人造多肽纖維及其制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的人造多肽纖維為以多肽為主成分的人造纖維，其應(yīng)力為350MPa以上、韌性為138MJ/m3以上。本發(fā)明的人造多肽纖維的制造方法中，所述人造多肽纖維是通過將含有天然型蛛絲蛋白來源的多肽的紡絲液（6）紡絲，進(jìn)行至少兩階段的拉伸而得到的，其中，所述至少兩階段的拉伸包括濕熱下的第一階段拉伸（3）和干熱下的第二階段拉伸（4）。由此，本發(fā)明提供應(yīng)力和斷裂伸長(zhǎng)率適度、韌性高的人造多肽纖維及其制造方法。
【專利說明】人造多肽纖維及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及合成蛋白纖維的一種即人造多肽纖維及其制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛛絲纖維已知是具有高強(qiáng)度和韌性的纖維，其比高強(qiáng)度鋼、尼龍6纖維、芳綸纖維、碳纖維等具有更高的強(qiáng)度和韌性。而且，還具有不以石油為原料、可將原料生物質(zhì)化的優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于人工蛛絲纖維，也提出了一些技術(shù)方案。例如，專利文獻(xiàn)I中提出了將合成蛋白紡絲溶液以5?10 μ 1/min的速度從紡絲頭擠出到由90%甲醇構(gòu)成的凝固浴中制成纖維的方案。專利文獻(xiàn)2中提出了具有Iym以上的直徑和5mm以上的長(zhǎng)度、且具有200MPa或200MPa以上的抗拉強(qiáng)度的纖維。非專利文獻(xiàn)I中公開了在甲醇浴和水浴中以5倍的拉伸倍率進(jìn)行拉伸而得到的強(qiáng)度為1.91?2.26g/d、伸長(zhǎng)率為43.4?59.6%的拉伸絲。非專利文獻(xiàn)2中公開了通過將拉伸倍率設(shè)定為5倍而得到的應(yīng)力為600MPa、伸長(zhǎng)率為25%的拉伸絲。非專利文獻(xiàn)3中公開了使其在蒸汽中滯留5分鐘、拉伸至5倍而得到的應(yīng)力為280?350MPa、伸長(zhǎng)率為30?40%的拉伸絲。
[0003]但是，以往的人造多肽纖維的韌性還不充分，期望有具有更高應(yīng)力的強(qiáng)韌的纖維。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專利文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)1:日本特表2004-503204號(hào)公報(bào)
[0007]專利文獻(xiàn)2:日本特表2009-521921號(hào)公報(bào)
[0008]非專利文獻(xiàn)
[0009]非專利文獻(xiàn)1:Anthoula Lazaris, et.al., “Spider Silk Fiber Spun fromSoluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells，，, Science, 295, p472, 2002 年I月18日
[0010]非專利文獻(xiàn) 2:Xiao_XiaXia, et.al.,，，Native-sized recombinant spider silkprotein produced in metabolically engineered Escherichia coil results in astrong fiber”，PNAS, vol.107，N0.32，pl4059_14063，2010 年 8 月 10 日
[0011]非專利文獻(xiàn)3:Μ.Elice, et.al., “Bioinspired Fibers Follow the Track ofNatural Spider Silk”，Macromolecules, Vol.44, N0.5,pll66_1176,2011 年 4 月 2 日

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
[0013]為了解決上述以往的問題，本發(fā)明提供應(yīng)力和韌性高的人造多肽纖維及其制造方法。
[0014]用于解決課題的手段
[0015]本發(fā)明的人造多肽纖維的特征在于，其為以多肽為主成分的人造纖維，其應(yīng)力為350MPa以上、韌性為138MJ/m3以上。[0016]本發(fā)明的人造多肽纖維的制造方法的特征在于，所述人造多肽纖維是通過將含有天然型蛛絲蛋白(spider silk proteins)來源的多肽的紡絲液紡絲、并至少進(jìn)行兩階段的拉伸而得到的，其中，所述至少兩階段的拉伸包括濕熱下的第一階段拉伸和干熱下的第二階段拉伸。
[0017]發(fā)明效果
[0018]本發(fā)明通過將由人造多肽構(gòu)成的未拉伸纖維在濕熱和干式加熱的至少兩階段下進(jìn)行拉伸，從而能夠提供應(yīng)力和韌性高的人造多肽纖維及其制造方法。即，能夠?qū)崿F(xiàn)應(yīng)力為350MPa以上、韌性為138MJ/m3以上的人造多肽纖維。當(dāng)應(yīng)力高、韌性高時(shí)，對(duì)于與金屬、樹脂、橡膠等的復(fù)合材料來說是有利的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的制造工序的說明圖。
[0020]圖2A-B是表示本發(fā)明的另一實(shí)施例的制造工序的說明圖，圖2A表示紡絲工序-第一階段拉伸工序、圖2B表示第二階段拉伸工序。
[0021]圖3是本發(fā)明的實(shí)施例1中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0022]圖4是本發(fā)明的實(shí)施例2中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0023]圖5是本發(fā)明的實(shí)施例3中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0024]圖6是本發(fā)明的實(shí)施例4中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0025]圖7是本發(fā)明的實(shí)施例5中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0026]圖8是比較例I中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
[0027]圖9是比較例2中得到的纖維的應(yīng)力-變位(變形)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0028](I)多肽
[0029]本發(fā)明的人造多肽纖維以多肽為主成分。本發(fā)明中，主成分是指含有80質(zhì)量％以上，更優(yōu)選含有90質(zhì)量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選含有95質(zhì)量％以上。需要說明的是，本發(fā)明的人造多肽纖維在不損害本發(fā)明效果的范圍內(nèi)還可以含有除多肽以外的其它成分。本發(fā)明中，作為原料，優(yōu)選使用天然型蛛絲蛋白來源的多肽。天然型蛛絲蛋白來源的多肽包括天然型蛛絲蛋白的突變體、類似物或衍生物等。所述多肽只要是天然型蛛絲蛋白來源的即可，沒有特殊限定。所述多肽從強(qiáng)韌性優(yōu)異的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為由蜘蛛的大壺狀腺產(chǎn)生的大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽。作為所述大吐絲管拖絲蛋白，可列舉出Nephila clavipes來源的大壺狀腺絲蛋白(spidroin) MaSp1、MaSp2、Araneus diadematus 來源的 ADF3、ADF4 等。所述大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽包括大吐絲管拖絲蛋白的突變體、類似物或衍生物等。
[0030]作為所述大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽，可列舉出包含2個(gè)以上、優(yōu)選5個(gè)以上、更優(yōu)選10個(gè)以上的式1:REP1-REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元的多肽?；蛘?，所述大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽也可以為下述多肽:包含式1:REP1-REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元、且C末端序列為序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列或與序列編號(hào)I?3中任一個(gè)所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。需要說明的是，所述大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽中，式(I):REP1-REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元可以相同也可以不同。這里，[REP1-REP2 (I)]所示的氨基酸序列的單元不同包括REPl不同的情況、REP2不同的情況、REPl和REP2的任一個(gè)均不同的情況。上述大吐絲管拖絲蛋白來源的多肽在以大腸桿菌等微生物為宿主進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)時(shí)，從生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，分子量?jī)?yōu)選為300kDa以下、更優(yōu)選為200kDa以下、進(jìn)一步優(yōu)選為150kDa以下。
[0031]所述式(I)中，REPl為選自丙氨酸和甘氨酸中的至少一種氨基酸連續(xù)地排列2?20個(gè)殘基、更優(yōu)選3?16個(gè)殘基、進(jìn)一步優(yōu)選4?12個(gè)殘基、最優(yōu)選5?8個(gè)殘基的氨基酸序列。所述式(I)中，REP2為由2?200個(gè)殘基、更優(yōu)選10?150個(gè)殘基、進(jìn)一步優(yōu)選20?100個(gè)殘基、最優(yōu)選20?75個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸的總殘基數(shù)相對(duì)于氨基酸殘基數(shù)整體為40%以上、優(yōu)選為60%以上、更優(yōu)選為70%以上。
[0032]大吐絲管拖絲中，上述REPl相當(dāng)于纖維內(nèi)形成結(jié)晶β折疊的結(jié)晶區(qū)域，上述REP2相當(dāng)于纖維內(nèi)更具有柔軟性且大部分缺乏整齊排列結(jié)構(gòu)的無定型區(qū)域。并且，上述[REP1-REP2]相當(dāng)于由結(jié)晶區(qū)域和無定型區(qū)域構(gòu)成的重復(fù)區(qū)域(反復(fù)序列)，該[REP1-REP2]為拖絲蛋白的特征性序列。
[0033]序列編號(hào)I所示的氨基酸序列與由ADF3 (G1: 1263287、NCBI)的氨基酸序列的C末端的50個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列相同，序列編號(hào)2所示的氨基酸序列與從序列編號(hào)I所示的氨基酸序列的C末端去除了 20個(gè)殘基后的氨基酸序列相同，序列編號(hào)3所示的氨基酸序列與從序列編號(hào)I所示的氨基酸序列的C末端去除了 29個(gè)殘基后的氨基酸序列相同。
[0034]作為包含上述式1:REP1_REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元、且C末端序列由序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列或與序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，可以使用例如由序列編號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。由序列編號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽是在N末端添加有由起始密碼子、HislOtag和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列(序列編號(hào)為7)的ADF3的氨基酸序列中發(fā)生了下述變異的多肽:第I?13號(hào)的反復(fù)區(qū)域增加至約2倍，并且翻譯在第1154號(hào)氨基酸殘基處終止。由序列編號(hào)4所示的氨基酸序列構(gòu)成的多肽中，C末端序列與序列編號(hào)3所示的氨基酸序列相同。
[0035]另外，作為包含所述式1:REP1_REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元、且C末端序列由序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列或與序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，可以使用由序列編號(hào)4所示的氨基酸序列中I個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、缺失、插入和/或添加而成的氨基酸序列構(gòu)成，且具有由結(jié)晶區(qū)域和無定型區(qū)域構(gòu)成的重復(fù)區(qū)域的蛋白。本發(fā)明中，“I個(gè)或多個(gè)”是指例如I?40個(gè)、I?35個(gè)、I?30個(gè)、I?25個(gè)、I?20個(gè)、I?15個(gè)、I?10個(gè)、或I個(gè)或數(shù)個(gè)。另夕卜，本發(fā)明中，“I個(gè)或數(shù)個(gè)”是指I?9個(gè)、I?8個(gè)、I?7個(gè)、I?6個(gè)、I?5個(gè)、I?4個(gè)、I?3個(gè)、I?2個(gè)或I個(gè)。
[0036]上述多肽可使用用含有編碼多肽的基因的表達(dá)載體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的宿主來制造。基因的制造方法沒有特別限制，將編碼天然型蛛絲蛋白的基因從蜘蛛來源的細(xì)胞通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等擴(kuò)增進(jìn)行克隆，或者化學(xué)地合成。基因的化學(xué)合成方法也沒有特別限制，例如，可以以從NCBI的web數(shù)據(jù)庫(kù)等獲得的天然型蛛絲蛋白的氨基酸序列信息為基礎(chǔ)，將利用 AKTA oligopilot plusl0/100 (GE Healthcare Japan 株式會(huì)社)等自動(dòng)合成的寡核苷酸通過PCR等連接來合成。此時(shí)，由于容易進(jìn)行蛋白的精制、確認(rèn)，因此也可以合成編碼由在上述氨基酸序列的N末端添加了由起始密碼子和HislOtag構(gòu)成的氨基酸序列而成的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白的基因。作為上述表達(dá)載體，可以使用能夠從DNA序列表達(dá)蛋白的質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。作為上述質(zhì)粒型表達(dá)載體，只要在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)目標(biāo)基因、且自身能夠進(jìn)行擴(kuò)增即可，沒有特殊限定。例如作為宿主使用大腸桿菌Rosetta (DE3)時(shí)，可以使用pET22b ( + )質(zhì)粒載體、pCold質(zhì)粒載體等。其中，從蛋白的生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用pET22b ( + )質(zhì)粒載體。作為上述宿主，例如可以使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物等。
[0037](2)紡絲液
[0038]紡絲液(膠漿液)通過在上述多肽中加入溶劑并調(diào)節(jié)到可紡絲的粘度來制作。
[0039]溶劑只要能夠?qū)⑸鲜龆嚯娜芙鈩t可以是任何溶劑。例如當(dāng)上述多肽為Araneusdiadematus來源時(shí)，作為一個(gè)例子，將含有六氟異丙醇(HFIP)、六氟丙酮(HFA)、甲酸、尿素、胍、十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化鋰、氯化鈣、硫氰酸鋰等的水溶液等作為溶劑，適量加入，將溶液粘度調(diào)節(jié)至100?lOOOOcP (厘泊)。將其作為紡絲液。
[0040](3)紡絲
[0041]紡絲采用濕式紡絲。由此，將溶解有聚合物的溶劑除去(也稱為脫溶劑)，得到未拉伸絲。濕式紡絲中使用的凝固液只要是能夠脫溶劑的溶液則可以是任何凝固液。當(dāng)溶劑為HFIP時(shí)，凝固液優(yōu)選使用甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子數(shù)為I?5的低級(jí)醇或丙酮。凝固液的溫度優(yōu)選為O?30°C。當(dāng)在上述范圍內(nèi)時(shí)，紡絲穩(wěn)定。將上述紡絲液擠出到凝固液中，由此得到未拉伸絲。在為具有直徑為0.1?0.6mm的噴嘴的注射泵的情況下，擠出速度優(yōu)選每孔為0.2?2.4ml/h。在該范圍內(nèi)時(shí)，紡絲穩(wěn)定。進(jìn)一步優(yōu)選的擠出速度為每孔為0.6?
2.2ml/ho凝固液槽的長(zhǎng)度為200?500mm、未拉伸絲的牽引速度優(yōu)選為I?3m/min、滯留時(shí)間優(yōu)選為0.01?0.15min。在該范圍內(nèi)時(shí)，脫溶劑的效率高。凝固液中，可進(jìn)行拉伸(前拉伸)，但若考慮低級(jí)醇的蒸發(fā)，優(yōu)選將凝固液維持在低溫，以未拉伸絲的狀態(tài)牽引。
[0042](4)拉伸
[0043](a)多段拉伸的作用功能
[0044]拉伸分至少兩階段進(jìn)行。當(dāng)然也可采用3段以上的多段拉伸。本發(fā)明中，采用兩階段以上的多段拉伸的理由非要進(jìn)行描述的話在于，天然型蛛絲蛋白來源的多肽的分子難以取向，通過多段地進(jìn)行拉伸，使分子多段地取向，還能夠提高總拉伸倍率，結(jié)果得到韌性高的纖維。
[0045](b)多段拉伸的內(nèi)容
[0046]所述至少兩階段的拉伸包括濕熱下的第一階段拉伸和其后的干熱下的第二階段拉伸。濕熱下的第一階段拉伸也可以在上述凝固液中進(jìn)行。當(dāng)采用3段以上的多段拉伸時(shí)，可以采用將濕熱的第一階段拉伸分為兩階段和/或?qū)⒏蔁岬牡诙A段拉伸分為兩階段等的方法。第一階段拉伸的濕熱可以在溫水中加熱也可以用蒸汽加熱。溫水中還可以加入有機(jī)溶劑等。該多段拉伸也可以在拉伸工序的任意階段追加除濕熱或干熱以外的拉伸方法。
[0047](c)第一階段和第二階段的拉伸條件
[0048]第一階段拉伸優(yōu)選將未拉伸絲在50?90°C的溫水下拉伸2?8倍。如此，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的拉伸。第二階段拉伸優(yōu)選在170°C?270°C的干熱下拉伸1.25?3倍。由此得到高韌性的拉伸絲。上述中，第一階段拉伸進(jìn)一步優(yōu)選將未拉伸絲在75?85°C的溫水中拉伸。第一階段拉伸的拉伸倍率進(jìn)一步優(yōu)選為2.3?7倍。第二階段拉伸進(jìn)一步優(yōu)選180°C?230°C的干熱。第二階段拉伸的拉伸倍率進(jìn)一步優(yōu)選為1.35?3倍。為了提高拉伸絲的韌性并穩(wěn)定地得到拉伸絲，總拉伸倍率優(yōu)選為超過5倍且在20倍以下、進(jìn)一步優(yōu)選為6倍?11倍。關(guān)于干熱，作為一個(gè)例子使用電管狀爐或熱板。
[0049](d)連續(xù)工序
[0050]從紡絲到拉伸可以為連續(xù)工序，也可以分為任意的工序?qū)嵤?。圖1為表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的制造工序的說明圖。圖1表示連續(xù)工序。紡絲拉伸裝置10包括擠出工序1、未拉伸絲制造工序2、濕熱拉伸工序3、干熱拉伸工序4。紡絲液6貯藏在貯存槽7、從齒輪泵8擠出到紡絲頭9。在Labscale中，可以將紡絲液充填到滾筒中，用注射泵從噴嘴擠出。被擠出的紡絲液具有空隙19地或直接供給至凝固液槽20的凝固液11內(nèi)，將溶劑除去。接著，供給至拉伸浴槽21內(nèi)的溫水12內(nèi)，進(jìn)行第一階段拉伸。拉伸由供給夾持輥13與牽引夾持輥14的速度比決定。接著，供給至干熱拉伸裝置17。在絲道22內(nèi)進(jìn)行第二階段拉伸，制成卷絲體5。拉伸由供給夾持輥15與牽引夾持輥16的速度比決定。18a?18f為導(dǎo)絲器。
[0051](e)分離工序
[0052]圖2A-B為將本發(fā)明的另一實(shí)施例的制造工序分離的例子的說明圖。圖2A表示紡絲工序30和第一階段拉伸工序40、圖2B表示第二階段拉伸工序50。各工序中，還可以將絲卷取或不卷取地留存在容器中。紡絲工序30中，將紡絲液32預(yù)先加入微型注射器31內(nèi)，用注射泵使其沿箭頭P方向移動(dòng)，將紡絲液32從噴嘴33擠出，供給至凝固液槽34內(nèi)的凝固液35中，制成未拉伸絲36。然后，在第一階段拉伸工序40中，將未拉伸絲36供給至拉伸浴槽37內(nèi)的溫水38內(nèi)，進(jìn)行第一階段拉伸，制成第一階段拉伸絲的卷絲體39。拉伸由供給夾持輥41與牽引夾持輥42的速度比決定。接著，從卷絲體39牽出第一階段拉伸絲，供給至干熱拉伸裝置43，在絲道47內(nèi)進(jìn)行第二階段拉伸。拉伸由供給夾持輥45與牽引夾持輥46的速度比決定。接著,將拉伸絲卷取成卷絲體44。
[0053]如此得到人造多肽纖維。得到的人造多肽纖維的應(yīng)力為350MPa以上、韌性為138MJ/m3以上。韌性由測(cè)定纖維的強(qiáng)伸長(zhǎng)率時(shí)的應(yīng)力-變形曲線(SS曲線)的積分值算出。圖3為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中得到的纖維的韌性的說明圖，表示應(yīng)力-變位(變形)曲線與韌性(斜線部)?？芍獞?yīng)力與斷裂伸長(zhǎng)率這兩者高，以及韌性也高。
[0054]本發(fā)明的人造多肽纖維優(yōu)選的應(yīng)力為400MPa以上、更優(yōu)選為590MPa以上、特別優(yōu)選為620MPa以上。優(yōu)選的斷裂伸長(zhǎng)率為39%以上、更優(yōu)選為45%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為50%以上。優(yōu)選的韌性為170MJ/m3以上、更優(yōu)選為240MJ/m3以上、進(jìn)一步優(yōu)選為260MJ/m3以上。本發(fā)明的人造多肽纖維的優(yōu)選的初始彈性模量為SGPa以上、更優(yōu)選為14GPa以上、進(jìn)一步優(yōu)選為16GPa以上。
[0055]本發(fā)明的人造多肽纖維的直徑優(yōu)選為5?100 μ m的范圍。當(dāng)在上述范圍內(nèi)時(shí)，可穩(wěn)定地得到拉伸纖維。更優(yōu)選的纖維直徑為7?30 μ m的范圍、進(jìn)一步優(yōu)選為8?25 μ m的范圍。另外，本發(fā)明的人造多肽纖維的纖維直徑均勻，纖維直徑的波動(dòng)率優(yōu)選為5%以下。當(dāng)對(duì)纖度(單位:tex或deci tex)進(jìn)行計(jì)算時(shí),纖維截面為圓形時(shí)，由基于纖維直徑計(jì)算的截面積、比重和長(zhǎng)度算出。需要說明的是，本發(fā)明的人造多肽纖維由于通過濕式紡絲而得至IJ，因此截面并不限于圓形，包括各種形狀，因此纖維直徑(平均直徑)是指將截面假定為圓形時(shí)的平均直徑。
[0056]所述多肽優(yōu)選為十字園蛛(Araneus diadematus)的兩種主要的拖絲蛋白之一即ADF3來源的多肽。作為該多肽的優(yōu)點(diǎn)，可列舉出強(qiáng)伸長(zhǎng)率和韌性基本上都高，且易于合成。
[0057]所述人造多肽纖維的雙折射率Λη (Χ1000)優(yōu)選為15.6以上。需要說明的是，雙折射率與雙折射度相同。雙折射率可以用Olympus公司制的偏光顯微鏡并使用稱為塞納蒙(Senarmont)的補(bǔ)償器來測(cè)定。測(cè)定范圍為O?546nm (O?I λ )、通過計(jì)算An=R/直徑來求出。上文中，R為用塞納蒙的補(bǔ)償器測(cè)定的延遲量(nm)。雙折射率Λn (XlOOO)為15.6以上表示分子的取向得以進(jìn)行。
[0058]本發(fā)明的人造多肽纖維可以在拉伸后使絲蛋白纖維內(nèi)的多肽分子間發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。多肽中，可用于交聯(lián)的官能團(tuán)有例如氨基、羧基、巰基、羥基等，但并不限定于這些。多肽中所含的賴氨酸側(cè)鏈的氨基可通過與谷氨酸或天冬氨酸側(cè)鏈的羧基脫水縮合而通過酰胺鍵交聯(lián)。交聯(lián)可以在真空加熱下進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，也可以利用碳二亞胺等脫水縮合劑使其交聯(lián)。另外，還可以使用戊二醛等交聯(lián)劑。另外，還可以利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等酶進(jìn)行交聯(lián)。作為一個(gè)例子，可以利用碳二亞胺、戊二醛等交聯(lián)劑使其發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。碳二亞胺用通式R1N=C=NR2 (其中，R1、R2表示包含碳原子數(shù)為I?6的烷基、環(huán)烷基的有機(jī)基團(tuán)。)表示，具體的化合物有1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N，N’ - 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)U-環(huán)己基-3- (2-嗎啉代乙基)碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺(DIC)等。其中，EDC、DIC的肽鏈的酰胺鍵形成能力高、易于發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，因此優(yōu)選。交聯(lián)處理優(yōu)選在對(duì)拉伸絲賦予交聯(lián)劑后在真空加熱干燥下進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)劑可以將100%的交聯(lián)劑賦予纖維，也可以在用碳原子數(shù)為I?5的低級(jí)醇或緩沖液等稀釋后以0.005?10質(zhì)量％的濃度賦予纖維。處理?xiàng)l件優(yōu)選溫度為20?45°C、3?42小時(shí)。通過交聯(lián)劑的交聯(lián)處理，人造多肽拉伸纖維的應(yīng)力(強(qiáng)度)進(jìn)一步提高。
[0059]實(shí)施例
[0060]以下使用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體的說明。需要說明的是，本發(fā)明并不受下述的實(shí)施例的限定。
[0061](實(shí)施例1?5、比較例I?2)
[0062]<基因合成>
[0063](I) ADF3Kai 基因的合成
[0064]從NCBI的web數(shù)據(jù)庫(kù)獲得作為十字園蛛的兩種主要的拖絲蛋白之一的ADF3(GI:1263287)的部分氨基酸序列，委托GenScript公司合成編碼在該序列的N末端添加了由起始密碼子、HislOtag和HRV3C蛋白酶(人鼻病毒3C蛋白酶)識(shí)別位點(diǎn)構(gòu)成的氨基酸序列(序列編號(hào)7)的氨基酸序列(序列編號(hào)5)的基因。其結(jié)果，獲得了由序列編號(hào)8所示的堿基序列構(gòu)成的導(dǎo)入了 ADF3Kai基因的pUC57載體(基因在5’末端緊接的上游具有NdeI位點(diǎn)、和在5’末端緊接的下游具有XbaI位點(diǎn))。其后，用NdeI和EcoRI對(duì)該基因進(jìn)行限制性酶處理，重組到pET22b ( + )表達(dá)載體中。
[0065](2) ADF3Kai_Large 基因的合成
[0066]以ADF3Kai為模板，使用T7啟動(dòng)子引物(序列編號(hào)11)和R印XbaI引物(序列編號(hào)12)進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)ADF3Kai的基因序列中的5’側(cè)一半的序列(以下記為序列A。)進(jìn)行擴(kuò)增，將該片段重組到預(yù)先使用Mighty Cloning Kit (Takara Bio株式會(huì)社制)用NdeI和XbaI進(jìn)行了限制性酶處理的PUC118載體中。同樣地，以ADF3Kai為模板，使用XbaIR印引物(序列編號(hào)13)和T7終止子引物(序列編號(hào)14)進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)ADF3Kai的基因序列中3’側(cè)一半的序列(以下記為序列B。)進(jìn)行擴(kuò)增，將該片段重組到預(yù)先使用Mighty CloningKit (Takara Bio株式會(huì)社制)用Xba1、EcoRI進(jìn)行了限制性酶處理的pUC118載體中。將導(dǎo)入了序列A的pUC118載體用Nde1、XbaI進(jìn)行限制性酶處理，將導(dǎo)入了序列B的pUC118載體用Xbal、EcoRI進(jìn)行限制性酶處理，利用凝膠的分離對(duì)序列A和序列B的目標(biāo)DNA片段進(jìn)行精制。使DNA片段A、B與預(yù)先用NdeI和EcoRI進(jìn)行了限制性酶處理的pET22b ( + )進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。利用使用了 T7啟動(dòng)子引物和T7終止子引物的克隆PCR，在確認(rèn)了目標(biāo)DNA片段插入后，將目標(biāo)大小(3.6kbp)的條帶從得到的克隆提取質(zhì)粒，通過使用了 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)的序列反應(yīng)對(duì)全堿基序列進(jìn)行確認(rèn)。其結(jié)果，確認(rèn)構(gòu)建了序列編號(hào)9所示的ADF3Ka1-Large基因。需要說明的是，ADF3Ka1-Large的氨基酸序列如序列編號(hào)6所示。
[0067](3) ADF3Ka1-Large-NRSHl 基因的合成
[0068]以導(dǎo)入了上述中得到的ADF3Kai_Large基因的pET22b ( + )載體為模板，通過使用了 Prime Star Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio 株式會(huì)社制)的部位特異性變異導(dǎo)入，使ADF3Ka1-Large的氨基酸序列(序列編號(hào)6)中的與第1155號(hào)氨基酸殘基甘氨酸(Gly)對(duì)應(yīng)的密碼子GGC變異為終止密碼子TAA，在pET22b ( + )上構(gòu)建序列編號(hào)10所示的ADF3Ka1-Large-NRSHl基因。關(guān)于變異導(dǎo)入的準(zhǔn)確性，通過使用了 3130x1Genetic Analyzer (Applied Biosystems)的序列反應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。需要說明的是，ADF3Ka1-Large-NRSHl的氨基酸序列如序列編號(hào)4所示。
[0069]〈蛋白的表達(dá)〉
[0070]將包含上述得到的ADF3Ka1-Large_NRSHl的基因序列的pET22b( + )表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中。將得到的單克隆在含有氨芐青霉素的2mL的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí)后，將該培養(yǎng)液1.4ml添加到含有氨芐青霉素的140mL的LB培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至培養(yǎng)液的0D_達(dá)到3.5。接著，將OD6tltl為3.5的培養(yǎng)液與50%葡萄糖140mL —起加入到含有氨芐青霉素的7L的2XYT培養(yǎng)基中進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)，直至0D_達(dá)到4.0。其后，向得到的0D_為4.0的培養(yǎng)液中添加異丙基-β -硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)使終濃度達(dá)到0.5mM，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。在IPTG添加后的2小時(shí)時(shí)，將培養(yǎng)液離心分離，回收菌體。將由IPTG添加前和IPTG添加后的培養(yǎng)液制備的蛋白溶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果觀察到依賴于IPTG添加的目標(biāo)大小(約101.1kDa)的條帶，從而確認(rèn)了目標(biāo)蛋白表達(dá)。
[0071]〈精制〉
[0072]將在IPTG添加2小時(shí)后回收的菌體用20mM Tris-HCl緩沖液(pH為7.4)洗滌。將洗滌后的菌體懸浮于含有約ImM的PMSF的20mM Tris-HCl緩沖液(pH為7.4)中，用高壓勻漿機(jī)(GEA Niro Soavi公司)使細(xì)胞破碎。將破碎的細(xì)胞離心分離，得到沉淀物。將得到的沉淀物用20mM Tris-HCl緩沖液(pH為7.4)洗滌直至達(dá)到高純度。將洗滌后的沉淀物用 7.5M Urea DB 緩沖液(7.5M 尿素、IOmM 磷酸二氫鈉、20mMNaCl、ImM Tris-HCl、pH為7.0)溶解，用攪拌器攪拌，然后使用透析管(三光純藥株式會(huì)社制的纖維素管36/32)用水進(jìn)行透析。將透析后得到的白色的凝集蛋白通過離心分離回收，用凍干機(jī)除去水分，回收凍干粉末。得到的凍干粉末中的目標(biāo)蛋白(約101.1kDa)的精制度通過采用Totallab(nonlinear dynamics ltd.)對(duì)粉末的聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果進(jìn)行圖像分析來確認(rèn)。其結(jié)果，ADF3Ka1-Large-NRSHl的精制度為約85%。
[0073](4)紡絲液(膠漿液)
[0074]向凍干粉末中添加六氟異丙醇(HFIP)，使凍干粉末的濃度達(dá)到8.1質(zhì)量％。用旋轉(zhuǎn)器溶解14小時(shí)，然后除去廢物和泡。溶液粘度為1200cP (厘泊)。將其作為紡絲液(膠漿液)。
[0075](5)紡絲工序-第一階段拉伸工序
[0076]從紡絲工序到拉伸工序使用圖2A-B所示的方法。將紡絲液填充到滾筒中，使用注射泵從0.2_直徑的噴嘴擠出至100質(zhì)量％甲醇凝固液中，制作未拉伸絲。使擠出速度為
1.8ml/h、使凝固液槽的長(zhǎng)度為400mm。接著，作為第一階段拉伸，將未拉伸絲在80°C的溫水中拉伸2.3~7倍，使卷取速度為2.3~3.6m/min。
[0077](6)第二階段拉伸工序
[0078]作為第二階段拉伸，可知用180~220°C的干熱板拉伸1.4~2.96倍時(shí)，得到了高韌性的拉伸絲。各實(shí)施例和各比較例采 用下述表1的條件。
[0079]表1
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種人造多肽纖維，其特征在于，其是以多肽為主成分的人造纖維，其應(yīng)力為350MPa以上、韌性為138MJ/m3以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人造多肽纖維，其中，所述多肽為天然型蛛絲蛋白來源的多肽，其包含式1:REP1-REP2 (I)所示的氨基酸序列的單元，所述式(I)中，REPl為選自丙氨酸和甘氨酸中的至少一種氨基酸連續(xù)地排列2?20個(gè)殘基的氨基酸序列；REP2為由2?200個(gè)殘基的氨基酸構(gòu)成的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸的總殘基數(shù)相對(duì)于氨基酸殘基數(shù)整體為40%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人造多肽纖維，其中，所述多肽是C末端序列為序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列或與序列編號(hào)I?3中的任一個(gè)所示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的韌性為170MJ/m3 以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的韌性為240MJ/m3 以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的應(yīng)力為590MPa 以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的斷裂伸長(zhǎng)率為26%以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的初始彈性模量為8GPa以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維直徑的波動(dòng)率為5%以下。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維，其中，所述纖維的直徑為5?100 μ m的范圍。
11.一種人造多肽纖維的制造方法，其特征在于，所述人造多肽纖維是通過將含有天然型蛛絲蛋白來源的多肽的紡絲液紡絲、并進(jìn)行至少兩階段的拉伸而得到的；其中，所述至少兩階段的拉伸包括濕熱下的第一階段拉伸和干熱下的第二階段拉伸。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的人造多肽纖維的制造方法，其中，所述第一階段拉伸的拉伸條件為在70?90°C的溫水中拉伸至2?8倍。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的人造多肽纖維的制造方法，其中，所述第二階段拉伸的拉伸條件為在170?230°C的氣氛溫度下拉伸至1.25?3倍。
14.根據(jù)權(quán)利要求10?13中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維的制造方法，其中，所述紡絲為將含有所述多肽的紡絲液擠出到凝固液中制成未拉伸絲，并在所述凝固液中進(jìn)行第一階段拉伸。
15.根據(jù)權(quán)利要求11?14中任一項(xiàng)所述的人造多肽纖維的制造方法，其中，所述纖維的總拉伸倍率超過5倍且在20倍以下。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK103502516SQ201280021898
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月1日
【發(fā)明者】關(guān)山和秀, 關(guān)山香里, 石川瑞季, 佐藤?zèng)鎏? 村田真也 申請(qǐng)人:絲芭博株式會(huì)社