RNA的化學形式。“多核苷酸”還涵蓋相對較短的多核苷酸，常常稱作寡核苷酸?！岸嚯摹敝赴瑑蓚€或更多個通過肽鍵或經(jīng)修飾肽鍵(即肽電子等排體)彼此連接的氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)?！岸嚯摹敝付替?通常稱作肽，寡肽或寡聚物)和較長鏈(一般稱作蛋白質(zhì))二者。多肽可含有20種由基因編碼的氨基酸以外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^天然過程諸如翻譯后過程或通過本領域公知的化學修飾技術經(jīng)修飾的氨基酸序列。此類修飾較好地描述于基礎教科書中，而且更詳細地描述于專著以及多卷研究文獻中。修飾可發(fā)生于多肽中的任何地方，包括肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。會領會，相同類型的修飾可以以相同或不同程度存在于給定多肽中的數(shù)個位點。還有，給定多肽可含有多種類型的修飾。多肽可以因遍在蛋白化而分支，而且它們可以是環(huán)狀的，有或無分支。環(huán)狀的，分支的和分支環(huán)狀的多肽可源自翻譯后天然過程，或者可以通過合成方法來生成。修飾包括乙?；?，?；珹DP-核糖基化，酰胺化，黃素的共價附著，血紅素模塊的共價附著，核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著，脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著，磷脂酰肌醇的共價附著，交聯(lián)，環(huán)化，二硫鍵形成，脫甲基，共價交聯(lián)形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸形成，甲?；琘 -羧化，糖基化，GPI錨形成，羥化，碘化，甲基化，肉豆蔻?；?，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊烯化，外消旋，硒化，硫酸化，tRNA介導的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加諸如精氨?；捅樵诘鞍谆?。參見例如 PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ndEd. ,Τ. Ε. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York,1993 禾口 Wold, F. , Posttranslational Protein Modifications =Perspectives and Prospects,pgs. l-12in P0STTRANSLATI0NAL C0VALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B. C. Johnson,Ed. ,Academic Press,New York, 1983 ；Seifter,et al. , "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymo 1. (1990) 182 :626-646禾口 Rattan, et al. ,"Protein Synthesis :Posttranslational Modifications and Aging”，Ann NY Acad Sci(1992)663 :48-620如術語在本文中是使用的，“變體”為分別與參照多核苷酸或多肽不同，但保留本質(zhì)特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的一種典型變體在核苷酸序列方面與另一種參照多核苷酸不同。變體的核苷酸序列中的變化可改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸變化可導致由參照序列編碼的多肽中的氨基酸替代，添加，刪除，融合和截短，如下文所討論的。多肽的一種典型變體在氨基酸序列方面與另一種參照多肽不同。一般地，差異是有限的，使得參照多肽和變體的序列總體上密切相似，而且在許多區(qū)域中相同。 變體和參照多肽在氨基酸序列方面可因一處或多處任意組合的替代，添加，刪除而不同。替代或插入的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的。多核苷酸或多肽的變體可以是天然發(fā)生的，諸如等位變體，或者它可以是不知道天然發(fā)生的變體。多核苷酸和多肽的非天然發(fā)生變體可通過誘變技術或通過直接合成來生成。“分離的”意味著“人為地”自其天然狀態(tài)改變，即如果它存在于自然界中的話，它已經(jīng)自其初始環(huán)境變化或移除，或二者。例如，天然存在于活生物體中的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存材料分開的相同多核苷酸或多肽是“分離的”，包括但不限于當將此類多核苷酸或多肽導入回細胞中時?！胺蛛x的”或“基本上純的”核酸或多核苷酸(例如RNA，DNA或混合聚合物)是基本上與在其天然宿主細胞中天然伴隨天然多核苷酸的其它細胞成分，例如與其天然聯(lián)合的核糖體，聚合酶和基因組序列分開的。術語涵蓋如下的核酸或多核苷酸(1)已經(jīng)自其天然發(fā)生環(huán)境移除，( 不與在自然界中在其中找到“分離的多核苷酸”的多核苷酸整個或部分聯(lián)合，( 可操作連接在自然界中不連接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。術語“分離的”或“基本上純的”還可用于提及重組或克隆的DNA分離物，化學合成的多核苷酸類似物，或由異源系統(tǒng)生物合成的多核苷酸類似物。然而，“分離的”不必然要求所述核酸或多核苷酸自身已經(jīng)自其天然環(huán)境物理移除。例如，如果將異源序列放置在內(nèi)源核酸序列附近，使得此內(nèi)源核酸序列的表達改變，例如升高，降低或消除的話，生物體基因組中的內(nèi)源核酸序列在本文中視為是“分離的”。在此語境中，異源序列為不是天然在內(nèi)源核酸序列附近的序列，無論異源序列自身是內(nèi)源的 (源自相同宿主細胞或其后代)或是外源的(源自不同宿主細胞或其后代)。舉例而言，啟動子序列可替代(例如通過同源重組)宿主細胞的基因組中基因的天然啟動子，使得此基因具有改變的表達樣式。此基因現(xiàn)在會變成“分離的”，因為它與天然在其側(cè)翼的序列的至少一些分開。如果核酸含有不是天然發(fā)生于基因組中的對應核酸的任何修飾的話，它也認為是 “分離的”。例如，如果內(nèi)源編碼序列含有人工(例如通過人干預)引入的插入，刪除或點突變的話，它認為是“分離的”?！胺蛛x的核酸”還包括在異源位點處整合入宿主細胞染色體中的核酸和作為附加體存在的核酸構建物。此外，“分離的核酸”可以基本上沒有其它細胞材料，或在通過重組技術生成時基本上沒有培養(yǎng)基，或在化學合成時基本上沒有化學前體或其它化學品。如本文中所使用的，“炎性介導物”包括能夠觸發(fā)炎性過程的任何化合物。術語炎癥一般指血管化活組織對損傷反應的過程。此過程包括但不限于升高的血流，升高的血管通透性，和白細胞滲出。因為募集入炎性反應的白細胞能釋放有力的酶和氧自由基(即炎性介導物)，所以炎性應答能夠介導客觀的組織損害。炎性介導物的例子包括但不限于前列腺素(例如PGE2)，白三烯(例如LTB4)，炎性細胞因子，諸如腫瘤壞死因子α (TNF α )，白介素1(11^-1)，和白介素6(11^-6)；—氧化氮(NO)，金屬蛋白酶，和熱休克蛋白。如本文中所使用的，“基質(zhì)蛋白”包括自細胞釋放，以形成軟骨胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)。 軟骨的胞外基質(zhì)由屬于數(shù)個不同蛋白聚糖家族的蛋白聚糖組成。這些包括但不限于串珠蛋白聚糖(perlecan)和透明凝集聚糖(hyalectan)，例如聚集蛋白聚糖和多能蛋白聚糖 (versican)，和小的富含亮氨酸的蛋白聚糖家族，包括飾膠蛋白聚糖(decorin)，雙糖鏈蛋白聚糖(biglycan)和纖調(diào)蛋白(fibromodulin)。胞外基質(zhì)還包括由三種膠原同種型，即II 型，IX型，和XI型膠原組成的雜合膠原纖維，連同輔助蛋白諸如軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)， 連接蛋白，和纖連蛋白。軟骨還含有透明質(zhì)素(hyaluronin)，其與透明凝集素(hyalectin) 形成非共價聯(lián)合。另外，專門化胞周基質(zhì)圍繞軟骨細胞，其由蛋白聚糖，VI型膠原和膠原受體蛋白，諸如錨蛋白組成。如本文中所使用的，“基質(zhì)降解酶”指能夠切割胞外基質(zhì)蛋白的酶。軟骨胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)調(diào)節(jié)，基質(zhì)金屬蛋白酶作為潛在酶原合成，需要活化來降解軟骨胞外基質(zhì)蛋白。認為三類酶調(diào)節(jié)胞外基質(zhì)蛋白的周轉(zhuǎn)，即負責天然膠原纖維降解的膠原酶(包括但不限于MMP-13)，降解蛋白聚糖和IX型膠原的溶基質(zhì)蛋白酶(包括但不限于 MMP-3)，和降解變性膠原的明膠酶(包括但不限于MMP-2和MMP-9)。在OA中的軟骨降解方面表現(xiàn)最相關的基質(zhì)降解酶組包括稱作ADAMTS的金屬蛋白酶亞組，因為它們在它們的結(jié)構中擁有解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶域和血小板反應蛋白基序。已經(jīng)報告了 ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)在OA關節(jié)中升高，而且連同ADAMTS-5 (聚集蛋白聚糖酶_2~)，已經(jīng)顯示了在人骨關節(jié)炎軟骨中表達。這些酶表現(xiàn)出負責聚集蛋白聚糖降解，沒有MMP參與。如本文中所使用的，“降低”聚集蛋白聚糖酶活性指與至少一種天然發(fā)生聚集蛋白聚糖酶，包括但不限于ADAMTS4和ADAMTS5有關的任何和/或所有活性的降低。例如，“降低”至少一種ADAMTS5活性指與天然發(fā)生ADAMTS5有關的任何和/或所有活性的降低。舉例而言，降低哺乳動物中的ADAMTS5活性可在將至少一種能夠結(jié)合ADAMTS5的多肽施用于受試者之后測量，并與相同受試者中在施用能夠結(jié)合ADAMTS5的多肽之前的ADAMTS5活性比較或與施用安慰劑的第二受試者比較。如本文中所使用的，“降低”至少一種ADAMTS5(活性)包括至少一種或多種酶活性的降低。至少一種ADAMTS5活性的降低包括至少一種 ADAMTS5(活性)的完全消除。此定義內(nèi)還包括量降低的至少一種酶活性。就是，ADAMTS5 可具有超過一種得到維持的活性，而相同酶的第二活性得到降低。如本文中所使用的，“與軟骨降解有關的疾病”包括但不限于癌癥，疼痛，慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，手術后疼痛疼痛，骨關節(jié)炎，運動損傷，侵蝕性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，銀屑病關節(jié)炎，萊姆關節(jié)炎，幼年型關節(jié)炎，強直性脊椎炎，神經(jīng)痛，神經(jīng)病，痛覺，神經(jīng)損傷， 缺血，神經(jīng)變性，炎性疾病，軟骨降解，影響喉，氣管，耳道，椎間盤，韌帶，腱，關節(jié)囊或骨發(fā)育的疾病，椎間盤降解，骨質(zhì)減少，或牙周病，急性關節(jié)損傷，和/或涉及關節(jié)破壞的疾病。如本文中所使用的，“共施用”，如本文中所使用的，指將兩種或更多種化合物施用于相同患者。此類化合物的共施用可以是同時的或大致相同時間的(例如在相同小時內(nèi))或者可以彼此在數(shù)個小時或天內(nèi)。例如，第一化合物可以一周一次施用，而第二化合物每天共施用。如本文中所使用的，“削弱”指在暴露于異化刺激之后，由細胞生成和/或釋放的基質(zhì)降解酶，炎性介導物，或基質(zhì)蛋白的量的規(guī)范化(即升高或降低)。例如，在暴露于IL-I之后，基質(zhì)蛋白，諸如蛋白聚糖的軟骨細胞生成降低，而基質(zhì)降解酶(例如MMP-13，ADAMTS4) 和反應性氧種類(例如NO)生成升高。削弱指這些各種應答向在異化刺激缺失下觀察到的水平的標準化?！坝蚩贵w，，或“ dAb ”可認為與能夠結(jié)合抗原的“單可變域”相同。單可變域可以是人抗體可變域，但是也包括來自其它物種諸如嚙齒動物(例如WO 00/29004中披露的)，絞口鯊和駱駝科動物VHH dAb的單抗體可變域。駱駝科動物VHH為自生成天然沒有輕鏈的重鏈抗體的物種包括駱駝(camel)，美洲駝(llama)，羊駝(alpaca)，單峰駱駝(dromedary)， 和駱馬(guanaco)衍生的免疫球蛋白單可變域多肽。此類VHH域可依照本領域可得的標準技術來人源化，而且此類域認為是“域抗體”。如本文中所使用的，VH包括駱駝科動物VHH 域。短語“單可變域”指不依賴不同可變區(qū)或域，特異性結(jié)合抗原或表位的抗原結(jié)合蛋白可變域(例如VH，VHH, VL)。如本文中所使用的，術語“抗原結(jié)合蛋白”指能夠結(jié)合抗原的抗體，抗體片段和其它蛋白質(zhì)構建物，諸如域，但不限于可變域和域抗體?？贵w的抗原結(jié)合域包含兩個分開的區(qū)重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL 其可以是Vk或νλ)。抗原結(jié)合位點自身由六個多肽環(huán)形成三個來自VH域的(Η1，Η2和Η3) 和三個來自VL域的(Li，L2和L3)。對抗體結(jié)構和序列的分析顯示了六個抗原結(jié)合環(huán)中的五個(Hl，Η2，Li，L2，L3) 擁有有限數(shù)目的主鏈構象或規(guī)范結(jié)構(Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. , 196 901 ； Chothia et al. (1989) Nature，342 :877)。主鏈構象由下述各項決定(i)抗原結(jié)合環(huán)的長度，和(ii)抗原結(jié)合環(huán)和抗體框架中某些關鍵位置處的特定殘基，或殘基類型。對環(huán)長度和關鍵殘基的分析使得我們能夠預測由大多數(shù)人抗體序列編碼的Hl，H2，Li，L2和L3的主鏈構象(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. , 227 799 ；Tomlinson et al. (1995) EMBO J. , 14 4628 ；Williams et al. (1996) J. Mol. Biol.，264 :220)。雖然 H3 區(qū)就序列，長度和結(jié)構而言多樣得多(由于D區(qū)段的使用)，但是對于短環(huán)長度，它也形成有限數(shù)目的主鏈構象，這取決于長度和環(huán)中關鍵位置處特定殘基或殘基類型的存在和抗體框架(Martin et al. (1996)J. Mol. Biol. , 263 800 ；Shirai et al. (1996)FEBS Letters，399 1)。包含互補VH和VL區(qū)對的雙特異性抗體是本領域已知的。這些雙特異性抗體必須包含兩對VH和VL，每對VH/VL結(jié)合單個抗原或表位。所述方法涉及雜合雜交瘤(Milstein & Cuello AC, Nature 305 :537-40)，迷你抗體(minibody) (Hu et al.，(1996) Cancer Res 56 :3055-3061)，雙抗體(Holliger et al.，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90， 6444-6448 ；WO 94/13804)，螯合重組抗體(CRAb ;Neri et al.，(1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373)，biscFv(例如 Atwell et al.，(1996)Mol. Immunol. 33，1301-1312)，“隆突入空穴”(knobs in holes)穩(wěn)定化抗體(Carter et al.，(1997) Protein Sci. 6，781-788))。在每一種情況中，每一種抗體種類包含兩個抗原-結(jié)合位點，每一個的樣式為一對互補的VH和VL域。每一種抗體由此在同一時間能夠結(jié)合兩種不同抗原或表位，其中對每一種抗原或表位的結(jié)合由VH及其互補VL域介導。每一種這些技術呈現(xiàn)其特定缺點；例如在雜合雜交瘤的情況中，無活性VH/VL對可大大降低雙特異性IgG的分數(shù)。另外，大多數(shù)雙特異性辦法依賴于不同VH/VL對的聯(lián)合或VH和VL鏈的聯(lián)合來創(chuàng)建兩種不同VH/VL結(jié)合位點。因此不可能控制裝配分子中針對每一種抗原或表位的結(jié)合位點的比例，因此許多裝配分子會結(jié)合一種抗原或表位但不結(jié)合另一種。在一些情況中，有可能在亞基界面處改造重鏈或輕鏈 (Carter et al. , 1997)以增加具有針對兩種抗原或表位的結(jié)合位點的分子的數(shù)目，但是這從未導致所有分子具有針對兩種抗原或表位的結(jié)合。有一些證據(jù)證明兩種不同抗體結(jié)合特異性可摻入相同結(jié)合位點中，但是這些一般呈現(xiàn)對應于結(jié)構相關抗原或表位或者對應于廣泛交叉反應性抗體的兩種或更多種特異性。例如，交叉反應性抗體已有記載，通常其中兩種抗原在序列和結(jié)構方面是相關的，諸如雞卵清溶菌酶和火雞溶菌酶(McCafferty et al.，WO 92/01047)或游離的半抗原和綴合至載體的半抗原(Griffiths AD et al. EMBO J 199413:143245-60)。在又一個例子中，WO 02/02773 (Abbott Laboratories)記載了具有“雙重特異性”的抗體分子。所述抗體分子是針對多種抗原生成或選擇的抗體，使得它們的特異性跨越超過一種抗原。W002/02773的抗體中的每一個互補VH/VL對規(guī)定針對兩種或更多種結(jié)構相關抗原的單結(jié)合特異性；此類互補對中的VH和VL域不是每一個擁有不同的特異性。抗體如此具有廣泛的單特異性，其涵蓋兩種結(jié)構相關的抗原。另外，已經(jīng)記載了天然自身抗體是多反應性的(Casali & Notkins， Ann. Rev. Immunol. 7，515-531)，與至少兩種(通常更多種)不同的結(jié)構不相關的抗原或表位反應。還已經(jīng)顯示了在單克隆抗體上使用噬菌體展示技術選擇隨機肽全集會鑒定一系列適合抗原結(jié)合位點的肽序列。一些序列是高度相關的，適合共有序列，而其它序列是非常不同的且禾爾作模擬位(mimotope) (Lane & Stephen，Current Opinion in Immunology, 1993, 5，268-271)。因此清楚了包含聯(lián)合且互補的VH和VL域的天然四鏈抗體有潛力結(jié)合多種來自大量已知抗原全體的不同抗原。不太清楚如何在同一抗體中創(chuàng)建針對兩種給定抗原的結(jié)合位點，特別是那些不必然結(jié)構相關的。已經(jīng)提出蛋白質(zhì)工程方法在這個方面有關系。例如，還已經(jīng)提出可以創(chuàng)建如下的催化性抗體，其經(jīng)由一個可變域具有針對金屬離子的結(jié)合活性，且經(jīng)由與金屬離子的接觸和互補可變域具有針對半抗原(底物)的結(jié)合活性(Bartas et al. , 1993Proc. Natl. Acad. Sci USA 90,6385-6389)。然而，在此情況中，提出對底物(第一抗原)的結(jié)合和催化需要對金屬離子(第二抗原)的結(jié)合。如此，VH/VL配對的結(jié)合涉及單一但多成分的抗原。已經(jīng)記載了用于自駱駝抗體重鏈單域創(chuàng)建雙特異性抗體的方法，其中在一個可變域中創(chuàng)建一種抗原的結(jié)合接觸，且在第二免疫球蛋白可變域中創(chuàng)建第二抗原的結(jié)合接觸。然而，可變域不是互補的。如此，選擇針對第一抗原的第一重鏈可變域和針對第二抗原的第二重鏈可變域，然后在同一條鏈上將這兩個域連接到一起以給出雙特異性抗體片段 (Conrath et al.，J. Biol. Chem. 270，27589-27594)。然而，駱駝重鏈單域通常是它們衍生自沒有輕鏈且重鏈單域確實不能與駱駝輕鏈聯(lián)合以形成互補VH和VL對的天然駱駝抗體。還已經(jīng)記載了衍生自通常與輕鏈(來自單克隆抗體的或來自域全集的；參見 EP-A-0368684)聯(lián)合的天然抗體的單重鏈可變域。已經(jīng)顯示了這些重鏈可變域與一種或多種相關抗原特異性相互作用，但是未與其它重鏈或輕鏈可變域組合以創(chuàng)建具有針對兩種或更多種不同抗原的特異性的配體。另外，已經(jīng)顯示了這些單域具有很短的體內(nèi)半衰期。因此，此類域的治療價值有限。已經(jīng)提出通過將不同特異性的重鏈可變域連接到一起(如上所述)來生成雙特異性抗體片段。這種辦法的缺點是分離的抗體可變域可能具有疏水性界面，其通常與輕鏈進行相互作用且暴露于溶劑且可能是“粘的”，容許單域結(jié)合疏水性表面。另外，在配偶輕鏈缺失下，兩種或更多種不同重鏈可變域可能經(jīng)由其疏水性表面的組合及其聯(lián)合可能阻止它們結(jié)合它們分開時(in isolation)能夠結(jié)合的兩種配體中的一種但不是兩種。此外，在此情況中，重鏈可變域不會與互補輕鏈可變域聯(lián)合，因此可能不太穩(wěn)定且易于解折疊(Wom & Pluckthun,1998Biochemistry 37，13120-7)。如本文中所使用的，術語“抗體”包括包含通過二硫鍵相互連接的四條多肽鏈，即兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個域，即CH1，CH2*CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)?；谄浜愣ㄓ虻陌被嵝蛄?，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白s)的輕鏈可指派至兩種截然不同的型之一，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。κ輕鏈的可變區(qū)在本文中稱作VK。如本文中所使用的，表述VL意圖包括來自κ型輕鏈(VK)和來自λ型輕鏈的可變區(qū)二者。輕鏈恒定區(qū)包含一個域，即CL。VH和 VL區(qū)包括稱作互補決定區(qū)(CDR)的高度變異性的區(qū)域，與稱作框架區(qū)(FR)的更加保守的區(qū)域一起散布。每個VH和VL包含三個⑶R和四個FRs，自氨基末端至羧基末端以如下次序排列FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體可指派至不同類。有五大類完整抗體IgA， IgD, IgE, IgG,和IgM，而且這些中的數(shù)個可進一步分成亞類(同種型)，例如IgGl，IgG2， IgG3，IgG4，IgA,和IgA2。與抗體的不同類對應的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ，μ。 不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構和三維構造是公知的。本發(fā)明包括任何上述類或亞類(同種型)的抗體。如本文中所使用的，術語“抗體”還意圖涵蓋抗體，其消化片段，規(guī)定部分和變體， 包括抗體模擬物或包含抗體中模擬抗體或其規(guī)定片段或部分的結(jié)構和/或功能的部分，包括單鏈抗體及其片段；每一種包含至少一個CDR。功能性片段包括結(jié)合ADAMTS5抗原的抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明涵蓋能夠結(jié)合ADAMTS5或其部分的抗體片段，包括但不限于Fab (例如通過木瓜蛋白酶消化)，facb (例如通過纖溶酶消化)，pFc'(例如通過胃蛋白酶或纖溶酶消化)，F(xiàn)d (例如通過胃蛋白酶消化，部分還原和再聚集)，F(xiàn)v或scFv (例如通過分子生物學技術)片段。抗體片段還意圖包括例如域刪除抗體，雙抗體，線性抗體，單鏈抗體分子，和自抗體片段形成的多特異性抗體。如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”指自基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體， 例如構成群體的抗體個體基本上相同，只是可能有可能存在的天然發(fā)生突變或次要翻譯后變異。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。另外，與通常包括針對不同決定簇 (表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每一種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。修飾語“單克隆”指明抗體自基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的特征，不應解釋為需要通過任何特定方法來生成抗體。本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選通過重組DNA方法來生成，或者通過本文中別處描述的篩選方法來獲得。
如本文中所使用的，術語“單克隆抗體”包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與自特定物種衍生的或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與自另一物種(例如小鼠或大鼠)衍生的或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的對應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)期望的生物學活性(Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括“靈長類化”抗體，其包含自非人靈長類動物(例如，舊世界猴，諸如狒狒，恒河猴或獼猴)衍生的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列(美國專利 No. 5，693, 780)。如此，本發(fā)明包括例如包含嵌合重鏈和/或嵌合輕鏈的嵌合單克隆抗體。嵌合重鏈可包含任何本文所述重鏈可變(VH)區(qū)或其突變體或變體，其與非人或人抗體的重鏈恒定區(qū)融合。嵌合輕鏈可包含任何本文所述輕鏈可變(VL)區(qū)或其突變體或變體，其與非人或人抗體的輕鏈恒定區(qū)融合。如本文中所使用的，術語“人抗體”包括具有與Kabat等人所述人種系免疫球蛋白序列對應的可變和恒定區(qū)的抗體(參見Kabat，et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)。本發(fā)明的人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中，突特別是在CDR3中。人抗體可具有至少一個用不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，例如活性增強性氨基酸殘基置換的位置。在本發(fā)明的語境中，人抗體可具有多至20個用不是人種系免疫球蛋白序列一部分的氨基酸殘基置換的位置。在其它實施方案中，置換多至10個，多至5個，多至3個或多至2個位置。然而， 如本文中所使用的，術語“人抗體”并非意圖包括其中已經(jīng)將自另一哺乳動物物種，諸如小鼠的種系衍生的CDR序列嫁接到人框架序列上的抗體。短語“重組人抗體”包括通過重組手段制備，表達，創(chuàng)建或分離的人抗體，諸如使用轉(zhuǎn)染入宿主細胞中的重組表達載體表達的抗體，自重組，組合人抗體文庫分離的抗體，自對于人免疫球蛋白基因而言轉(zhuǎn)基因的動物分離的抗體，或通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接至DNA序列的任何其它手段制備的，表達的，創(chuàng)建的或分離的抗體。此類重組人抗體具有自人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)(參見Kabat，Ε. Α.，et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。依照本發(fā)明，重組人抗體包括如下人種系免疫球蛋白序列，其已經(jīng)進行過體外誘變(或當使用對于人Ig序列而言轉(zhuǎn)基因的動物時，體內(nèi)體細胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是雖然衍生自且涉及人種系VH和VL序列，但是可能不是天然存在于體內(nèi)人抗體種系全集內(nèi)的序列。在某些實施方案中，然而，此類重組抗體是選擇性誘變辦法或回復突變或二者的結(jié)果。本發(fā)明的抗體可以是分離的抗體。如本文中所使用的，“分離的抗體”包括基本上沒有具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體。此外，分離的抗體可以基本上沒有其它細胞材料和/或化學品。完整抗體包括包含至少兩條重鏈和輕鏈的異多聚體糖蛋白。在IgM之外，完整抗體通常是大約150Kda的異四聚體糖蛋白，包含兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈。通常，每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接至重鏈，而二硫化物連接的數(shù)目不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有可變域(VH)，接著是一些恒定區(qū)。每條輕鏈在其另一端具有可變域(VL)和恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)一起排列，且輕鏈可變域與重鏈的可變域一起排列。基于恒定區(qū)的氨基酸序列，來自大多數(shù)脊椎動物物種的抗體的輕鏈可指派稱作κ和λ的兩種型之一。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，人抗體可指派五種不同的類，即IgA，IgD，IgE，IgG和 IgM0 IgG和IgA可進一步細分成亞類，即IgGl, IgG2，IgG3和IgG4 ；及IgAl和IgA2。小鼠和大鼠的物種變體至少有IgGh，IgG2b?？贵w的可變域以稱作互補決定區(qū)(CDR)的展示特定變異性的某些區(qū)賦予抗體以結(jié)合特異性?？勺儏^(qū)中更加保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。 完整重鏈和輕鏈的可變域每一個包含通過三個⑶R連接的四個FR。每一條鏈中的⑶R由 FR區(qū)極其接近地保持在一起，并與來自另一條鏈的CDR —起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成。恒定區(qū)不直接涉及抗體對抗原的結(jié)合，但是展現(xiàn)多種效應器功能諸如參與抗體依賴性細胞介導的細胞毒性仏00)，經(jīng)由對？(3^受體的結(jié)合的吞噬，經(jīng)由新生兒Fc受體(Fcfoi) 的半衰期/清除速率和經(jīng)由補體級聯(lián)的Clq成分的補體依賴性細胞毒性。人抗體可通過本領域技術人員已知的多種方法來生成。人抗體可使用人骨髓瘤或小鼠-人異源骨髓瘤細胞系通過雜交瘤方法來生成(參見Kozbor J. Immunol 133,3001, (1984)and Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)) 0備選方法包括使用噬菌體文庫或轉(zhuǎn)基因小鼠，二者都利用人 V 區(qū)全集(參見 Winter G, (1994), Annu. Rev. Immunol 12，433-455，Green LL(1999)，J. Immunol. methods231,11-23)。現(xiàn)在可得轉(zhuǎn)基因小鼠的數(shù)個品系，其中它們的小鼠免疫球蛋白基因座已經(jīng)用人免疫球蛋白基因區(qū)段替換(參見 iTomizuka K, (2000)PNAS 97，722-727 ；Fishwild D. M(1996) Nature Biotechnol. 14，845-851，Mendez MJ, 1997, Nature Genetics，15，146-156)。在抗原攻擊時，此類小鼠能夠生成人抗體全集，從中可選擇感興趣抗體。要特別注意Trimera 系統(tǒng)(參見Eren R et al, (1998) Immunology 93 :巧4_161)，其中將人淋巴細胞移植入經(jīng)照射小鼠中，選定淋巴細胞抗體系統(tǒng)(SLAM，參見Babcook et al,PNAS (1996) 93 :7843-7848)， 其中使人(或其它物種)淋巴細胞有效通過大量合并體外抗體生成規(guī)程，接著是解卷積(deconvulated)有限稀釋和選擇規(guī)程和Xenomouse 11 (Abgenix he)。一種使用 Morphodoma 技術的備選辦法可得自Morphotek Inc0噬菌體展示技術可用于生成人抗體(及其片段)，參見McCafferty ；Nature, 348, 552-553(1990)和 Griffiths AD et al (1994) EMBO 13 :3245_3洸0。依照此技術，以符合讀碼框的方式將抗體V域基因克隆入絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因并在噬菌體顆粒的表面上展示(通常借助輔助噬菌體)為功能性抗體片段?；诳贵w功能特性的選擇導致對編碼展現(xiàn)那些特性的抗體的基因的選擇。噬菌體展示技術可用于自文庫選擇抗原特異性抗體，其中文庫自取自罹患上文所述疾病或病癥的個體或未免疫人供體的人B細胞構建(參見Marks J. Mol. Bio. 222，581-597，1991)。在想要包含F(xiàn)c域的完整人抗體的情況中，有必要將噬菌體展示衍生片段再克隆入包含期望恒定區(qū)的哺乳動物表達載體中并建立穩(wěn)定表達細胞系。親和力成熟技術(Marks ；Bio/technol 10，779-783 (1992))可用于改進結(jié)合親和力，其中通過用天然發(fā)生變體序貫置換H和L鏈V區(qū)并基于改善的結(jié)合親和力進行選擇來改進初級人抗體的親和力?，F(xiàn)在還可得此技術的變體諸如“表位印記”，參見WO 93/06213。 還可參見 Waterhouse ；Nucl. Acids Res 21,2265-2266(1993)。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白具有通過結(jié)合常數(shù)(Ka)測量的至少約5X IO4升/摩爾，IX IO5升/摩爾，5X IO5升/摩爾，或IX IO6升/摩爾的親和力。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白以小于約5X 10_4升/秒，IX 10_5升/秒，5X 10_5 升/秒，或1 X 10_6升/秒的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人ADAMTS5的中和性表位。完整非人抗體在治療人疾病或病癥中的使用有可能引起現(xiàn)在完全確立的免疫原性問題，即患者的免疫系統(tǒng)可能將非人完整抗體識別為非自身的并發(fā)起中和應答。這種反應在將非人抗體多次施用于人患者時特別明顯。多年來已經(jīng)開發(fā)了多種技術來克服這些問題，而且一般涉及降低完整抗體中非人氨基酸序列的組成，同時保留相對容易自經(jīng)免疫動物例如小鼠，大鼠或家兔獲得非人抗體。泛泛而言，已經(jīng)使用兩種辦法來實現(xiàn)這一點。第一種是嵌合抗體，其一般包含非人(例如嚙齒動物諸如小鼠)可變域，其與人恒定區(qū)融合。因為抗體的抗原結(jié)合位點位于可變區(qū)內(nèi)，所以嵌合抗體保留其對抗原的結(jié)合親和力，但是獲得人恒定區(qū)的效應器功能且因此能夠?qū)嵤┬鞴δ苤T如上文所述。嵌合抗體通常使用重組DNA方法來生成。使用常規(guī)規(guī)程對編碼抗體的DNA (例如cDNA)分離并測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼本發(fā)明抗體H和L鏈的基因，例如編碼上文所述SEQ. ID. NO 2,3,4, 5，6和7的DNA的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞充當此類DNA的一種典型來源。一旦分離， 將DNA放置入表達載體中，然后轉(zhuǎn)染入在其它情況中不生成免疫球蛋白蛋白的宿主細胞諸如大腸桿菌，COS細胞，CHO細胞或骨髓瘤細胞中以獲得抗體的合成?？赏ㄟ^用人L和H鏈的編碼序列替代對應的非人(例如鼠)H和L恒定區(qū)來修飾DNA，參見例如Morrison ；PNAS 81,6851(1984)。第二種辦法涉及生成人源化抗體，其中通過人源化可變區(qū)來減少抗體的非人內(nèi)容。人源化抗體可通過CDR嫁接來生成。CDR構建接近抗體N端的環(huán)，在那里它們形成在由框架區(qū)提供的支架中安裝的表面?？贵w的抗原結(jié)合特異性主要由其CDR表面的拓撲學和化學特征來限定。這些特征繼而由各個⑶R的構象，⑶R的相對部署，和構成⑶R的殘基的側(cè)鏈的性質(zhì)和部署來決定。通過僅僅將非人(例如鼠)抗體(“供體”抗體)的CDR嫁接到人框架(“受體框架”)和恒定區(qū)上可實現(xiàn)免疫原性的大大降低(參見Jones et al(1986) Nature321,522-525and Verhoeyen M et al (1988) Science 239,1534-1536)。然而，CDR 嫁接本身可能不導致抗原結(jié)合特性的完全保留，而且常常發(fā)現(xiàn)如果要恢復顯著的抗原結(jié)合親和力的話，需要在人源化分子中保留供體抗體的一些框架殘基(有時稱作“回復突變”) (參見 Queen C et al (1989) PNAS 86,10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351， 501-50 。在此情況中，自數(shù)據(jù)庫選擇顯示與非人供體抗體的最大序列同源性的人V區(qū)以提供人框架(F 。人FR的選擇可自人共有或人個體抗體進行。在必要時，將來自供體抗體的關鍵殘基替代入人受體框架中以保留CDR構象。抗體的計算機建?？捎糜趲椭b定此類結(jié)構重要殘基，參見W099/48523。或者，人源化可通過“鑲飾”(veneering)的方法來實現(xiàn)。對獨特人和鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的統(tǒng)計分析揭示了暴露殘基的精確樣式在人和鼠抗體中不同，而且大多數(shù)各個表面位置對少數(shù)不同殘基具有強烈偏愛(參見Indian Ε. A. et al ； (1991)Mol.Immunol. 28，489-498and Pedersen J. Τ. et al (1994) J. Mol. Biol. 235 ；959-973) 因此， 有可能通過置換其框架區(qū)中與在人抗體中找到的不同的暴露殘基來降低非人Fv的免疫原性。因為蛋白質(zhì)抗原性可能與表面可及性有關聯(lián)，所以表面殘基的置換可能足以使得小鼠可變區(qū)對于人免疫系統(tǒng)是“看不見的”(還可參見Mark G.E.et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113 :The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag,ppl05-134)。這種人源化規(guī)程稱作“鑲飾”，因為只改變抗體的表面，支持性殘基保持不變。如此，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合蛋白，其包含至少一個能夠結(jié)合聚集蛋白聚糖酶的第一免疫球蛋白可變域。在一個實施方案中，所述聚集蛋白聚糖酶是人ADAMTS5。在一些情況中，所述抗原結(jié)合蛋白是抗體或其片段。在一些情況中，所述抗體特異性結(jié)合 ADAMTS5。所述抗體可以是單克隆抗體或其片段。在一些情況中，本發(fā)明的單克隆抗體或其片段是小鼠的，嵌合的，人源化的，或完全人的。在另一個實施方案中，所述抗原結(jié)合蛋白包含至少一個互補決定區(qū)。在一些情況中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白是單克隆抗體，其包含重鏈和輕鏈，重鏈包含CDRH1，CDRH2和 ⑶RH3，輕鏈包含⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3，其中重鏈的互補決定區(qū)(OTR)重鏈選自下組與氨基酸序列DAWMD (SEQ ID NO 2)具有至少約80%序列同一性的⑶RHl ；與氨基酸序列EIRHKANDHAIF^(ESVKG(SEQ ID NO :3)具有至少約 70，75，80，85， 90，95，或98%序列同一性的CDRH2 ；禾口與氨基酸序列TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO 4)或 PFAY (SEQ ID NO 5)具有至少約 70，75，80，85，90，95，或 98%序列同一性的 CDRH3 ；且輕鏈的互補決定區(qū)選自下組與氨基酸序列KASQSVGTTIV(SEQ ID NO :6)或RTSENIYSYLA(SEQ ID NO 7)具有至少約 70，75，80，85，90，95，或98%序列同一性的 CDRLl ；與氨基酸序列 NAKTLAE (SEQ ID N0: 8)或SASNRXT(SEQ ID NO 9)具有至少約 70，75，80，85，90，95，或98%序列同一性的CDRL2 ； 禾口與氨基酸序列QQYSSYPFT (SEQ ID NO 10)或 QHHYGTPWT ((SEQ ID NO 11)具有至少約 70，75，80，85，90，95，或 98%序列同一性的 CDRL3。在一個實施方案中，CDRH2與選自 EIRHKANDHAIFYAESVKG (SEQ ID NO 12)， EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG(SEQ ID NO 14), EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO 15), DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO 16),禾口 EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO 17)的氨基酸序列具有至少約 70，75，80，85，90，95，或 98%序列同一性。在一個實施方案中，⑶RH3包含氨基酸序列PFAY(SEQ ID NO :5)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白是單克隆抗體，其包含重鏈和輕鏈， 重鏈包含CDRH1，CDRH2和CDRH3，輕鏈包含CDRL1，CDRL2和CDRL3，其中重鏈的互補決定區(qū) (CDR)重鏈選自CDRHl 是氨基酸序列 DAWMD (SEQ ID NO 2)；CDRH2 選自氨基酸序列 EIRHKANDHAIFYAESVKG (SEQ ID NO :12)， EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG(SEQ ID NO 14), EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO : 15)，DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO :16)，或EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO :17)；和 CDRH3 是 TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO :18)或 PFAY (SEQ ID NO :5)；且輕鏈的互補決定區(qū)選自CDRLl 選自氨基酸序列 KASQSVGT TIV (SEQ ID NO 19)，RTSENIYSYLA (SEQ ID NO 20)，或 KASQNVGTAVV(SEQ ID NO 21)；CDRL2 選自氨基酸序列 NAKTLAE(SEQ ID NO :22)，SASNRHT (SEQ ID NO 23)， SASTRYT (SEQ ID NO 24)，或 SASNRYT (SEQ ID NO 25)；禾口CDRL3 選自氨基酸序列 QQYSSYPFT (SEQ ID NO 26)，QHHYGTPffT (SEQ ID NO 27)， QQYVNYPFT (SEQ ID NO :28)，或 QQYTSYPFT (SEQ ID NO :29)。如此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供包含六個CDR的分離的單克隆抗體，其中 CDRHl 是 DAWMD (SEQ ID NO 2)，CDRH2 是 EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO 13),且 CDRH3 是 TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO 18)且 CDRLl 是 RTSENIYSYLA (SEQ ID NO :20)，CDRL2 是 NAKTLAE (SEQ ID NO :22)，且 CDRL3 是 QHHYGTPWT (SEQ ID NO :27)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供包含六個CDR的分離的單克隆抗體，其中CDRHl是DAWMD (SEQ ID NO 2)，CDRH2 是 EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO :15)，且 CDRH3 是 PFAY (SEQ ID NO 5)且 CDRLl 是 KASQSVGTTIV(SEQ ID NO :19)，CDRL2 是 SASNRHT(SEQ ID NO :23)，且 CDRL3 是 QQYTSYPFT(SEQ ID NO :29)。在又一個實施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白是單克隆抗體，其包含重鏈和輕鏈， 重鏈包含⑶RH1，⑶RH2和⑶RH3，輕鏈包含⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3，其中重鏈的互補決定區(qū) (CDR)選自CDRHl是氨基酸序列DAWMD (SEQ ID NO :2)，其中在一個位置處SEQ ID NO 2的任
何氨基酸用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸， 纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸， 脯氨酸，絲氨酸，?；撬?，和酪氨酸的氨基酸替代；CDRH2 選自氨基酸序列 EIRHKANDHAIFYAESVKG(SEQ ID NO :12)， EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO 13), EIRHKANDYAIFYDESVKG (SEQ ID NO: 14)， EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO : 15)，DIRNTANNHATFYAESVKG(SEQ ID NO :16)，或 EIRHKANDHAIFYDESVKG (SEQ ID NO :17)，其中在一個位置處 SEQ ID NO : 12-17 的任何氨基酸
用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸，脯氨酸，絲氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；且CDRH3 是TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO :18)或PFAY (SEQ ID NO :5)，其中在一個位置
處SEQ ID N0:18和5的任何氨基酸用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸，脯氨酸，絲氨酸，?；撬?，和酪氨酸的氨基酸替代；且輕鏈的互補決定區(qū)選自CDRLl 選自氨基酸序列 KASQSVGTTIV(SEQ ID NO :19)，RTSENIYSYLA (SEQ ID NO: 20)，或KASQNVGTAVV (SEQ ID NO :21)，其中在一個位置處SEQ ID NO :19-21的任何氨基酸
用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸，脯氨酸，絲氨酸，牛磺酸，和酪氨酸的氨基酸替代；CDRL2 選自氨基酸序列 NAKTLAE(SEQ ID NO :22)，SASNRHT (SEQ ID NO 23)， SASTRYT (SEQ ID NO 24)，或SASNRYT (SEQ ID NO :25)，其中在一個位置處SEQ ID NO 22-25
的任何氨基酸用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸，脯氨酸，絲氨酸，?；撬幔屠野彼岬陌被崽娲?；且CDRL3 選自氨基酸序列 QQYSSYPFT(SEQ ID NO :26)，QHHYGTPffT (SEQ ID NO 27), QQYVNYPFT (SEQ ID NO :28)，或 QQYTSYPFT (SEQ ID NO』9)，其中在一個位置處 SEQ ID NO: 26-29的任何氨基酸用選自組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，蘇氨酸，色氨酸，纈氨酸，丙氨酸，精氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，鳥氨酸，脯氨酸，絲氨酸，?；撬?，和酪氨酸的氨基酸替代。在某些實施方案中，NAKTLAE (SEQ ID NO 22)的Thr4是亮氨酸，異亮氨酸或甲硫氨酸。在某些實施方案中，QHHYGTPWT(SEQ ID NO :27)的Hi s3是纈氨酸。在某些實施方案中，QHHYGTPWT(SEQ ID NO :27)的Gly5是色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，或甲硫氨酸。在某些實施方案中，EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO :13)的His9是苯丙氨酸或酪氨酸。在某些實施方案中，TYYYGSSYGYCDV(SEQ ID NO :18)的是苯丙氨酸或酪氨酸。⑶R Ll，L2，L3，Hl和H2趨于在結(jié)構上展示有限數(shù)目的主鏈構象之一。⑶R的特定規(guī)范結(jié)構類由CDR的長度和環(huán)填充二者來限定，由位于CDR和框架區(qū)二者中關鍵位置的殘基來決定(結(jié)構決定殘基或 SDR)。Martin 和 Thornton (1996 J Mol Biol 263 :800-815) 已經(jīng)生成了一種自動化方法來限定“關鍵殘基”規(guī)范模板。使用簇分析來限定CDR套組的規(guī)范類，然后通過分析埋藏的疏水性，成氫鍵殘基，和保守甘氨酸和脯氨酸來鑒定規(guī)范模板。 通過將序列與關鍵殘基模板比較并使用同一性或相似性矩陣為每一種模板打分，可將抗體序列的⑶R指派至規(guī)范類。下文給出了本發(fā)明范圍內(nèi)的CDR規(guī)范的例子。使用的氨基酸編號方式是Kabat。SEQ ID NO :144中所列⑶RHl或其變體的規(guī)范的例子是Ala 32替代為Ile，His， Tyr, Phe, Thr, Asn, Cys, Glu 或 Asp ；Trp 33 替代為 Tyr, Ala, Gly, Thr, Leu 或 Val ；Met 34 替代為 lie，Val 或 iTrp ；及 Asp 35 替代為 His，Glu, Asn, Gin, Ser, Tyr 或 Thr。SEQ ID NO :144中所列⑶RH2，或其變體的規(guī)范的例子是Glu 50替代為Arg或 Gln ；及 Ile 51 替代為 Leu, Val, Thr, Ser 或 Asn.，SEQ ID NO :144中所列CDRH3，或其變體的規(guī)范的例子是Tyrl02替代為His，Val， lie, Ser, Asp 或 Gly0SEQ ID NO :146中所列CDRLl，或其變體的規(guī)范的例子是Ser觀替代為Asn，Asp， Thr 或 Glu ；Val 29 替代為 Ile ；Gly 30 替代為 Asp, Leu, Tyr, Val, lie, Ser, Asn, Phe, His 或 Thr ；Thr 31 替代為 Ser, Asn, Lys 或 Gly ；Thr 32 替代為 Phe, Tyr, Asn, Ala, His, Ser 或 Arg ；IIe 33 替代為 Met，Leu，Val 或 Phe ；及 Val 34 替代為 Ala，Gly，Asn，Ser，His 或 Phe。SEQ ID NO :146中所列CDRL3，或其變體的規(guī)范的例子是Gln 89替代為kr，Gly， Phe 或 Leu ；Gln 90 替代為 Asn 或 His ；Tyr 91 替代為 Asn，Phe，Gly，kr，Arg，Asp，His，Thr 或 Val ；Thr 92 替代為 Asn, Tyr, Trp, Ser, Arg, Gin, His, Ala 或 Asp ；Ser 93 替代為 Gly,Asn, Thr, Arg, Glu, Ala ■ His ；Tyr 94 為 Asp, Thr, Val, Leu, His, Asn, lie, Trp, Pro 或 kr ；及 Phe 96 替代為 Pro，Leu, Tyr, Arg, lie 或 Trp。在其它方面，所述抗原結(jié)合蛋白是Fab或F(ab)2片段。在另一個實施方案中，所述第一免疫球蛋白可變域是單鏈可變域。在本發(fā)明的一個實施方案中，有提供依照本文所述發(fā)明的且包含恒定域區(qū)使得抗體具有降低的ADCC和/或互補活化或效應器功能性的抗體。在一個此類實施方案中，恒定域可包含IgG2或IgG4同種型的天然失能恒定區(qū)或突變型IgGl恒定域。合適修飾的例子記載于EP0307434。一個例子包含位置235和237 (EU索引編號方式)處的丙氨酸殘基的替代。在一個實施方案中，此類抗體包含SEQ ID NO :158的重鏈。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域，抗體VH域包含選自 SEQ ID NO :76,80,116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VL域，抗體VL域包含選自 SEQ ID NO :78，82，130，132，134，和 146 的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域和VL域，抗體VH域包含選自 SEQ ID NO :76,80,116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列，VL域包含選自SEQ ID NO :78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域和VL域，抗體VH域包含 SEQ ID NO 76, VL 域包含 SEQ ID NO :78。在一個實施方案中抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域和VL域，抗體VH域包含 SEQ ID NO 80，VL 域包含 SEQ ID NO :82。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域和VL域，抗體VH域包含選自SEQ ID NO :116，118，120，122，124，126，和128的氨基酸序列，VL域包含選自SEQ ID NO :130，132，和134的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體VH域和VL域，抗體VH域包含選自 SEQ ID NO :136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列，VL 域包含 SEQ ID NO :146。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID NO :68,72,84,86,88,90,92,94,96,104，106，108，110，112，和 158 的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體輕鏈，抗體輕鏈包含選自SEQ ID NO :70，74，98，100，102，和 114 的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含選自 SEQ ID NO :68,72,84,86,88,90,92,94,96,104，106，108，110，112，和 158 的氨基酸序列，抗體輕鏈包含選自SEQ ID NO :70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含SEQ ID NO :68，抗體輕鏈包含SEQ ID NO :70。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含SEQ ID NO 72，抗體輕鏈包含SEQ ID NO :74。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID NO :84，86，88，90，92，94，和96的氨基酸序列，抗體輕鏈包含選自SEQ IDNO 98,100，和102的氨基酸序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白或其片段包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID NO :104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列，抗體輕鏈包含SEQ ID NO :114。本發(fā)明的另一個方面包括與表3所列任一種抗體競爭對ADAMTS5的結(jié)合的抗體。這些包括抗體 1G10. 1C9，2D3. 1D4，3A12. 1D7，5F10. 1H6,11F12. 1D12,12F4. 1H7,和 7B4. IEl 1。在又一個實施方案中，抗原結(jié)合蛋白進一步包含能夠結(jié)合第二抗原的第二免疫球蛋白可變域。第二免疫球蛋白可變域可結(jié)合在施用抗原結(jié)合肽時可以起載體作用的抗原。例如，第二免疫球蛋白可變域可結(jié)合血液蛋白質(zhì)，諸如但不限于人血清清蛋白或運鐵蛋白。另外，第二免疫球蛋白可變域可結(jié)合哺乳動物在與疼痛調(diào)控有關的抗原，諸如但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)，血管活性腸肽(VIP)，和/或TRPVl或其它血管非炎性蛋白樣 (vannilloid)受體。另外，第二免疫球蛋白可變域可結(jié)合與炎性應答和/或自身免疫病有關的細胞因子或細胞因子受體，諸如但不限于制瘤素M(OSM)，TNF-α，IL-6, TRPV4，RANKL 和IL-I。第二抗原也可結(jié)合第二聚集蛋白聚糖酶，諸如但不限于ADAMTS4和/或ADAMTS5， 和/或ADAMTS5和/或多種金屬蛋白酶諸如但不限于ΜΜΡ-13上的第二表位。第二免疫球蛋白可變域也可結(jié)合聚集蛋白聚糖，膠原II，蛋白聚糖或與軟骨有關的其它分子。在本發(fā)明的一個方面，第二免疫球蛋白可變域結(jié)合選自下組的抗原人血清清蛋白，ADAMTS4，NGF， OSM, TNF-α，IL-6, VIP, TRPVl，TRPV4，ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，膠原 II，RANKL，粘結(jié)蛋白聚糖(Syndecan) 4，Hedgehog，和 / 或 IL-1。Delgado, et al. Nature Med. 7，563-568 報告了 VIP 處理遏制促炎性介導物生成， 以及金屬蛋白酶明膠酶(MMP-2)表達。認為MMP-2促成關節(jié)炎小鼠的爪中的關節(jié)破壞。體外研究指示VIP可直接作用于滑膜細胞，盡管間接作用也可經(jīng)由增強的Th2細胞因子生成來介導。無論如何，VIP表現(xiàn)出在CIA小鼠模型中在多個水平影響滑膜功能。該肽遏制Thl 功能但提高Th2功能，可能“再平衡”免疫系統(tǒng)。此外，VIP對巨噬細胞和滑膜細胞具有直接和間接影響，導致降低的IL-1，TNF-α，趨化因子和基質(zhì)降解酶表達，保護關節(jié)完整性。 Firestein Nature Medicine 7,537-538(2001) 血管活性腸肽(VIP)是幾乎20年前在關節(jié)炎患者的滑液中鑒定的，而且此項研究的目的是檢查VIP是否涉及OA疼痛的生成。使用后肢承重作為關節(jié)疼痛的測量，而應用于同側(cè)后爪跖面的von Frey毛發(fā)痛覺計量測試繼發(fā)機械痛覺過敏。關節(jié)內(nèi)注射VIP入正常大鼠膝關節(jié)引起有利于對側(cè)未注射后肢的承重的顯著偏移以及引起同側(cè)爪撤回閾降低。這些疼痛應答通過共施用VPAC受體拮抗劑被阻斷。抑制VIP活性的拮抗劑可證明在緩解OA 疼痛方面是有益的。McDougall, et al. Pain 2006Jul ；123 (1-2) :98_105。神經(jīng)生長因子(NGF)是第一種鑒定出的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，而且它在周圍和中樞神經(jīng)元二者發(fā)育和存活中的作用已經(jīng)較好表征。已經(jīng)顯示了 NGF是周圍交感神經(jīng)元和胚胎感覺神經(jīng)元和基礎前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)育中的一種至關重要的存活和維持因子。Smeyne et al. , Nature 368 :246-249(1994)and Crowley et al.，Cell 76:1001-1011(1994)。NGF 上調(diào)感覺神經(jīng)元中神經(jīng)肽的表達(Lindsay and Harmer, Nature 337:362-364(1989))， 而且它的活性經(jīng)由兩種不同膜結(jié)合受體，即TrkA受體和p75共同神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(有時分別稱作“高親和力”和“低親和力”NGF受體)來介導。Chao et al. , Science 232 518-521 (1986)。關于 NGF 的綜述參見 Huang et al.，Annu. Rev. Neurosci. 24 677-736(2001) ；Bibel et al.，Genes Dev. 14 :2919_2937(2000)。與 trkA 受體的復合物中NGF和NGF的晶體結(jié)構已經(jīng)測定。參見Nature 254:411(1991) ；Nature 401 184-188(1996)。制瘤素M是一種28KDa糖蛋白，屬于白介素6 (IL_6)細胞因子家族，該家族包括 IL-6，白血病抑制因子(LIF)，睫狀節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，心肌營養(yǎng)蛋白_1 (CT-I)和心肌營養(yǎng)蛋白-1樣細胞因子(參見Kishimoto T et al (1995)Blood 86 1243-1254)，它們分享 gpl30 跨膜信號傳導受體(參見Taga T and Kishimoto T (1997) Annu. Rev. Immunol. 15 797-819)。OSM最初是通過它抑制黑素瘤細胞系A375生長的能力而發(fā)現(xiàn)的(參見Malik N(1989)et al Mol Cell Biol 9:2847-2853)。隨后，發(fā)現(xiàn)了更多的效果，而且發(fā)現(xiàn)它是一種多功能介導物，就像IL-6家族的其它成員。OSM由多種細胞類型生成，包括巨噬細胞，活化的T細胞(參見Zarling JM(1986)PNAS(USA)83 :9739_9743)，多形核嗜中性細胞(參見 Grenier A et al (1999)Blood 93 1413-1421)，嗜曙紅細胞(參見 Tamura S et al(2002)Dev.Dyn.225 :327-31)，樹突細胞(參見 Suda T et al (2002) Cytokine 17: 335-340)。它也在胰腺，腎，睪丸，脾胃和腦(參見Znoyko I et al (2005)Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 283 182-186)，和骨髓(參見 Psenak O et al (2003) Acta Haematol 109:68-75)中表達。它的主要生物學效果包括內(nèi)皮的激活(參見Brown TJ et al(1993)Blood 82 :33_7)，急性期應答的激活(參見 Benigni F et al (1996)Blood 87: 1851-1854)，細胞增殖或分化的誘導，炎性介導物釋放和血細胞生成的調(diào)控(參見Tanaka M et al(2003) 102 :3154-3162)，骨的重塑(參見 de Hooge ASK (2002) Am J Pathol 160 1733-1743)，和血管發(fā)生(參見 Vasse M et al (1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol 19 1835-1842)和傷口愈合的促進。稱作腫瘤壞死因子-α的細胞因子(TNFa ；也稱作惡病質(zhì)素)是一種主要由單核細胞和巨噬細胞響應內(nèi)毒素或其它刺激像17kD蛋白亞基的可溶性同三聚體分泌的蛋白質(zhì) (Smith, R. A. et al.，J. Biol. Chem. 262 :6951_6954 (1987))。還已經(jīng)記載了 TNF 的膜結(jié)合 26kD 前體形式(Kriegler, M. et al.，Cell 53:45-53(1988))。越來越多的證據(jù)指明TNF是一種具有多效生物學活性的調(diào)節(jié)性細胞因子。這些活性包括抑制脂蛋白脂肪酶合成(“惡病質(zhì)素”活性)(Beutler, B. et al.，Nature 316 552(1985))，激活多形核白細胞(Klebanoff, S. J. et al.，J. Immunol. 136 4220(1986)； Perussia, B.，et al.，J. Immunol. 138 765 (1987))，抑制細胞生長或刺激細胞生長 (Vilcek, J. et al. , J. Exp. Med. 163 :632 (1986) ；Sugarman, B. J. et al. , Science 230 943 (1985) ；Lachman, L. B. et al.，J. Immunol. 138 2913 (1987))，對某些經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞 ^ M W S3 Ifi^ ffi (Lachman, L. B. et al.，supra ；Darzynkiewicz, Ζ. et al.，Cane. Res. 44 :83(1984))，抗病毒活性(Kohase, Μ. et al.，Cell 45 659(1986) ；Wong，G. H. W. et al.，Nature 323 819(1986)),刺激骨再吸收(Bertolini, D. R. et al.，Nature 319 516(1986) ；Saklatvala, J.，Nature 322 :547 (1986))，刺激膠原酶和前列腺素 E2 生成 (Dayer, J. _M. et al.，J. Exp. Med. 162 =2163(1985))；和免疫調(diào)節(jié)作用，包括激活 T 細胞 (Yokota, S. et al.，J. Immunol. 140 531(1988)), B 細胞(Kehrl，J. H. et al.，J.Exp·Med. 166 786(1987)),單核細胞(Philip, R. et al.，Nature 323 86(1986)),胸腺細胞 (Ranges, G. Ε. et al.，J. Exp. Med. 167 :1472 (1988))，和刺激主要組織相容性復合物(MHC) I 類和 II 類分子的細胞表面表達(Collins，Τ. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 446(1986) ；Pujol-Borrel, R. et al. , Nature 326:304(1987))。白介素-6(IL_6)是一種22至27kDa分泌型糖蛋白，其展現(xiàn)生長刺激想和促炎性活性。IL-6也稱作干擾素- β 2(IFN-i3 2)，IL-1可誘導26_kDa蛋白，肝細胞刺激因子， 細胞毒性T-細胞分化因子，和B-細胞刺激因子(Trikha et al.，Clin. Cancer Res. 9 4653-4665(2003))。IL-6由多種細胞類型分泌。IL-6經(jīng)由結(jié)合高親和力受體復合物來發(fā)揮其活性，該復合物由以低親和力結(jié)合IL-6的膜糖蛋白80kDa成分受體(IL-6R)和自身不結(jié)合IL-6但復合物的IL-6高親和力結(jié)合需要的130kDa信號轉(zhuǎn)導成分(gpl30)組成。 IL-6R能被跨膜金屬蛋白酶切割以生成可溶性IL-6R。RANK是TNF受體超家族的一個成員；它在胞外區(qū)中最密切類似⑶40。與⑶40相似，RANK 聯(lián)合 TRAF2 和 TRAF3 (通過基本上如 Rothe et al.，Cell83 :1243，1995 所述的免疫共沉淀測定法確定的)。TRAF在調(diào)節(jié)免疫和炎性應答中是至關重要的。經(jīng)由它們與TNF 受體超家族的各種成員的聯(lián)合，將信號轉(zhuǎn)導至細胞。該信號導致細胞增殖，分化或凋亡，這取決于觸發(fā)哪種/哪些受體和哪種/哪些TRAF聯(lián)合受體；經(jīng)各種信號傳導事件的協(xié)調(diào)，可將不同信號轉(zhuǎn)導至細胞。如此，經(jīng)由這個家族的一個成員轉(zhuǎn)導的信號可以是增殖性的，分化性的或凋亡性的，這取決于轉(zhuǎn)導至細胞的其它信號和/或細胞的分化狀態(tài)。這種增殖/凋亡途徑的此類精巧調(diào)節(jié)是形成和維持針對病原體的保護所必需的；不平衡可導致自身免疫病。 RANK在上皮細胞，一些B細胞系，和活化的T細胞上表達。然而，它在活化的T細胞上的表達較晚，在活化之后約4天。表達的這種時間過程符合Fas，一種已知的凋亡劑的表達。RANK可以起抗凋亡信號的作用，挽救表達RANK的細胞免于凋亡(已知⑶40那樣做)。 或者，RANK可在適宜情況下確認凋亡信號，再次與⑶40相似。RANK及其配體有可能在調(diào)節(jié)免疫和炎性應答中發(fā)揮整體作用。稱作RANKL的配體是一種2型跨膜蛋白，有小于約50個氨基酸的胞內(nèi)域，跨膜域和約240至250個氨基酸的胞外域。與它所屬TNF家族的其它成員相似，RANKL具有跨膜域和受體結(jié)合域之間的“間隔物”區(qū)，它不是受體結(jié)合必需的。因而，RANKL的可溶性形式可包含整個胞外域或其包括受體結(jié)合區(qū)的片段。TRPV4通道受體是血管非炎性蛋白樣(vanilloid)瞬時受體潛在通道家族的六個已知成員之一，而且在核苷酸水平與TRPV1，即辣椒素受體分享51%同一性。編碼人血管非炎性蛋白樣受體各形式，包括來自人的TRPV4通道受體的多肽和多核苷酸的例子可見于EP 1170365以及WO 00/32766。像其它家族成員一樣，TRPV4通道受體是Ca2+可透過的，非選擇性的，配體門控陽離子通道，其負責各種刺激，諸如降低的摩爾滲透壓濃度，升高的溫度，和小分子配體。參見例如Voets，et al.，J. Biol. Chem. (2002)277 33704-47051 ；ffatanabe,et al.，J. Biol. Chem. (2002)277 :47044_47051 ；Watanabe, et al.，J. Biol. Chem. (2002)277 13569-47051 ；Xu，et al. ,J. Biol. Chem. (2003)278 :11520_11527。根據(jù)對身體組織的篩選， 人TRPV4通道受體在軟骨中最顯著表達。對原代和克隆細胞培養(yǎng)物的篩選顯示僅在軟骨細胞中的顯著表達。
共享共同血管非炎性蛋白樣模塊的辣椒素結(jié)構類似物也引起此類應答。一種此類類似物是仙人掌毒素(RTX)，即大戟屬(Euphorbia)植物的一種天然產(chǎn)物。術語血管非炎性蛋白樣受體(VR)用來描述辣椒素和此類相關刺激性化合物的神經(jīng)元膜識別位點。辣椒素應答受到另一種辣椒素類似物，即抗辣椒堿競爭性抑制(并由此拮抗)，而且也受到非選擇性陽離子通道阻斷劑釕紅抑制。這些拮抗劑以不超過中等的親和力(通常以不低于140 μ M 的Ki值)結(jié)合VR。最近，自背根神經(jīng)節(jié)細胞克隆了辣椒素的大鼠和人受體。此類受體還已經(jīng)稱作 VR1，而且術語“VR1”和“辣椒素受體”在本文中可互換使用，指這種類型的大鼠和/或人受體，以及哺乳動物同系物。已經(jīng)使用沒有這種受體的小鼠確認了 VRl在疼痛感覺中的作用， 該小鼠不展現(xiàn)血管非炎性蛋白樣引起的疼痛行為，且展現(xiàn)受損的對熱和炎癥的應答。辣椒素受體是一種非選擇性陽離子通道，打開閾響應升高的溫度，較低的ΡΗ，和辣椒素受體激動劑而降低。例如，該通道通常在溫度高于約45°C時打開。打開辣椒素受體通道一般繼以自表達該受體的神經(jīng)元和其它附近神經(jīng)元釋放炎性肽，提高疼痛應答。在由辣椒素初始活化之后，辣椒素受體經(jīng)由cAMP依賴性蛋白質(zhì)激酶進行的磷酸化經(jīng)歷快速脫敏。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可通過對人ADAMTS5等于或小于約9. OX ICT9M的解離常數(shù)來表征，在一些情況中它小于或等于約2. δΧΙΟ,Μ?？乖Y(jié)合蛋白對靶物諸如人ADAMTS5 的親和力可通過表面等離振子共振來測量，諸如但不限于BIAC0RE或Octet。BIAcore動力學分析可用于測定抗體或其片段對ADAMTS5抗原的結(jié)合上和下速率。BIAcore動力學分析包括分析ADAMTS5抗原對在其表面上有固定化抗體或其片段的芯片的結(jié)合和解離(參見下文實施例部分)。本發(fā)明還提供阻斷和/或降低ADAMTS5的至少一種活性的抗原結(jié)合蛋白。在一些情況中，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白阻斷和/或降低ADAMTS5對聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374 切割位點處的切割。在一些方面，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白能夠滲透軟骨，甚至在通過非關節(jié)施用路徑施用時。例如，本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，關節(jié)內(nèi)，皮下，口服，鼻內(nèi)，和/或通過腹膜施用來施用。本發(fā)明中還提供編碼本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，分離的多核苷酸編碼如下的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體 VH 域，抗體 VH 域包含選自 SEQ ID NO :76，80，116，118，120，122，124，126，128，136， 138，140，142，和144的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的多核苷酸選自SEQ ID NO 75,79,115，117，119，121，123，125，127，135，137，139，141，143，和 159。在一個實施方案中， 多肽是自表達選自 SEQ ID NO :75，79，115，117，119，121，123，125，127，135，137，139，141， 143，和159的多核苷酸的細胞生成的抗體。在一個實施方案中，分離的多核苷酸編碼如下的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VL域，抗體VL域包含選自SEQ ID NO :78，82，130，132，134，和146的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的多核苷酸選自SEQ ID而77，81，129，131，133，和145。在一個實施方案中，多肽是自表達選自SEQ ID NO :77，81，129，131，133，和145的多核苷酸的細胞生成的抗體。在一個實施方案中，分離的多核苷酸編碼如下的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈，抗體重鏈包含選自 SEQ ID NO =68,72,84,86,88,90,92,94,96,104,106,108,110，112，和158的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的多核苷酸選自SEQ ID NO 67, 71，83，85，87，89，91，93，95，103，105，107，109，111，和 159。在一個實施方案中，多肽是自表達選自 SEQ ID NO 67,71,83,85,87,89,91,93,95,103，105，107，109，111，和 159 的多核苷
酸的細胞生成的抗體。在一個實施方案中，分離的多核苷酸編碼如下的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體輕鏈，抗體輕鏈包含選自SEQ ID而70，74，98，100，102，和114的氨基酸序列。在一個實施方案中，分離的多核苷酸選自SEQ ID NO :69，73，97，99，101，和115。在一個實施方案中，多肽是自表達選自SEQ ID N0:69，73，97，99，101，和115的多核苷酸的細胞生成的抗體。還提供了包含編碼本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸的宿主細胞和自所述宿主細胞表達抗原結(jié)合蛋白的方法。另外，提供了用于生成本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白的方法。生成本發(fā)明載體，宿主細胞和抗體的方法包括使用如下生成的常規(guī)表達載體或重組質(zhì)粒，即將抗體的編碼序列放置成與能夠控制宿主細胞中復制和表達和/或自宿主細胞分泌常規(guī)調(diào)節(jié)調(diào)控序列處于可操作聯(lián)合。調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列，例如CMV啟動子，和信號序列，其可衍生自其它已知抗體。類似地，可生成第二表達載體，其具有編碼互補抗體輕鏈或重鏈的DNA序列。優(yōu)選地，此第二表達載體與第一相同，除了在編碼序列和選擇標志方面，從而確保盡可能功能性表達每一種多肽鏈。或者，改變的抗體的重鏈和輕鏈編碼序列可位于單一載體上。通過常規(guī)技術用第一和第二載體共轉(zhuǎn)染(或僅僅用單一載體轉(zhuǎn)染)選定宿主細胞以創(chuàng)建本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細胞，其包含重組或合成輕鏈和重鏈二者。然后通過常規(guī)技術培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞以生成本發(fā)明的工程化抗體。通過適宜測定法，諸如ELISA或RIA自培養(yǎng)物篩選包括重組重鏈和/或輕鏈二者聯(lián)合的抗體?？刹捎妙愃频某Ｒ?guī)技術來構建其它改變的抗體和分子。適合于本發(fā)明方法中采用的克隆和亞克隆步驟和組合物構建的載體可由本領域技術人員來選擇。例如，可使用常規(guī)PUC系列克隆載體。一種載體，PUC19，可購自供貨商， 諸如 Amersham (Buckinghamshire，United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala，Sweden)。另夕卜，能夠容易復制，具有豐富的克隆位點和選擇基因(例如抗生素抗性)，且易于操作的任何載體可用于克隆。如此，克隆載體的選擇不是本發(fā)明的限制因素。類似地，用于表達抗體的載體可由本領域技術人員自任何常規(guī)載體選擇。載體還含有指導異源DNA序列在選定宿主細胞中復制和表達的選定調(diào)節(jié)序列(諸如CMV或RSV啟動子)。這些載體含有上文所述編碼抗體的DNA序列或改變的免疫球蛋白編碼區(qū)。另外，載體可摻入通過為了易于操作插入期望限制性位點而修飾的選定免疫球蛋白序列。表達載體的特征也可為適合于擴大異源DNA序列表達的基因，例如哺乳動物二氫葉酸還原酶基因(DHFR)。其它優(yōu)選載體序列包括聚A信號序列，諸如來自牛生長激素(BGH) 和β珠蛋白啟動子序列(betaglopro)?？捎糜诒疚牡谋磉_載體可通過本領域技術人員公知的技術來合成。此類載體的成分，例如復制子，選擇基因，增強子，啟動子，信號序列等等，可得自商業(yè)或天然來源，或通過用于指導重組DNA產(chǎn)物在選定宿主中表達和/或分泌的已知規(guī)程來合成。也可為此目的選擇本領域知道的可用于哺乳動物，細菌，昆蟲，酵母，和真菌表達的眾多類型的其它適宜表達載體。本發(fā)明還涵蓋經(jīng)含有抗體或其改變免疫球蛋白分子編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞系?？捎糜谶@些克隆載體的克隆和其它操作的宿主細胞也是常規(guī)的。然而，最想要的是，使用來自各種大腸桿菌菌株的細胞來進行本發(fā)明改變抗體的構建中的克隆載體復制和其它步驟。適合于表達本發(fā)明抗體的宿主細胞或細胞系優(yōu)選是哺乳動物細胞，諸如NS0， Sp2/0，CH0 (例如DG44)，C0S，成纖維細胞細胞(例如3T3)，和骨髓瘤細胞，更優(yōu)選CHO或骨髓瘤細胞?？墒褂萌思毎?，如此能夠用人糖基化樣式修飾分子?；蛘?，可采用其它真核細胞系。合適哺乳動物宿主細胞的選擇和用于轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)，擴增，篩選和產(chǎn)物生成和純化的方法是本領域已知的。參見例如Sambrook et al.，上文引用。細菌細胞可證明可用作適合于表達本發(fā)明重組Fab的宿主細胞(參見例如， Pluckthun, A. , Immunol. Rev.，130 151-188 (1992))。然而，由于在細菌細胞中表達的蛋白質(zhì)趨于未折疊或不正確折疊形式或非糖基化形式，在細菌細胞中生成的任何重組Fab會不得不篩選抗原結(jié)合能力的保留。如果由細菌細胞表達的分子是以正確折疊的形式生成的話，該細菌細胞會是想要的宿主。例如，用于表達的多種大腸桿菌菌株公知是生物技術領域中的宿主細胞?？莶菅挎邨U菌(B. subtilis)，鏈霉菌屬(Str印tomyce)，其它桿菌等等的各種菌株也可用于此方法。在想要時，作為宿主細胞，可用本領域技術人員已知的酵母細胞株，以及昆蟲細胞，例如果蠅屬(Drosophila)和鱗翅目(L印idoptera)和病毒表達系統(tǒng)。參見例如Miller et al.，Genetic Engineering, 8 :277_298，Plenum Press (1986)及其中引用的參考文獻。構建載體的一般方法，生成本發(fā)明宿主細胞需要的轉(zhuǎn)染方法，和自此類宿主細胞生成本發(fā)明抗體必需的培養(yǎng)方法都是常規(guī)技術。通常，本發(fā)明的培養(yǎng)方法是無血清培養(yǎng)方法，通常通過無血清懸浮培養(yǎng)細胞。同樣地，一旦生成，可依照本領域標準規(guī)程自細胞培養(yǎng)內(nèi)容物純化本發(fā)明的抗體，包括硫酸銨沉淀，親和柱，柱層析，凝膠電泳等等。此類技術在本領域技術內(nèi)且不限制本發(fā)明。例如，改變的抗體的制備記載于WO 99/58679和WO 96/16990。表達抗體的有一種方法可利用轉(zhuǎn)基因動物中的表達，諸如記載于美國專利 No. 4，873，316。這涉及使用動物酪蛋白啟動子的表達系統(tǒng)，其在轉(zhuǎn)基因摻入哺乳動物中時允許雌性在其乳汁中生成期望的重組蛋白。在本發(fā)明的又一個方面，有提供生成本發(fā)明抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)經(jīng)編碼本發(fā)明抗體輕鏈和/或重鏈的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞和回收由此生成的抗體的步驟。在一個方面，本發(fā)明提供一種通過提供同時結(jié)合催化和解聯(lián)蛋白域二者的分子來抑制ADAM和ADAMTS活性的方法。在某些實施方案中，ADAMTS是ADAMTS4或ADAMTS5。使用ADAMTS5和ADAMTS5單抗12F4. 1H7和7B4. IEll的分開晶體結(jié)構的計算機結(jié)構“最佳擬合”(bestf fit)計算建模提示ADAMTS5的催化和解聯(lián)蛋白域二者之間的同時抗體/抗原相互作用。ADAM和ADAMTS蛋白酶的催化和解聯(lián)蛋白域由鉸鏈區(qū)分開，其賦予該等域之間的柔性，可以起調(diào)節(jié)功能或容許底物定位至催化位點的作用。在跨越表位的此域處觀察到的高親和力單抗結(jié)合可能一起“鎖定”ADAMTS5的催化和解聯(lián)蛋白域，由此中和酶促活性。在一個實施方案中，所述分子是同時結(jié)合解聯(lián)蛋白和催化域二者的抗體。在另一個實施方案中，所述分子是本發(fā)明的抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明關注中和AMAMTS5 的酶促活性的抗體，且其中所述抗體以通過BiaCore或Octet QK測量的小于約1X10_9或 2X ΙΟ"10的KD同時結(jié)合催化和解聯(lián)蛋白域。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供包含至少一種本文所述抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明還提供至少一種針對ADAMTS5的抗原結(jié)合蛋白在制造用于在人中降低至少一種ADAMTS5活性的藥物中的用途。本發(fā)明提供至少一種針對ADAMTS5的抗原結(jié)合蛋白用于在人中降低至少一種ADAMTS5活性的用途，包括對有所需要的患者施用包含至少一種針對ADAMTS5的抗原結(jié)合蛋白的組合物。本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含第二抗原結(jié)合蛋白。在一些情況中，第二抗原結(jié)合蛋白可以是單克隆抗體。在一個實施方案中，第二單克隆抗體結(jié)合至少一種選自下組的抗原ADAMTS4，ADAMTS5, NGF, OSM, TNF-α，IL-6，VIP, TRPVl, TRPV4, ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，膠原11，RANKL,和/或IL-I。舉例而言，本發(fā)明的藥物組合物可包含第一抗原結(jié)合蛋白和第二單克隆抗體，第一抗原結(jié)合蛋白可以是針對ADAMTS5的單克隆抗體，第二單克隆抗體也可以結(jié)合ADAMTS5。又例如，本發(fā)明的藥物組合物可包含第一抗原結(jié)合蛋白和第二抗原結(jié)合蛋白，第一抗原結(jié)合蛋白是結(jié)合ADAMTS5的單克隆抗體，第二抗原結(jié)合蛋白是結(jié)合下述之一的單克隆抗體ADAMTS4，NGF, OSM, TNF-α，IL-6, VIP, TRPVl, TRPV4, ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，膠原II，RANKLjP /或IL-I。還提供治療有所需要的患者的方法，包括施用至少一劑本發(fā)明的藥物組合物。在一些方面，患者罹患軟骨疾病?；颊呖深净家环N或多種選自下組的疾病癌癥，疼痛，慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，手術后疼痛疼痛，骨關節(jié)炎，運動損傷，侵蝕性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，銀屑病關節(jié)炎，萊姆關節(jié)炎，幼年型關節(jié)炎，強直性脊椎炎，神經(jīng)痛，神經(jīng)病，痛覺，神經(jīng)損傷， 缺血，神經(jīng)變性，炎性疾病，軟骨降解，影響喉，氣管，耳道，椎間盤，韌帶，腱，關節(jié)囊或骨發(fā)育的疾病，椎間盤降解，骨質(zhì)減少，或牙周病，急性關節(jié)損傷，和/或涉及關節(jié)破壞的疾病。 在一些情況中，患者罹患骨關節(jié)炎。在另一個實施方案中，施用至少一劑所述藥物組合物在所述患者中降低軟骨降解。在另一個實施方案中，施用至少一劑所述藥物組合物在所述患者中抑制和/或降低聚集蛋白聚糖切割。本文中還提供藥物組合物，其能夠治療與軟骨降解有關的疾病或減輕由此生成的癥狀且為本文所述方法和用途而進行配制。本發(fā)明提供ADAMTS5抗體，其用于治療軟骨疾病，單獨或與至少一種其它治療劑，包括但不限于至少一種類固醇和/或止痛劑組合施用。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可以在同一劑中或分開地與其它治療劑共施用。本發(fā)明還提供 ADAMTS5抗體或其片段，其用于本文所述所有方法和用途。如本文中所使用的，“患者”指人或其它動物。如本文中所使用的，“治療”意味著(1)改善或預防所治療的狀況或所治療的狀況的一種或多種生物學表現(xiàn)，(2)干預(a)導致或負責所治療的狀況的生物學級聯(lián)中的一個或多個點或(b)所治療的狀況的一種或多種生物學表現(xiàn)，或(3)緩解一種或多種與所治療的狀況有關的癥狀或效應。熟練技術人員會領會“預防”不是一個絕對術語。在醫(yī)學中， “預防”理解為指實質(zhì)性降低狀況或其生物學表現(xiàn)的可能性或嚴重性，或延遲此類狀況或其生物學表現(xiàn)的發(fā)作的藥物的防范性施用。
如本文中所使用的，“安全且有效量”意味著在合理醫(yī)學判斷的范圍內(nèi)至少一種抗原結(jié)合蛋白足以在要治療的狀況中實質(zhì)性誘導積極改變但低得足以避免嚴重副作用(以合理的好處/風險比)的量。至少一種本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白的安全且有效量會隨選擇的特定化合物(例如考慮化合物的效力，功效，和半衰期)；選擇的施用路徑；所治療的狀況；所治療的狀況的嚴重性；所治療的患者的年齡，體型，重量，和體格狀況；要治療的患者的醫(yī)學史；治療的持續(xù)時間；并行療法的性質(zhì)；期望的治療效果；等等因素變化，但是無論如何可以由熟練技術人員常規(guī)確定。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可通過任何合適施用路徑來施用，包括系統(tǒng)施用和表面施用二者。系統(tǒng)施用包括口服施用，胃腸外施用，經(jīng)皮施用，直腸施用，和通過吸入的施用。胃腸外施用指腸以外的施用路徑，經(jīng)皮，或通過吸入，而且通常是通過注射或輸注。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，和皮下注射或輸注，包括關節(jié)內(nèi)施用。吸入指施用入患者的肺，或是經(jīng)由口或是經(jīng)由鼻道吸入。表面施用包括應用于皮膚以及眼內(nèi)，耳，陰道內(nèi)，和鼻內(nèi)施用。本發(fā)明的抗原結(jié)合蛋白可一次性或依照劑量給藥方案施用，其中對于給定時間段以不同時間間隔施用多劑。例如，可以每天施用一次，兩次，三次，或四次劑量。可以施用劑量直至實現(xiàn)期望的治療效果，或無限期地以維持期望的治療效果。適合于本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白的劑量給藥方案取決于該化合物的藥動學特性，諸如吸收，分布，和半衰期，這些可以由熟練技術人員來測定。另外，根據(jù)所治療的狀況，所治療的狀況的嚴重性，所治療的患者的年齡和體格狀況，要治療的患者的醫(yī)學史，并行療法的性質(zhì)，期望的治療效果，熟練技術人員知識和經(jīng)驗內(nèi)的等等因素，對本發(fā)明的化合物施用合適的劑量給藥方案，包括此類方案的持續(xù)時間。此類熟練技術人員會進一步理解，鑒于患者個體對劑量給藥方案的響應或患者個體的需要隨時間變化，合適的劑量給藥方案可能需要調(diào)整。在某些實施方案中，抗體用于將藥物投遞至軟骨。此類藥物可以是聚集蛋白聚糖酶抑制劑，抗炎藥，類固醇或涉及疼痛管理的藥物。因而，在一個方面，本發(fā)明是將藥物投遞至軟骨的方法，包含將藥物連接至本發(fā)明的抗體。此類投遞可以在體外，離體，或在體內(nèi)進行。在另一個實施方案中，抗體用于將會促進新軟骨生長的生長因子投遞至軟骨。此類生長因子包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白，特別是BMP-7。此類投遞可以在體外，離體，或在體內(nèi)進行。
實施例下述實施例例示本發(fā)明的各個方面。實施例1-針對人ADAMTS4和人ADAMTS5的單抗的生成在經(jīng)轉(zhuǎn)染CHO細胞和/或BacMam經(jīng)轉(zhuǎn)導HEK293細胞中生成人ADAMTS5和ADAMTS4 蛋白，并通過常規(guī)層析方法來分離。給SJL小鼠共免疫純化的ADAMTS4(全長的)和ADAMTS5 (截短的，全長的，Cat, Cat/dis域)。在來自連續(xù)采血的血清上測試免疫原性。分離脾細胞和淋巴結(jié)，并使用P3X63/Ag8. 653衍生融合配偶與小鼠骨髓瘤細胞。 生成永生化抗體生成細胞。使用HAT選擇來取消未融合的骨髓瘤細胞。對來自活性培養(yǎng)物的所得雜交瘤上清液篩選對重組人ADAMTS5和ADAMTS4的特異性結(jié)合和中和。對命中鑒定，確認并通過有限稀釋或半固體培養(yǎng)基中的生長克隆至單克隆性。在液體培養(yǎng)中擴大具有期望特征的單克隆抗體，并通過標準層析方法純化抗體。 然后對所得純化的抗體克隆進一步表征結(jié)合親和力和功能效力。實施例2-鼠抗體表征使用體外聚集蛋白聚糖底物切割測定法對ADAMTS5單抗表征中和效力(表1)。使用Octet QK (表1)和BiaCore (可比較的，但未顯示)技術二者對ADAMTS5單抗標準親和力。 還通過 celTRF 和 Octet QK 對抗體測試對人 ADAMTS 1，ADAMTS4, ADAMTS 13，MMPl, MMP3, MMP9和MMP13的交叉反應性，都是陰性的(未顯示)。還通過針對小鼠，犬，和獼猴ADAMTS5 的結(jié)合和中和對所有單抗評估直向同源交叉反應性(表1)。還檢測針對大鼠ADAMTS5的結(jié)合(未顯示)。Octet QK上抗人ADAMTS5單抗的鼠和嵌合形式的親和力比較匯總于表2。表1 純化的抗人ADAMTS5單克隆抗體的表征。
權利要求
1.一種分離的抗原結(jié)合蛋白，其包含至少一個能夠結(jié)合人ADAMTS5的第一免疫球蛋白可變域。
2.權利要求1的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白是抗體或其片段。
3.權利要求1或2的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗體是單克隆抗體或其片段。
4.權利要求3的抗原結(jié)合蛋白，其中所述單克隆抗體或其片段是小鼠的，嵌合的，人源化的，或完全人的。
5.權利要求1至4任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含至少一個互補決定區(qū)。
6.權利要求1至5任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白是包含重鏈和輕鏈的單克隆抗體，重鏈包含⑶RH1，⑶RH2和⑶RH3，輕鏈包含⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3，其中重鏈的互補決定區(qū)(⑶幻選自下組a)與氨基酸序列DAWMD具有至少約80%序列同一性的⑶RHl；b)與氨基酸序列EIRHKANDHAIFTOESVKG具有至少約70%序列同一性的CDRH2；禾口c)與氨基酸序列TYYYGSSYGYCDV或PFAY具有至少約70%序列同一性的CDRH3；且輕鏈的互補決定區(qū)選自下組d)與氨基酸序列KASQSVGTTIV或RTSENIYSYLA的具有至少約70%序列同一性的 CDRLl ；e)與氨基酸序列NAKTLAE或SASNRXT具有至少約70%序列同一性的CDRL2；和f)與氨基酸序列QQYSSYPFT或QHHYGTPWT具有至少約70%序列同一性的⑶RL3。
7.權利要求1至5任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述多肽是包含重鏈和輕鏈的單克隆抗體，重鏈包含⑶RH1，⑶RH2和⑶RH3，輕鏈包含⑶RL1，⑶RL2和⑶RL3，其中重鏈的互補決定區(qū)(CDR)選自(a)CDRHl是氨基酸序列DAWMD ；(b)CDRH2選自氨基酸序列 EIRHKANDHAIFYAESVKG， EIRNKANNHARHYAESVKG， EIRHKANDYAIFYDESVKG, EIRHKANDHAIFYDESVKG,或 DIRNTANNHATFYAESVKG, EIRHKANDHAIFYDESVKG ；禾口(c)CDRH3 是 TYYYGSSYGYCDV 或 PFAY ；且輕鏈的互補決定區(qū)選自(d)CDRLl 選自氨基酸序列 KASQSVGTTIV, RTSENIYSYLA,或 KASQNVGTAW ；(e)CDRL2選自氨基酸序列 NAKTLAE，SASNRHT, SASTRYT，或 SASNRYT ；禾口(f)CDRL3 選自氨基酸序列 QQYSSYPFT, QHHYGTPWT, QQYVNYPFT,或 QQYTSYPFT。
8.權利要求1至7任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中⑶RH3包含氨基酸序列PFAY。
9.權利要求1至8任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述多肽是Fab或F(ab)2片段。
10.權利要求1的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第一免疫球蛋白可變域是單鏈可變域。
11.權利要求1至10任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白進一步包含能夠結(jié)合第二抗原的第二免疫球蛋白可變域。
12.權利要求11的抗原結(jié)合蛋白，其中所述第二免疫球蛋白可變域結(jié)合至少一種選自下組的抗原人血清清蛋白，六0六10^4，呢卩，051\^咿-0，IL-6, VIP, TRPVl, TRPV4, ADAMTS1, 聚集蛋白聚糖，膠原II，RANKL，粘結(jié)蛋白聚糖4，Hedgehog，和/或IL-I。
13.權利要求1至12任一項的抗原結(jié)合蛋白，其特征在于對人ADAMTS5的解離常數(shù) KD (下)等于或小于約2. 5 X 10_1(IM。
14.權利要求1至13任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白阻斷和/或降低 ADAMTS5的至少一種活性。
15.權利要求1至14任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白阻斷和/或降低 ADAMTS5對聚集蛋白聚糖在Glu373-Ala374切割位點處的切割。
16.權利要求1至15任一項的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白在施用于動物時能夠滲透軟骨。
17.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1至16任一項的抗原結(jié)合蛋白。
18.一種宿主細胞，其包含權利要求17的多核苷酸。
19.一種藥物組合物，其包含至少一種權利要求1至16任一項的抗原結(jié)合蛋白。
20.一種藥物組合物，其包含權利要求1至16任一項的第一抗原結(jié)合蛋白和第二單克隆抗體。
21.權利要求20的藥物組合物，其中所述第二單克隆抗體結(jié)合選自下組的抗原 ADAMTS4, ADAMTS5, NGF, OSM, TNF-α，IL-6，VIP, TRPVl, TRPV4, ADAMTS1，聚集蛋白聚糖，膠原 II，RANKL，和 / 或 IL-1。
22.—種治療有所需要的患者的方法，包括將至少一劑權利要求19至21任一項的藥物組合物施用于所述患者。
23.權利要求22的方法，其中所述患者罹患軟骨疾病。
24.權利要求23的方法，其中所述患者罹患至少一種選自下組的疾病癌癥，疼痛，慢性疼痛，神經(jīng)性疼痛，手術后疼痛，骨關節(jié)炎，運動損傷，侵蝕性關節(jié)炎，類風濕性關節(jié)炎，銀屑病關節(jié)炎，萊姆關節(jié)炎，幼年型關節(jié)炎，強直性脊椎炎，神經(jīng)痛，神經(jīng)病，痛覺，神經(jīng)損傷， 缺血，神經(jīng)變性，炎性疾病，軟骨降解，影響喉，氣管，耳道，椎間盤，韌帶，腱，關節(jié)囊或骨發(fā)育的疾病，椎間盤降解，骨質(zhì)減少，或牙周病，急性關節(jié)損傷，和/或涉及關節(jié)破壞的疾病。
25.權利要求對的方法，其中所述患者罹患骨關節(jié)炎。
26.權利要求22至25任一項的方法，其中施用至少一劑所述藥物組合物降低所述患者中的軟骨降解。
27.權利要求22至沈任一項的方法，其中施用至少一劑所述藥物組合物抑制和/或降低所述患者中的聚集蛋白聚糖切割。
28.權利要求22至27任一項的方法，其中所述藥物組合物靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，關節(jié)內(nèi)，皮下，口服，鼻內(nèi)，和/或經(jīng)呼吸吸入器施用。
29.—種分離的單克隆抗體，其包含六個⑶R，其中⑶RHl是DAWMD(SEQ ID NO 2), CDRH2 是 EIRNKANNHARHYAESVKG(SEQ ID NO :1；3)，且 CDRH3 是 TYYYGSSYGYCDV (SEQ ID NO 18)且 CDRLl 是 RTSENIYSYLA (SEQ ID NO 20)，CDRL2 是 NAKTLAE (SEQ ID NO :22)，且 CDRL3 是 QHHYGTPffT(SEQ ID NO 27)。
30.一種分離的單克隆抗體，其包含六個⑶R，其中⑶RHl是DAWMD(SEQ ID NO 2), CDRH2 是 EIRHKANDHAIFYDESVKG(SEQ ID NO :15)，且 CDRH3 是 PFAY(SEQ ID NO 5)且 CDRLl 是 KASQSVGTTIV(SEQ ID NO :19)，CDRL2 是 SASNRHT(SEQ ID NO :23)，且 CDRL3 是 QQYTSYPFT(SEQ ID NO 29)。
31.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與權利要求四或權利要求30的抗體競爭性結(jié)合人ADAMTS5。
32.—種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段以通過結(jié)合常數(shù)(Ka)測量的至少約5X104升/摩爾的親和力結(jié)合人ADAMTS5的中和性表位。
33.權利要求四至31任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包含人恒定區(qū)。
34.權利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其屬于免疫球蛋白IgGl，IgG2，IgG3，IgG4或 IgM 類。
35.權利要求四至34任一項的抗原結(jié)合片段，其中所述片段選自下組Fab，F(xiàn)ab'， F(ab' )2 禾口 Fv0
36.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VH域，抗體VH域包含選自SEQ ID NO 76,80,116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列。
37.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VL域，抗體VL域包含選自SEQ ID NO 78，82，130，132，134，和 146 的氨基酸序列。
38.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含權利要求36的抗體VH域和權利要求37的VL域。
39.權利要求38的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VH域和VL域，VH域包含SEQ ID NO 76, VL 域包含 SEQ ID NO :78。
40.權利要求38的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VH域和VL域，VH域包含SEQ ID NO 80, VL 域包含 SEQ ID NO :82。
41.權利要求38的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VH域和VL域，VH域包含選自 SEQ ID NO 116，118，120，122，124，126，和 128 的氨基酸序列，VL 域包含選自 SEQ ID NO: 130，132，和134的氨基酸序列。
42.權利要求38的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體VH域和VL域，VH域包含選自 SEQ ID NO :136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列，VL 域包含 SEQ ID N0:146。
43.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID NO 68, 72,84,86,88,90,92,94,96,104，106，108，110，112，和 158 的氨基酸序列。
44.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體輕鏈，抗體輕鏈包含選自SEQ ID NO 70, 74，98，100，102，和114的氨基酸序列。
45.一種抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含權利要求43的抗體重鏈和權利要求44的抗體輕鏈，所述重鏈包含選自SEQ的氨基酸序列。
46.權利要求45的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含 SEQ ID NO :68，抗體輕鏈包含 SEQ ID NO :70。
47.權利要求45的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含 SEQ ID NO 72，抗體輕鏈包含 SEQ ID NO :74。
48.權利要求45的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID NO: 84，86，88，90，92，94，和96的氨基酸序列，抗體輕鏈包含選自SEQ ID NO: 98，100，和102的氨基酸序列。
49.權利要求45的抗原結(jié)合蛋白或其片段，其包含抗體重鏈和抗體輕鏈，抗體重鏈包含選自SEQ ID N0:104，106，108，110，112，和158的氨基酸序列，抗體輕鏈包含SEQ ID N0:114。
50.一種分離的多核苷酸，其編碼抗體VH域，抗體VH域包含選自SEQ ID NO =76,80, 116，118，120，122，124，126，128，136，138，140，142，和 144 的氨基酸序列。
51.權利要求50的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自SEQID NO =75,79,115, 117，119，121，123，125，127，135，137，139，141，143，和 159。
52.一種分離的多核苷酸，其編碼抗體VL域，抗體VL域包含選自SEQ ID NO =78,82, 130，132，134，和146的氨基酸序列。
53.權利要求52的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自SEQID NO 77,81,129, 131，133，和 145。
54.一種分離的多核苷酸，其編碼抗體重鏈，抗體重鏈包含SEQ ID NO =68,72,84,86, 88,90,92,94,96,104，106，108，110，112，和 158 的氨基酸序列。
55.權利要求討的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自SEQID NO =67,71,83,85, 87,89,91,93,95,103，105，107，109，111，和 159。
56.一種分離的多核苷酸，其編碼抗體輕鏈，抗體輕鏈包含選自SEQ ID NO =70,74,98, 100，102，和114的氨基酸序列。
57.權利要求56的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自SEQID NO =69,73,97,99, 101，和 115。
58.一種治療有所需要的患者的方法，包括將至少一種權利要求1至16任一項的抗原結(jié)合蛋白施用于所述患者。
59.一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段以小于約5X 10_4升/秒的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合人ADAMTS5的中和性表位。
全文摘要
本文中提供了分離的抗原結(jié)合蛋白，其包含至少一個能夠結(jié)合人ADAMTS5的第一免疫球蛋白可變域。還提供了為單克隆抗體的本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白、包含所述抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物和治療方法。
文檔編號C12P21/08GK102482700SQ201080038528
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權日2009年7月2日
發(fā)明者J.D.拉金, J.R.懷特, M.N.伯登, P.A.哈姆布林 申請人:葛蘭素集團有限公司