專利名稱：一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角質(zhì)酶是一種多功能酶，屬于絲氨酸酯酶的一種，既可水解長鏈、短鏈脂肪酸酯、 乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯，還能參與酯化、轉(zhuǎn)酯化等，由于角質(zhì)酶的特殊結(jié)構(gòu)，還 可以水解角質(zhì)。因此其在紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及生物催化、化工工業(yè)等諸多領(lǐng)域有著廣泛 的應(yīng)用前景。角質(zhì)酶的發(fā)酵工藝研究主要集中在野生菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化以及對重組真菌 角質(zhì)酶采用不同的基因工程宿主細(xì)胞(如釀酒酵母、大腸桿菌和曲霉屬)進(jìn)行高效表達(dá)，優(yōu) 化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本等方面。但由于酵母培養(yǎng)成本高、生長周期長的缺點(diǎn)，以及/^ solani pisi角質(zhì)酶重組菌穩(wěn)定性差的問題，至今未有角質(zhì)酶工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室陳晟等(ChenS, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008, 283 (28)25854-25862)報(bào)道的 力i/ii/a角質(zhì) 酶熱穩(wěn)定性好，PH穩(wěn)定范圍寬，最適作用溫度60°C，最適作用pH 8. 0，符合紡織用角質(zhì)酶應(yīng) 用要求。在此基礎(chǔ)上通過發(fā)酵優(yōu)化，3L罐發(fā)酵30h，酶活達(dá)500U/mL (吳敬，吳丹，張瑤，陳 堅(jiān)，陳晟，一種重組角質(zhì)酶的發(fā)酵工藝，中國專利，申請?zhí)?00910259651. 1)。但是存在兩點(diǎn) 不足在復(fù)合培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)料，成份復(fù)雜，不便于發(fā)酵調(diào)控；采用II型分泌途徑， 兩步跨越大腸桿菌內(nèi)外膜，轉(zhuǎn)運(yùn)效率較低，發(fā)酵過程中通過加入一定量的甘氨酸改變細(xì)胞 壁通透性來增加胞外分泌水平，這就增加了發(fā)酵生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌。所述基因工程菌是通過構(gòu)建重組質(zhì)粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并轉(zhuǎn)化大 腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)，得到重組大腸桿菌 Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21(DE3)。所述產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌的構(gòu)建方法如下
1)以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的Tfu_0883/pET20b (+)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增角質(zhì)酶Tfu_0883基
因；
2)以五coliCFT073總DNA為模版擴(kuò)增hlyAs的基因(中國專利申請 200910260984. 6)；
3)以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，PCR擴(kuò)增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；
4)pET20b(+)和Tfu_0883-hlyAs進(jìn)行雙酶切，割膠產(chǎn)物回收轉(zhuǎn)化五co7iJM109感受態(tài) 細(xì)胞，得到質(zhì)粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；5)重組質(zhì)粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌五coli BL21 (DE3)，得到大腸 桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。所述Tfu_0883/ pET20b (+)來源(Chen S, Tong X，Woodard Rff, Du GC, Wu J, Chen J, Identification and Characterization of Bacterial Cutinase, The Journal of Biological Chemistry, 2008，283 (28) 25854-25862)
所述質(zhì)粒 pET20b(+)、菌株五 coli BL21(DE3)購自 Novagen 公司，五 coli CFT073 (ATCC 700928)，購于 ATCC。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供一種上述產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì) 酶的方法。為解決上述問題，具體生產(chǎn)方法如下
1)發(fā)酵過程溫度維持在36_38°c，通過增減攪拌轉(zhuǎn)速或通入富氧空氣使溶解氧維持 20-40 %，通過補(bǔ)加氨水控制生長階段pH 7. 0-7. 2、誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段pH 6. 4-6. 6 ；
2)發(fā)酵5-6h或溶解氧濃度升至〉70%時(shí)，以初始3. 5-5. O mL ·廠1 · IT1的流速補(bǔ) 加500g/L的甘油，以后通過指數(shù)補(bǔ)料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 22 之間；
3)發(fā)酵12-13h或OD600達(dá)到25-35時(shí)，加入終濃度0. 02-0. 04 mM/L IPTG進(jìn)行誘 導(dǎo)，同時(shí)以8-10 mL .L-1 .h—1的速度補(bǔ)加50g/L的乳糖，停止補(bǔ)加氨水，待pH降至6. 4-6. 6 后通過補(bǔ)加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)發(fā)酵15-17h或誘導(dǎo)3-4 h，甘油流速恒定，約為25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)發(fā)酵19-21h或OD6tltlF再增加時(shí)，將乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h內(nèi)逐步下降至步驟4)流速的一半。所述種子培養(yǎng)條件為將_80°C包藏的菌種接入種子培養(yǎng)基，初始pH7. 0-7. 2，回轉(zhuǎn) 恒溫?fù)u床37°C、200 rpm培養(yǎng)7-8 h ；種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素濃度為100mg/L。所述發(fā)酵過程接種量4%_8%。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨lg/L、酵母粉2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L,KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨芐青霉素濃 度為100mg/L ；發(fā)酵過程接種量4%-8%。所述微量元素液組成為=HCl5M/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/BL21 (DE3)搖瓶 培養(yǎng)60小時(shí)，角質(zhì)酶產(chǎn)量達(dá)到274 U/mL;采用本發(fā)明提供的發(fā)酵方法，培養(yǎng)30-34 h，酶活 達(dá)到700-750 U/mL，本發(fā)明還具有發(fā)酵培養(yǎng)基價(jià)格低廉，菌種易于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，適合在角質(zhì) 酶的工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說明目的而非用于限制本 發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進(jìn)行操作。菌株和質(zhì)粒質(zhì)粒pET20b(+)，菌株五 coli BL21(DE3),^. coli CFT073、 Ε. co7iJM109o材料和方法所用限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，pMD18-T simple載體，PCR試劑， DNA Marker等均購于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞萬.co/iJM109，引物，質(zhì)粒提 取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購于上海生工生物工程公司；電轉(zhuǎn)儀購自Bio-Rad公司。實(shí)施例1 :Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)構(gòu)建 根據(jù)角質(zhì)酶、hlyAs的基因設(shè)計(jì)引物兩對引物Pl、P2和P3、P4。Pl :5’ -GTAATCCATATGGCCAACCCCTACGAGCGC-3’ P2 :5’ - GACTTCCATAGGCTAAGAACGGGCAGGTGGAG - 3’ P3 :5’ - CTCCACCTGCCCGTTCTTAGCCTATGGAAGTC - 3’ P4 :5’ - CCGCTCGAGTTATGCTGATGCTGTCAAAG - 3’
以質(zhì)粒Tfu_0883/ pET20b(+)DNA為模板，以PI、P2為引物，PCR擴(kuò)增角質(zhì)酶的基因 Tfu_0883。以五coli CFT073總DNA為模版，以P3、P4為引物，PCR擴(kuò)增hlyAs的基因。PCR反應(yīng)在50 μ L體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為94°C變性Imin后開始循環(huán)，然后94°C 變性30s，60°C退火30s，72°C分別延伸Imin和20s，共30個(gè)循環(huán)后，再于72°C延伸IOmin0 分別擴(kuò)增得到783 bp和180 bp的PCR片段，割膠回收。然后再以Tfu_0883和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，以PI、P4為引物，再 進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增得到96;3bp的PCR片段，割膠回收，回收片段與pMD18_T simple載體 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨芐青霉素的LB固體平板， 經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選單克隆，接入含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm 培養(yǎng)8-10 h后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明此基因全長963個(gè)核苷酸，和 Tfu_0883及hlyAs基因的序列均完全相同。將pET20b (+)質(zhì)粒和Tfu_0883-hlyAs基因進(jìn)行Nde I和Β ο I雙酶切，酶切產(chǎn)物 割膠回收后，再用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五coliMim感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨芐青霉素的LB固體平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的Tfu_0883-hlyAs/ pET20b (+)質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒Tfu_0883_hlyAs/pET20b (+)轉(zhuǎn)化萬.coli BL21 (DE3) 宿主菌，在含氨芐青霉素(100 mg/L) LB平板上經(jīng)37 °C培養(yǎng)8-10h，挑選轉(zhuǎn)化子 (Tfu_0883-hlyAs-pET20b(+)/ Ε. coli BL21 (DE3))。實(shí)施例2 大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)搖瓶發(fā)酵 菌株大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。種子培養(yǎng)將-80°C包藏的菌種接入種子培養(yǎng)基，初始pH7. 0-7. 2，回轉(zhuǎn)恒溫?fù)u床 37200 rpm培養(yǎng)7-8 h。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 芐青霉素濃度為100mg/L。發(fā)酵產(chǎn)酶發(fā)酵接種量5% ；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏 24g/L, K2HPO4 12. 54g/L，KH2PO4 2. 31g/L ； 37°C培養(yǎng) 2 h 后加入終濃度 0. 4 mM IPTG 誘導(dǎo)， 降溫至25°C培養(yǎng)，60 h產(chǎn)酶達(dá)274 U/mL。
實(shí)施例3 大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/五 coli BL21 (DE3)發(fā)酵工藝 菌株大腸桿菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+) /E. coli BL21 (DE3)。種子培養(yǎng)將-80°C包藏的菌種接入種子培養(yǎng)基，初始pH7. 0-7. 2，回轉(zhuǎn)恒溫?fù)u床 37200 rpm培養(yǎng)7-8 h。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨 芐青霉素濃度為100mg/L。發(fā)酵接種量4%_8%。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨lg/L、酵母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/ L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸0. 85 g/L，甘油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨芐青霉素濃度 為 100mg/L ；微量元素液組成為=HCl 5M/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. O g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. O g/ L，(NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。1)發(fā)酵過程溫度維持在36_38°C，通過增減攪拌轉(zhuǎn)速或通入富氧空氣使溶解氧維 持20-40 %，通過補(bǔ)加氨水控制生長階段pH 7. 0-7. 2、誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段pH 6. 4-6. 6 ；
2)發(fā)酵5-6h或溶解氧濃度升至〉70%時(shí)，以初始3. 5-5. O mL · L—1 · IT1的流速補(bǔ)加 500g/L的甘油，以后通過指數(shù)補(bǔ)料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 22 之 間；
3)發(fā)酵12-13h或OD6c 達(dá)到25-35時(shí)，加入終濃度0.02-0. 04 mM/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)， 同時(shí)以8-10 mL · L-1 · h-1的速度補(bǔ)加50g/L的乳糖，停止補(bǔ)加氨水，待pH降至6. 4-6. 6后 通過補(bǔ)加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；
4)發(fā)酵15-17h或誘導(dǎo)3-4 h，甘油流速恒定，為25-35 mL · L-1 · h-1 ；
5)發(fā)酵19-21h或OD6tltlF再增加時(shí)，將乳糖流速降至2-4 mL · L—1 · h—1，甘油流速6_8 h內(nèi)逐步下降至步驟4)流速的一半。發(fā)酵30-34 h，酶活達(dá)到 700-750 U/mL。序列表 <110>江南大學(xué)
<120> 一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌及其應(yīng)用 <160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 <400> 1
gtaatccata tggccaaccc ctacgagcgc <210> 2 <211> 32 <212> DNA
30<213>人工合成序列 <220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 <400> 2
gacttccata ggctaagaac gggcaggtgg ag32
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 <400> 3
ctccacctgc ccgttcttag cctatggaag tc32
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增 <400> 4
ccgctcgagt tatgctgatg ctgtcaaag29
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌，是將角質(zhì)酶Tfu_0883基因和hlyAs基因?qū)氪竽c桿菌。
2.一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌是攜帶重組質(zhì)粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)的大腸桿菌五 coli BL21 (DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，具體構(gòu)建方法如下 以質(zhì)粒Tfu_0883 /pET20b (+)為模板擴(kuò)增角質(zhì)酶Tfu_0883基因；以五coli CFT073總DNA為模版擴(kuò)增hlyAs的基因；以Tfu_0883基因和hlyAs基因PCR割膠回收片斷為模板，PCR擴(kuò)增得到 Tfu_0883-hlyAs 基因；pET20b (+)和Tfu_0883-hlyAs進(jìn)行雙酶切，割膠產(chǎn)物回收轉(zhuǎn)化五coliJM109感受態(tài)細(xì) 胞，構(gòu)建質(zhì)粒 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)；重組質(zhì)粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌五coli BL21 (DE3)，得到大腸桿 菌 Tfu_0883-hlyAs/pET20b (+)/E. coli BL21 (DE3)。
4.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)角質(zhì)酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵過程溫度維持在36-38°C，通過增減攪拌轉(zhuǎn)速或通入富氧空氣使溶解氧維持20-40 %，通過補(bǔ)加氨水控制生長階段PH 7. 0-7. 2、誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段pH 6. 4-6. 6 ；發(fā)酵5-6 h或溶解氧濃度升至〉70%時(shí)，以初始3. 5-5. 0 mL .L—1 .h—1的流速補(bǔ)加500g/ L的甘油，以后通過指數(shù)補(bǔ)料方式流加甘油控制菌體比生長速率在0. 15-0. 3 h—1之間；發(fā)酵12-13 h或OD600達(dá)到25-35時(shí)，加入終濃度0. 02-0. 04 mM/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同 時(shí)以8-10 mL · L-1 · h-1的速度補(bǔ)加50g/L的乳糖，停止補(bǔ)加氨水，待pH降至6. 4-6. 6后通 過補(bǔ)加氨水控制PH 6. 4-6. 6 ；發(fā)酵15-17 h或誘導(dǎo)3-4 h，甘油流速恒定，25-35 mL · L-1 · h-1 ； 發(fā)酵19-21 h或OD6tltlF再增加時(shí)，將乳糖流速降至2-4 mL·!^·!!—1，甘油流速6-8 h 內(nèi)逐步下降至步驟4)流速的一半。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，酵 母粉5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素濃度為100mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨lg/L、酵 母粉 2g/L、(NH4)2HPO4 4 g/L，KH2PO4 13. 5 g/L，MgSO4 · 7H20 4. lg/L，檸檬酸 0. 85 g/L，甘 油8g/L，微量元素液5 mL/L，氨芐青霉素濃度為100mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述其特征在于微量元素液組成為HC1 5M/L, FeSO4 · 7H20 10 g/L, ZnSO4 · 7H20 2. 25 g/L, CuSO4 · 5H20 1. 0 g/L, MnSO4 · 4H20 0. 5 g/L, Na2B4O7 · IOH2O 0. 23 g/L, CaCl2 · 2H20 2. 0 g/L, (NH4)6Mo7O24 0. 1 g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)角質(zhì)酶基因工程菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。構(gòu)建重組質(zhì)粒Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，得到重組大腸桿菌Tfu_0883-hlyAs/pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方式控制一定的比生長速率，發(fā)酵培養(yǎng)30-34h，發(fā)酵上清酶活達(dá)到700-750U/mL。本發(fā)明以甘油為主要原料，采用半合成培養(yǎng)基，具有穩(wěn)定性好，便于調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/21GK102080063SQ20101057892
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者吳丹, 吳敬, 王蕾, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)